谷春艷,　張愛芳,　楊　雪,　嚴(yán)丹侃,　陳　雨,　王學(xué)峰

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所, 合肥　230031)

?

水稻稻瘟病拮抗細(xì)菌WH1G的篩選鑒定及其抑菌活性

谷春艷,張愛芳,楊雪,嚴(yán)丹侃,陳雨,王學(xué)峰*

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所, 合肥230031)

采用平板對(duì)峙法,從安徽水稻根際土壤樣品中篩選對(duì)稻瘟病菌具有較強(qiáng)抑菌活性的拮抗細(xì)菌,通過菌落形態(tài)觀察、生理生化特征、gyrB基因序列分析對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定,測(cè)定抑菌譜,對(duì)其抑菌機(jī)制進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明,拮抗菌株WH1G對(duì)稻瘟病菌具有較強(qiáng)的抑制作用,抑制率達(dá)91.79%,經(jīng)鑒定為解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。該菌可產(chǎn)生蛋白酶和纖維素酶,不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶;用代謝產(chǎn)物無菌濾液處理稻瘟病菌,可造成孢子萌發(fā)率降低,菌絲扭曲異常、分支明顯減少并產(chǎn)生大量泡囊。該菌對(duì)常見的20種植物病原真菌及細(xì)菌均具有不同程度的拮抗作用,表現(xiàn)出廣譜抗菌活性。

稻瘟病菌;解淀粉芽胞桿菌;鑒定;抑菌活性

稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的一種真菌性病害,是世界性稻作病害,是影響水稻高產(chǎn)最嚴(yán)重的威脅之一,全球每年因稻瘟病造成的水稻產(chǎn)量損失達(dá)11%～30%[1-2],因此稻瘟病的防治成為水稻生產(chǎn)中的重要問題。

目前,稻瘟病的防治主要是采用栽培水稻抗瘟性品種和利用化學(xué)農(nóng)藥防治,但因抗病品種的單一化、化學(xué)農(nóng)藥的危害以及病原菌抗藥性的產(chǎn)生,使水稻稻瘟病的防治受到一定的限制[3-4]。因此,生物防治越來越受到人們的關(guān)注。張芬等[5]從水稻根際土壤分離獲得對(duì)稻瘟病具有高效抑菌活性的枯草芽胞桿菌T429(BacillussubtilisT429)和伯克霍爾德菌屬真菌T392(Burkholderiasp. T392);劉詩(shī)胤等[6]分離獲得對(duì)稻瘟菌具有一定防效的枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、短小芽胞桿菌(B.pumilus)和鏈霉菌(Streptomycessp.);溫小紅等[7]、周華強(qiáng)等[8]、Kuo等[9]、Tendulkas等[10]分別獲得對(duì)稻瘟病有一定防效的假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)、多黏類芽胞桿菌(Paenibacilluspolymyxa)、綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)。

解淀粉芽胞桿菌是一種與枯草芽胞桿菌親緣性很高的細(xì)菌,在自然界中分布廣泛,其生長(zhǎng)過程中可以產(chǎn)生一系列具有廣泛抑制真菌和細(xì)菌活性的代謝產(chǎn)物[11], 因此,在生物防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景,已逐步成為具有生物農(nóng)藥開發(fā)潛力的微生物。目前已有報(bào)道利用解淀粉芽胞桿菌防治水稻紋枯病、水稻細(xì)菌性條斑病、水稻惡苗病的研究[12-15],但是利用解淀粉芽胞桿菌防治水稻稻瘟病菌的研究國(guó)內(nèi)外還未有報(bào)道。

本研究從水稻根際土壤中分離篩選出1株對(duì)水稻稻瘟病具有強(qiáng)烈抑制作用的拮抗菌株WH1G,通過形態(tài)觀察、生理生化特征、gyrB基因序列分析對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定,測(cè)定了其抑菌譜,并進(jìn)行了胞外酶活性檢測(cè),研究了其代謝產(chǎn)物對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的影響,對(duì)其抑菌機(jī)制進(jìn)行初步研究,這將為開發(fā)、研制相應(yīng)的生防菌劑奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1供試菌株

拮抗菌株WH1G為本研究小組從安徽省水稻根際土壤中分離篩選得到;供試水稻稻瘟病菌及用于抑菌譜測(cè)定的其他常見的植物病原真菌和細(xì)菌(表1，表2)均由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所分離和保藏。

1.2培養(yǎng)基

拮抗細(xì)菌分離、培養(yǎng)及供試細(xì)菌培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為改良的NA培養(yǎng)基(牛肉浸膏 1.0 g,蛋白胨5.0 g,酵母膏5.0 g,NaCl 5.0 g,蔗糖10.0 g,瓊脂20.0 g,蒸餾水1 000 mL,pH 6.8～7.0),病原真菌培養(yǎng)及拮抗譜測(cè)定采用PDA培養(yǎng)基,胞外酶活力測(cè)定采用選擇性培養(yǎng)基[16-18]。

1.3拮抗細(xì)菌的分離、純化及篩選

1.3.1拮抗細(xì)菌的分離、純化

在水稻生長(zhǎng)季節(jié),從安徽省水稻田采集水稻根際土壤,采用5點(diǎn)法采樣,每點(diǎn)各收集土樣200 g,裝入無菌保鮮袋,記錄編號(hào),保存?zhèn)溆谩?/p>

拮抗細(xì)菌分離采用平板稀釋法[19],稱取土樣10 g,放入100 mL無菌水中,搖床上振蕩30 min,靜置至澄清。用無菌槍頭吸取上清液100 μL加入900 μL無菌水中,用無菌水依次稀釋制備10-4、10-5、10-6、10-7和10-8土壤稀釋液,各吸取稀釋液100 μL 涂布于改良的NA分離培養(yǎng)基平板上,28℃恒溫培養(yǎng)48 h,挑取形態(tài)、顏色等培養(yǎng)性狀不同的細(xì)菌單菌落畫線培養(yǎng)、純化并保存。

1.3.2拮抗細(xì)菌的篩選

采用平板對(duì)峙法[20]測(cè)定分離的細(xì)菌對(duì)水稻稻瘟病菌的抑制活性。取新鮮的稻瘟病菌5 mm菌餅接于PDA培養(yǎng)基平板中央,在距離中心3 cm處呈對(duì)角線放置3個(gè)直徑5 mm的濾紙片,每個(gè)濾紙片接種2 μL的待測(cè)細(xì)菌菌懸液,設(shè)無拮抗細(xì)菌處理為對(duì)照,每處理重復(fù)3次,置于28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng),及時(shí)觀察、記錄抑菌現(xiàn)象,測(cè)量菌落直徑,計(jì)算抑制率,抑制率(%)=(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對(duì)照組菌落直徑-原菌碟直徑)×100。挑選抑菌圈直徑大,抑制率高,且拮抗作用持久的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

將初篩的拮抗菌株分別接種于5 mL改良的NA液體培養(yǎng)基,置28℃搖床180 r/min培養(yǎng)36 h后,10 000 r/min離心10 min,取上清用0.45 μm細(xì)菌過濾器過濾,得到代謝產(chǎn)物的無菌濾液。將代謝產(chǎn)物與PDA培養(yǎng)基混合后倒平板,然后在平板中央接種5 mm稻瘟病菌菌碟,以不加代謝產(chǎn)物的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照,28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)5 d,用十字交叉法測(cè)量病原菌菌落直徑,計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

1.4拮抗細(xì)菌的抑菌譜測(cè)定

采用對(duì)峙培養(yǎng)法和濾紙片擴(kuò)散法對(duì)常見的19種病原真菌及細(xì)菌進(jìn)行抑菌譜測(cè)定。(1)對(duì)12種病原真菌的抑菌活性測(cè)定:采用平板對(duì)峙法,測(cè)量菌落直徑,計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率,方法同1.3.2;(2)對(duì)7種病原細(xì)菌的抑菌活性測(cè)定:分別將7種病原細(xì)菌接入改良的NA培養(yǎng)基中,置于180 r/min、28℃搖床內(nèi)培養(yǎng)36 h,按1‰的體積比混入改良的NA固體培養(yǎng)基中倒平板,對(duì)峙三點(diǎn)放入5 mm無菌濾紙片,吸取2 μL拮抗細(xì)菌發(fā)酵液于濾紙片上,置于28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每處理重復(fù)3次,待病原菌長(zhǎng)滿平板時(shí),測(cè)量抑菌帶寬度。

1.5拮抗細(xì)菌的鑒定

1.5.1培養(yǎng)性狀的觀察

將篩選出的拮抗細(xì)菌接種于改良的NA平板上28℃恒溫培養(yǎng),觀察其菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地等。

1.5.2拮抗細(xì)菌的生理生化測(cè)定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[21]進(jìn)行,測(cè)定的生理生化指標(biāo)見表2。

1.5.3gyrB基因序列分析鑒定

采用常規(guī)方法提取拮抗菌株的基因組DNA[22]。gyrB基因擴(kuò)增引物為:UP1 (5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′);UP2r(5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCN-ACRTCNGCRTCNGTAT-3′)[23]。PCR擴(kuò)增條件:96℃預(yù)變性5 min;96℃變性1 min,62℃退火 1 min,72℃延伸 1.5 min,35 個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳、膠回收后送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),選擇與測(cè)序結(jié)果同源性較高的序列,運(yùn)用軟件 Clustalx和 MEGA 6.0,采用最大似然法 (maximum likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,并上傳基因序列。

1.6菌株胞外酶活性檢測(cè)

測(cè)定與拮抗作用相關(guān)的4種胞外酶(蛋白酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶)的活性。分別在4種檢測(cè)培養(yǎng)基平板上距中心等距離處均勻放置3個(gè)5 mm的濾紙片,每個(gè)濾紙片滴入2 μL新鮮的拮抗細(xì)菌菌液,每個(gè)處理重復(fù)3次。接菌后,28℃恒溫培養(yǎng)48 h左右,檢測(cè)相應(yīng)的胞外酶活性[24]。觀察酶解圈的有無和大小,并作進(jìn)一步分析。

1.7拮抗細(xì)菌代謝產(chǎn)物對(duì)稻瘟病菌及其孢子的拮抗活性測(cè)定

1.7.1拮抗細(xì)菌代謝產(chǎn)物對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

參照1.3.2的方法,制取菌株WH1G代謝產(chǎn)物無菌濾液。將代謝產(chǎn)物無菌濾液分別按照1%、2%、5%、10%、20%的體積比與PDA培養(yǎng)基混合后制成平板,在混合平板中央放置5 mm新鮮的稻瘟病菌菌絲塊,每處理重復(fù)3次,設(shè)NA培養(yǎng)基處理為空白對(duì)照,28℃培養(yǎng)5 d,用十字交叉法測(cè)量不同體積比平板上生長(zhǎng)的稻瘟病菌菌落直徑,計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率,并在顯微鏡下觀察不同處理的稻瘟病菌邊緣菌絲的生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.7.2拮抗細(xì)菌代謝產(chǎn)物對(duì)稻瘟病菌孢子萌發(fā)的影響

將新鮮的稻瘟病菌菌絲塊在PDA平板上培養(yǎng)6 d后,接種到酵母淀粉斜面培養(yǎng)基上(水溶性淀粉10 g/L,酵母浸膏2 g/L,瓊脂20 g/L),待菌絲長(zhǎng)滿后,加入1.5 mL滅菌水并輕輕地刮菌絲,后移取100 μL菌絲液到盛有燕麥片培養(yǎng)基(燕麥片50 g/L,蔗糖20 g/L,瓊脂20 g/L,pH 6.0～6.5)平板上,涂布均勻后放置在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待平板上菌絲長(zhǎng)滿后(約7 d),在無菌條件下刮除平板上菌絲,將平板置于室內(nèi)培養(yǎng)架上24 h光照培養(yǎng),室溫25～28℃。等到充分產(chǎn)孢(約3～4 d)后,每皿用5 mL蒸餾水洗下孢子[25],然后用滅菌的擦鏡紙過濾后制成孢子液。將孢子懸浮液分別于拮抗細(xì)菌代謝產(chǎn)物按照5%、10%、20%、50%的體積比混合,每個(gè)處理重復(fù)3次,設(shè)置無菌水與孢子懸浮液混合為對(duì)照,于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后鏡檢孢子萌發(fā)情況[26],統(tǒng)計(jì)各處理的孢子萌發(fā)率,計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率(%)=(對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率)/對(duì)照孢子萌發(fā)率×100。

2　結(jié)果與分析

2.1拮抗細(xì)菌的篩選與抑菌譜測(cè)定

2.1.1拮抗細(xì)菌WH1G的篩選

從安徽省水稻根際土壤中分離到516株細(xì)菌菌株。采用室內(nèi)平板對(duì)峙生長(zhǎng)法,測(cè)定了上述細(xì)菌菌株對(duì)稻瘟病菌的拮抗作用。結(jié)果顯示(圖1～2),有3株生防細(xì)菌(WH5G、YS-1、WH1G)對(duì)稻瘟病菌具有明顯的抑菌效果,其菌絲生長(zhǎng)抑制率均在80%以上,其中,菌株WH1G(CGMCC No.10722)平板拮抗活性最強(qiáng),對(duì)稻瘟病菌抑制效果最為明顯,幾乎完全抑制了稻瘟病菌的生長(zhǎng),WH1G菌液對(duì)稻瘟病菌菌絲的抑制率達(dá)到91.79%,其代謝產(chǎn)物無菌濾液對(duì)稻瘟病菌的抑制率可達(dá)80.46%,故選擇此菌株用于進(jìn)一步研究。

2.1.2拮抗細(xì)菌WH1G的抑菌譜測(cè)定

菌株WH1G對(duì)供試的其他常見的12種病原真菌(表1)、7種病原細(xì)菌(表2)的抑菌活性測(cè)定結(jié)果表明,WH1G的抑菌譜較廣,對(duì)這19種供試主要作物病原菌均具有不同程度的抑菌效果。其中對(duì)西瓜蔓枯病菌的抑制率達(dá)90%以上;對(duì)油菜菌核病菌、枇杷灰斑病菌、梨輪紋病菌、石榴干腐病菌抑制率達(dá)到80%以上;對(duì)黃瓜枯萎病菌、水稻惡苗病菌抑制率達(dá)到70%以上。此外,對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病菌、水稻白葉枯病菌、青枯雷爾氏菌等病原細(xì)菌均具有明顯的抑制效果。

圖1　3株拮抗細(xì)菌對(duì)稻瘟病菌的抑菌活性Fig.1　The antimicrobial activity of the three strains against Magnaporthe oryzae

圖2　3株拮抗細(xì)菌對(duì)稻瘟病菌的抑制率Fig.2　Inhibition rates of the three strains against Magnaporthe oryzae

2.2拮抗細(xì)菌WH1G的鑒定

2.2.1培養(yǎng)性狀的觀察

WHIG在改良的NA固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng),培養(yǎng)初期菌落乳白色,邊緣整齊,圓形隆起,表面光滑濕潤(rùn);培養(yǎng)后期菌落呈奶白色,邊緣不整齊,不透明,表面干燥呈皺褶狀突起。

2.2.2生理生化特征測(cè)定

參照芽胞桿菌鑒定表中規(guī)定的相關(guān)測(cè)定項(xiàng)目[21],對(duì)菌株WH1G進(jìn)行了生理生化主要指標(biāo)測(cè)定。由表3可以初步鑒定WH1G為解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)或枯草芽胞桿菌(B.subtilis)。

表1　WH1G對(duì)12種植物病原真菌生長(zhǎng)的抑菌效果

2.2.3WH1G菌株的分子鑒定

本研究以WH1G菌株的基因組DNA為模板,擴(kuò)增gyrB基因片段,得到序列長(zhǎng)度約為1 200 bp的序列(登錄號(hào)為KP143083),與芽胞桿菌gyrB基因的理論值基本相符。將測(cè)序結(jié)果在NCBI中通過BLAST比對(duì),運(yùn)用MEGA 6.0軟件,根據(jù)Kimura 2-parameter 模型,采用最大似然法 (maximum likelihood) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3),系統(tǒng)發(fā)育樹各分支的置信度(Bootstrap) 進(jìn)行1 000 次的重復(fù)檢驗(yàn)。結(jié)果顯示,WH1G菌株與解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)在同一分支上,因此,將WH1G鑒定為解淀粉芽胞桿菌(B.myloliquefaciens)[28]。

表2　WH1G對(duì)7種植物病原細(xì)菌生長(zhǎng)的抑菌效果1)

1) 抑菌帶寬指拮抗菌的菌落邊緣到病原菌的距離。

Width of antibacterial belt indicates distance between antagonist colony and pathogen.

2.3WH1G菌株胞外酶活性檢測(cè)

將細(xì)菌發(fā)酵液接種在4種胞外酶檢測(cè)培養(yǎng)基上,2 d后進(jìn)行活性檢測(cè),結(jié)果(圖4)顯示,拮抗菌WH1G可以分泌蛋白酶和纖維素酶,在這兩種檢測(cè)培養(yǎng)基中能夠產(chǎn)生較大的酶解圈,其直徑分別約為16 mm和14 mm,說明WH1G菌株產(chǎn)生的纖維素酶和蛋白酶活性較高。但是WH1G在幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶檢測(cè)培養(yǎng)基上無透明圈產(chǎn)生,表明WH1G不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶。

表3　拮抗菌WH1G的生理生化特征1)

1) +:陽(yáng)性或能夠利用;-:陰性或不能利用。

+:Positive or usable;-:Negative or unusable.

圖3　基于gyrB基因序列BLAST結(jié)果構(gòu)建的菌株WH1G的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3　Phylogenetic tree of WH1G and related strains based on gyrB gene sequences

圖4　WH1G菌株胞外酶活性檢測(cè)Fig.4　Detection of the extracellular enzyme activity of strain WH1G

2.4WH1G菌株代謝產(chǎn)物對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的影響

2.4.1代謝產(chǎn)物對(duì)稻瘟病菌及菌絲生長(zhǎng)的影響

將拮抗菌代謝產(chǎn)物的無菌濾液按不同體積比加入PDA培養(yǎng)基,5 d后檢測(cè)稻瘟病菌生長(zhǎng)情況,結(jié)果表明,拮抗菌WH1G的代謝產(chǎn)物對(duì)稻瘟病菌的抑菌活性較高,并且隨著代謝產(chǎn)物體積分?jǐn)?shù)的不斷增大,對(duì)稻瘟病菌的抑制率也相應(yīng)地提高,當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí),可顯著抑制稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng),菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)88.44%(表4);鏡檢結(jié)果顯示,與對(duì)照菌落相比,稻瘟病菌菌落邊緣菌絲分支減少、萎縮,彎曲生長(zhǎng),菌絲細(xì)胞膨大、畸變,形成泡囊狀結(jié)構(gòu)(圖5a～l)。

圖5　不同體積分?jǐn)?shù)的WH1G代謝產(chǎn)物對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Fig.5　Inhibition of different concentrations of filtrates on pathogen growth

代謝產(chǎn)物體積/%Filtrateconcentration菌落平均直徑/cmDiameterofthecolony抑制率/%Inhibitionrate0(CK)4.91±0.120dD13.29±0.0336.73cC23.18±0.0339.23cC51.79±0.0270.75bB101.13±0.0485.71aA201.01±0.0288.44aA

1) 同列數(shù)據(jù)后不同的小、大寫字母分別表示在P<0.05和P<0.01水平差異顯著。下同。

The different lowercase and capital letters in the same column indicate significant difference at 0.05 and 0.01 levels. The same below.

2.4.2代謝產(chǎn)物對(duì)稻瘟病菌孢子萌發(fā)的影響

將稻瘟病菌孢子懸浮液與不同體積比的拮抗菌WH1G代謝產(chǎn)物混合培養(yǎng)24 h后鏡檢(10×40),結(jié)果如表5所示,對(duì)照孢子萌發(fā)率達(dá)到90%,而隨著代謝產(chǎn)物體積分?jǐn)?shù)的增加,稻瘟病菌孢子萌發(fā)率逐漸降低,對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率逐漸增大。當(dāng)代謝產(chǎn)物體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí),可顯著抑制稻瘟病菌孢子萌發(fā),對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)到80.38%。

3　結(jié)論與討論

目前篩選和利用拮抗細(xì)菌防治稻瘟病的研究,國(guó)內(nèi)外已有不少報(bào)道[5-10],但是利用解淀粉芽胞桿菌防治稻瘟病的研究,國(guó)內(nèi)外未見有報(bào)道。本研究從安徽水稻根際土壤中分離篩選出1株對(duì)水稻稻瘟病菌具有顯著抑菌活性的生防菌株WH1G,該菌株在離體條件下,幾乎完全抑制了稻瘟病菌的生長(zhǎng),WH1G發(fā)酵液對(duì)稻瘟病菌的抑制率達(dá)到91.79%,其代謝產(chǎn)物無菌濾液對(duì)稻瘟病菌的抑制率可達(dá)80.46%。而目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的拮抗細(xì)菌對(duì)稻瘟病菌的抑制率較低,最高為88.93%[5-7,10],與以上結(jié)果相比,菌株WH1G對(duì)稻瘟病菌的抑制作用較好,具有很大的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。

表5　WH1G代謝產(chǎn)物對(duì)稻瘟病菌孢子萌發(fā)率的影響

解淀粉芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌表型相似,很難區(qū)分,僅從同源性上很難精確確定它的分類地位。目前已有多種基因如gyrA[27]、gyrB[28]、ropD基因[29]等用于枯草芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌的分類研究,如Wang等[28]通過以gyrB序列為靶標(biāo),能從種水平上區(qū)分枯草芽胞桿菌及其近緣種。本文除了形態(tài)觀察和生理生化方面的測(cè)試,在分子水平利用gyrB基因序列分析進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明WH1G為解淀粉芽胞桿菌,這為其他細(xì)菌的快速鑒定提供了一種方法。

拮抗細(xì)菌對(duì)病原真菌的作用方式主要是抑制病原真菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)[3,8],以及誘發(fā)病菌菌絲膨大,頂端畸形[30],這在本研究中已得到證實(shí)。本研究通過檢測(cè)胞外酶活性,用代謝產(chǎn)物無菌濾液處理稻瘟病菌菌絲和孢子,對(duì)解淀粉芽胞桿菌WH1G的作用機(jī)理有了初步的認(rèn)識(shí)。結(jié)果表明:菌株WH1G對(duì)病原真菌的抑菌機(jī)制與已有報(bào)道基本一致。因此我們推斷解淀粉芽胞桿菌對(duì)植物病原菌的抑制作用不是通過產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶溶解真菌細(xì)胞壁來實(shí)現(xiàn)的,而是主要依賴于其生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的某種或多種代謝產(chǎn)物即抗菌物質(zhì),抑制病原真菌孢子萌發(fā),降低孢子萌發(fā)率,使菌絲畸形、細(xì)胞膨大崩解、內(nèi)含物外泄,從而達(dá)到抑制病原真菌的目的。但是解淀粉芽胞桿菌所產(chǎn)生的纖維素酶和蛋白酶是否對(duì)病原菌有抑制作用,以及在其中發(fā)揮了多大的作用,還需進(jìn)一步研究。

通過平板拮抗試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),以稻瘟病菌為靶標(biāo)篩選的解淀粉芽胞桿菌WH1G具有廣譜的抑菌活性,不僅對(duì)常見的12種病原真菌有較好的抑制作用,對(duì)供試的7種病原細(xì)菌也有較好的抑制作用,特別是對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病菌、水稻白葉枯病菌具有顯著的抑菌活性。通過盆栽試驗(yàn)表明,該菌株發(fā)酵液不僅在離體條件下活性較高,在活體情況下也顯示了較好的抑菌活性(數(shù)據(jù)未發(fā)表),是一株極具開發(fā)潛力的生防菌株。但要將該菌株用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上防治植物病害尤其是水稻稻瘟病的防治,還需進(jìn)一步通過田間試驗(yàn)來證明。如果田間防治效果較好,那么對(duì)于其產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)有效成分的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定以及是否適合大面積的使用,都值得進(jìn)一步的研究。

[1]溫小紅, 謝明杰, 姜健, 等. 水稻稻瘟病防治方法研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2013, 29(3): 190-195.

[2]Li Y B, Wu C J, Jiang G H, et al. Dynamic analyses of rice blast resistance for the assessment of genetic and environmental effects [J]. Plant Breeding, 2007, 126(5): 541-547.

[3]劉任, 韓靜君, 游春平, 等. 稻瘟病菌拮抗細(xì)菌bio-2的抑菌作用及其鑒定[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2011, 38(1): 91-92.

[4]史學(xué)濤, 肖應(yīng)輝, 劉楊, 等. 水稻第11染色體抗稻瘟病基因研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2011, 27(12): 1-6.

[5]張芬, 劉郵洲, 于俊杰, 等. 水稻稻瘟病菌拮抗細(xì)菌的篩選與鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 27(3): 505-509.

[6]劉詩(shī)胤, 姜華, 張震, 等. 稻瘟菌拮抗細(xì)菌的篩選與鑒定[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 24(4): 609-614.

[7]溫小紅, 姜健, 楊寶靈, 等. 稻瘟病菌拮抗假交替單胞菌的分離與鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(11): 122-124.

[8]周華強(qiáng), 譚芙蓉, 周穎, 等. 多粘類芽孢桿菌極端嗜熱多肽的純化及性質(zhì)研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)藥, 2007, 6(3): 40-43.

[9]Kuo T M, Kim H, Hou C T.Production of a novel compound, 7, 10, 12-trihydroxy8(E)-octadecenoic acid from ricinoleic acid byPseudomonasaeruginosaPR3 [J]. Current Microbiology, 2001, 43(3): 198-203.

[10]Tendulkar S R, Saikumari Y K, Patel V, et al. Isolation, purification and characterization of an antifungal molecule produced byBacilluslicheniformisBC98, and its effect on phytopathogenMagnaporthegrisea[J]. Journal of Applied Microbiology, 2007, 103(6): 2331-2339.

[11]陳成, 崔堂兵, 于平儒. 一株抗真菌的解淀粉芽孢桿菌的鑒定及其抗菌性研究[J].現(xiàn)代食品科技, 2011, 27(1): 36-39.

[12]朱曉飛, 張曉霞, 牛永春, 等. 一株抗水稻紋枯病菌的解淀粉芽胞桿菌分離與鑒定[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2011, 51(8): 1128-1133.

[13]張榮勝, 王曉宇, 羅楚平, 等. 解淀粉芽孢桿菌Lx-11產(chǎn)脂肽類物質(zhì)鑒定及表面活性素對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病的防治作用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(10): 2014-2021.

[14]田潔萍, 王玉霞, 張淑梅. 解淀粉芽孢桿菌防治水稻惡苗病效果初報(bào)[J]. 黑龍江科學(xué), 2010, 1(4): 10-11.

[15]Nagendran K, Karthikeyan G, Mohammed F P, et al. Exploiting endophytic bacteria for the management of sheath blight disease in rice [J]. Biological Agriculture and Horticulture, 2014, 30(1): 8-23.

[16]蔣淑貞, 錢國(guó)良, 劉軼儒, 等. 產(chǎn)酶溶桿菌OH11菌株胞外酶調(diào)控相關(guān)基因ctp的克隆及功能的初步分析[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào), 2011, 27(1): 68-75.

[17]朱慧, 王云霞, 胡白石, 等. 產(chǎn)酶溶桿菌OH11菌株α-水解蛋白酶基因的克隆與表達(dá)[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào), 2007, 23(4): 358-362.

[18]朱慧, 王云霞, 胡白石, 等. 產(chǎn)酶溶桿菌OH11菌株幾丁質(zhì)酶基因的克隆與表達(dá)[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 31(1): 47-50.

[19]張玉勝, 譚亞男. 油菜核盤菌拮抗菌的篩選及鑒定[J]. 生命科學(xué)儀器, 2009, 7(10): 27-28.

[20]魏彩燕, 毛雪琴, 柴榮耀, 等. 草莓炭疽病生防菌株MT-06的鑒定及生物學(xué)特性[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2010, 29(4): 481-487.

[21]東秀珠, 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2001.

[22]Christensen J J, Andresen K, Justesen T, et al. Ribosomal DNA sequencing: experiences from use in the Danish National Reference Laboratory for identification of bacteria [J]. APMIS,2005, 113 (9): 621-628.

[23]Yamamoto S, Harayama S.PCR amplification and direct sequencing ofgyrBgenes with universal primers and their application to the detection and taxonomic analysis ofPseudomonasputidastrains [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61(3): 1104-1109.

[24]孫建波, 王宇光, 趙平娟, 等. 香蕉枯萎病生防細(xì)菌的篩選、鑒定及其抑菌作用[J]. 中國(guó)生物防治, 2010, 26(3): 347-351.

[25]王寶華, 鄭武, 魯國(guó)東, 等. 稻瘟菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的篩選[J]. 福建農(nóng)業(yè)科技, 2000(2): 1-2.

[26]Kleinkauf H, von D?hren H.Nonribosomal biosynthesis of peptide antibiotics [J]. European Journal of Biochemistry, 1990, 192(1): 1-15.

[27]Chun J, Bae K S.Phylogenetic analysis ofBacillussubtilisand related taxa based on partialgyrAgene sequence [J]. Antonievan Leeuwenhoek, 2000, 78(2): 123-127.

[28]Wang Liting, Lee F L, Tai Chunju, et al. Comparison ofgyrBgene sequences, 16S RNA gene sequences and DNA-DNA hybridization in theBacillussubtilisgroup [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2007,57:1846-1850.

[29]Yamamoto S, Harayama S.Phylogenetic relationships ofPseudomonasputidastrains deduced from the nucleotide sequences ofgyrB,rpoDand 16S rRNA genes [J]. International Journal of Systematic Bacteriology, 1998, 48: 813-819.

[30]張艷群, 來航線, 韋小敏, 等. 兩株生防芽孢細(xì)菌篩選、鑒定及拮抗研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2014, 41(2): 281-289.

(責(zé)任編輯：田喆)

Screening, identification of the antagonistic bacterium WH1G againstMagnaportheoryzaeand analysis of its antagonistic activity to other plant pathogens

Gu Chunyan,Zhang Aifang,Yang Xue,Yan Dankan,Chen Yu,Wang Xuefeng

(Institute of Plant Protection and Agro-Products Safety, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei230031, China)

By plate confrontation culture, the antagonistic strain was screened from the rice rhizosphere soils in Anhui Province, which exhibited anti-fungal activity againstMagnaportheoryzaecausing rice blast. In order to explore the anti-fungal mechanism of the antagonistic strain toM.oryzaeand its taxonomic status, a series of physiological and biochemical experiments were conducted. The results showed that the strain WH1G could strikingly inhibit the growth ofM.oryzaewith an inhibition efficiency of 91.79%. Based on morphological observation, biochemical and physiological characteristics andgyrBgene sequence analysis, WH1G was identified asBacillusamyloliquefaciens. It could produce proteinase and cellulose, but no chitinase orβ-1,3-glucanase were detected. The metabolites of the antagonistic bacteria could lead to decreased spore germination ratio and abnormal hyphal growth ofM.oryzae, such as twist, short growth, less branches and swollen tip. Moreover, the strain could inhibit the growth of 20 common plant pathogenic fungi and bacteria, showing broad anti-microbial spectrum.

Magnaportheoryzae;Bacillusamyloliquefaciens;identification;anti-fungal activity

2015-06-29

2015-10-25

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長(zhǎng)青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目(14B1149);安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(14A1129)

E-mail:feng.ahas@tom.com

S 476

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.007