范世珍，林松青，莫　莉

(廣東省深圳市福田區(qū)中醫(yī)院　518034)

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實(shí)時(shí)定量PCR在血流感染病原體快速檢測中的應(yīng)用

范世珍，林松青，莫莉

(廣東省深圳市福田區(qū)中醫(yī)院518034)

目的探討實(shí)時(shí)定量PCR在血流感染病原體檢測中的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法選取收治的80例患者共92份血液標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測，同時(shí)進(jìn)行血液培養(yǎng)，比較兩種方法的特異度和敏感度。結(jié)果在92份標(biāo)本當(dāng)中，兩種方法共同陰性標(biāo)本66份(71.7%)，兩種方法共檢測出病原體10種。實(shí)時(shí)定量PCR和血培養(yǎng)共同檢出陽性標(biāo)本7例，兩種方法的一致性為79.3%。實(shí)時(shí)定量PCR的陰性預(yù)測值是0.94，敏感度是0.64，特異度是0.82。其中15份標(biāo)本實(shí)時(shí)定量PCR陽性而血培養(yǎng)陰性，4份標(biāo)本血培養(yǎng)陽性而實(shí)時(shí)定量PCR陰性。其中2份標(biāo)本所培養(yǎng)出的病原體不在實(shí)時(shí)定量PCR的檢測范圍內(nèi)，且實(shí)時(shí)定量PCR也不能檢測光滑念珠菌。結(jié)論實(shí)時(shí)定量PCR是快速檢測血液感染標(biāo)本的有價(jià)值方法，但不能完全替代血培養(yǎng)。

血流感染；膿毒血癥；實(shí)時(shí)定量PCR

血流感染常導(dǎo)致嚴(yán)重臨床后果，雖然在微生物診斷與抗微生物治療方面已取得很多進(jìn)展，但敗血癥依然在住院患者感染中占有重要比例，在醫(yī)院內(nèi)死亡原因中位列第三。美國每年200 000人罹患菌血癥，歐洲的研究表明由多重耐藥菌引起的醫(yī)院交叉感染事件也在增多，西班牙的報(bào)道顯示每1 000例住院患者中就有16～31.2 例存在血流感染。國內(nèi)的住院患者中，血流感染也常是惡性腫瘤、血液病、臟器移植等免疫功能缺陷患者的重要死因。醫(yī)院內(nèi)感染中血流感染致死率高達(dá)35%～60%，而在重癥監(jiān)護(hù)病房中的患者，血流感染致死率為31.5%～82.4%，平均56%，同時(shí)導(dǎo)致患者住院時(shí)間延長、住院費(fèi)用增加。因此，快速檢測血液感染病原體并且早期給予抗生素治療是改善血流感染患者預(yù)后最重要的手段。盡管臨床上通過經(jīng)驗(yàn)性給予廣譜抗生素治療，但對(duì)于療效甚微的患者有必要調(diào)整治療手段。目前，全自動(dòng)的常規(guī)血液培養(yǎng)是診斷血流感染的金標(biāo)準(zhǔn)，然而，最終的培養(yǎng)結(jié)果往往是需要等待12～48 h。對(duì)于營養(yǎng)需求苛刻的病原體(如酵母菌)可能需要更長的時(shí)間[1]。此外，若患者先前使用過抗生素，血培養(yǎng)的陽性率一般更低。因此，直接從血液標(biāo)本中對(duì)細(xì)菌或真菌的核酸進(jìn)行擴(kuò)增是鑒定病原體感染的重要手段[2-4]。本研究通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測血流感染患者中的病原體，并與常規(guī)血培養(yǎng)法進(jìn)行對(duì)比，旨在評(píng)價(jià)其在臨床中的應(yīng)用價(jià)值。

1　資料與方法

1.1一般資料本研究納入的92份血液標(biāo)本來自2015年6～9月深圳市福田區(qū)中醫(yī)院80例患者，其中男39例、女41例，平均年齡(45.6±8.5)歲；59例患者(73.8%)來自重癥醫(yī)學(xué)科和呼吸內(nèi)科， 21例(26.3%)來自心血管內(nèi)科和神經(jīng)內(nèi)科；72例患者(90.0%)在采集血液時(shí)已經(jīng)接受過抗菌藥物治療，19例(23.8%)在抽血后24 h內(nèi)死亡；80例患者中有3例具有全身炎癥反應(yīng)綜合征。

1.2方法使用靜脈穿刺術(shù)獲取的血液標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行常規(guī)血培養(yǎng)法和LightCycler SeptiFast (SF) 實(shí)驗(yàn)。常規(guī)血培養(yǎng)法：收集20 mL血液接種到BacT/Alert FAN需氧或厭氧瓶中，并在BacT/Alert 3D自動(dòng)血液培養(yǎng)系統(tǒng)(Bio-Merieux) 37 ℃培養(yǎng)1～5 d，當(dāng)所有瓶子為陽性時(shí)，根據(jù)相應(yīng)方法分離并鑒定微生物。靜脈穿刺得到的5 mL含有乙二胺四乙酸(EDTA)血液同時(shí)也進(jìn)行血培養(yǎng)法檢測，其步驟根據(jù)SeptiFast Lys、SeptiFast Prep和LightCycler SeptiFast試劑盒說明書進(jìn)行。PCR在LightCycler 2.0(Roche)儀器上進(jìn)行。所有檢測微生物通過SeptiFast識(shí)別軟件識(shí)別特有的峰值，并人工計(jì)算其Tm值，當(dāng)對(duì)照為陽性且無其他信號(hào)時(shí)，SF結(jié)果報(bào)告為陰性。對(duì)于某些SF檢測葡萄球菌和鏈球菌凝固酶陰性時(shí)，可能是層流污染所致，若其臨界值以及CP值高于35循環(huán)也納入軟件分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理利用SPSS 15.0 軟件進(jìn)行分析。并計(jì)算靈敏度、特異度、陰性預(yù)測值。

2　結(jié)　　果

2.1兩種方法細(xì)菌檢出率情況在92例血液標(biāo)本中，兩種方法均檢測陰性66例，陽性7例。4例標(biāo)本血培養(yǎng)陽性而實(shí)時(shí)定量PCR陰性。15例標(biāo)本血培養(yǎng)陰性而實(shí)時(shí)定量PCR陽性。實(shí)時(shí)定量PCR與血培養(yǎng)的陰性預(yù)測值是0.94，敏感度是0.64，特異度是0.82。在15例實(shí)時(shí)定量PCR陽性而血培養(yǎng)陰性的標(biāo)本中，包括埃希菌屬5例，腸球菌屬4例，腸桿菌屬3例，假單胞菌2例，金黃色葡萄球菌1例。見表1。

表1　　實(shí)時(shí)定量PCR與血培養(yǎng)細(xì)菌檢出情況比較(n)

2.2實(shí)時(shí)定量PCR假陰性情況實(shí)時(shí)定量PCR的假陰性率為4.3%(4/92)，包括多殺性巴氏桿菌1例，解沒食子酸鏈球菌1例，該2種病原體為包含在預(yù)先設(shè)的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增方案當(dāng)中。此外，實(shí)時(shí)定量PCR也不能檢測光滑念珠菌。

3　討　論

血培養(yǎng)為檢測血中病原微生物的經(jīng)典方法，目前仍為血流感染病原微生物分離鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。盡管如此，血培養(yǎng)也存在一些由方法本身特點(diǎn)決定的不足，制約了其檢測的速度與敏感性。首先，細(xì)菌分裂繁殖到能夠檢測到的水平需要一定的時(shí)間，這個(gè)速度與細(xì)菌種屬有關(guān)，有些種屬的細(xì)菌生長緩慢，苛養(yǎng)菌甚至不生長，使得血培養(yǎng)在細(xì)菌鑒定中速度緩慢而且敏感性差。尤其檢測新生兒血流感染時(shí)敏感性更差，這是由于新生兒血培養(yǎng)時(shí)用于檢測的血量少，而且血液中菌量低所致。其次，血培養(yǎng)中令人困擾的問題是進(jìn)行抗生素治療后血培養(yǎng)陽性率明顯下降，血培養(yǎng)只能檢測到存活的微生物，而抗生素治療后會(huì)殺死細(xì)菌使其檢出率降低。上述因素顯著降低了血培養(yǎng)在血流感染診斷中的速度與敏感性，因此臨床工作迫切要求能夠快速、準(zhǔn)確鑒定血流感染中病原微生物的敏感方法，及時(shí)、有效地控制感染，降低患者病死率。

本研究對(duì)血培養(yǎng)與實(shí)時(shí)定量PCR檢測血流感染中的病原微生物進(jìn)行了比較。先前的研究結(jié)果表明，在血液科、腫瘤科以及重癥醫(yī)學(xué)科等科室，實(shí)時(shí)定量PCR的敏感度范圍為0.60～0.95，特異度為0.74～0.93。相比之下，本研究的敏感性相對(duì)較低，但特異性更高。本研究當(dāng)中，實(shí)時(shí)定量PCR陽性，而血培養(yǎng)陰性標(biāo)本占16.3%，而國外同類研究顯示其檢出率僅為10%，但Lucignano等[5]的研究卻顯示其檢出率為36.3%。當(dāng)在人體其他部位也檢測出相應(yīng)的病原體時(shí)，實(shí)時(shí)定量PCR陽性，而血培養(yǎng)陰性標(biāo)本在一定程度上反映出真實(shí)的結(jié)果。然而，15例患者中5例出現(xiàn)陽性，但血培養(yǎng)陰性的標(biāo)本，同樣的病原體在10 d前也可檢測到。然而這是否是由于使用了抗生素導(dǎo)致其無法生長，還是僅僅是血液中存在這些病原體的DNA，目前依然不清楚。血液中的細(xì)菌DNA與全身炎癥反應(yīng)綜合征的發(fā)生以及膿毒血癥之間是否存在關(guān)聯(lián)，目前依然存在爭議。有研究發(fā)現(xiàn)血液中游離DNA的出現(xiàn)是評(píng)價(jià)ICU患者發(fā)生多器官功能衰竭的危險(xiǎn)因素，因此，實(shí)時(shí)定量PCR不但可以用于未知病原體或其DNA的檢測，同時(shí)也能為臨床提供有價(jià)值的信息，而這些是常規(guī)血培養(yǎng)難以做到的[6]。

本研究中，實(shí)時(shí)定量PCR的假陰性為4.3%，國外有報(bào)道為4.8%，但這些研究未考慮到未列入實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增譜中的其他細(xì)菌。同時(shí)，對(duì)真菌的檢測也是本方法存在的重要難題。實(shí)時(shí)定量PCR檢測光滑念珠菌失敗的原因可能是PCR反應(yīng)的抑制或自我擴(kuò)增效率低下，這可能與擴(kuò)增該菌時(shí)選取的ITS區(qū)域過大所致[7-9]。

盡管如此，本研究也存在一些局限性。首先，由于國內(nèi)外已經(jīng)開展過類似的研究，因此本文的創(chuàng)新性也受到一定的影響；其次，納入研究的標(biāo)本數(shù)量較少(周期僅僅3個(gè)月)，因此還有必要進(jìn)一步增加樣本量，從而更加準(zhǔn)確地比較實(shí)時(shí)定量PCR和血培養(yǎng)各自的特異性與敏感性?？傊?，實(shí)時(shí)定量PCR可快速、敏感地檢測血流感染病原體，即便曾使用過抗生素，實(shí)時(shí)定量PCR也是一個(gè)非常有價(jià)值的檢測方法[10]。然而，實(shí)時(shí)定量PCR無法獲取細(xì)菌耐藥方面的數(shù)據(jù)，且檢測的病原體數(shù)量有限，因此它也不能完全替代常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)[11]。但兩者結(jié)合，能為臨床提供快速的治療方案，最終減少耐藥菌的產(chǎn)生而利于患者康復(fù)[12]。

[1]Peters RP,Van Agtmael MA,Danner SA,et al.New developments in the diagnosis of bloodstream infections[J].Lancet Infect Dis,2004,4(12):751-760.

[2]Chaidaroglou A,Manoli E,Marathias E,et al.Use of a multiplex polymerase chain reaction system for enhanced bloodstream pathogen detection in thoracic transplantation[J].J Heart Lung Transplant,2013,32(7):707-713.

[3]Somogyvari F,Horvath A,Serly J,et al.Detection of invasive fungal pathogens by real-time PCR and high-resolution melting analysis[J].In Vivo,2012,26(6):979-983.

[4]Hansen WL,Beuving J,Bruggeman CA,et al.Molecular probes for diagnosis of clinically relevant bacterial infections in blood cultures[J].J Clin Microbiol,2010,48(12):4432-4438.

[5]Lucignano B,Ranno S,Liesenfeld O,et al.Multiplex PCR allows rapid and accurate diagnosis of bloodstream infections in newborns and children with suspected sepsis[J].J Clin Microbiol,2011,49(6):2252-2258.

[6]Maubon D,Hamidfar-Roy R,Courby S,et al.Therapeutic impact and diagnostic performance of multiplex PCR in patients with malignancies and suspected sepsis[J].J Infect,2010,61(4):335-342.

[7]Chen SC,Kontoyiannis DP.New molecular and surrogate biomarker-based tests in the diagnosis of bacterial and fungal infection in febrile neutropenic patients[J].Curr Opin Infect Dis,2010,23(6):567-577.

[8]Lehmann LE,Hunfeld KP,Emrich T,et al.A multiplex real-time PCR assay for rapid detection and differentiation of 25 bacterial and fungal pathogens from whole blood samples[J].Med Microbiol Immunol,2008,197(3):313-324.

[9]ObaraH,AikawaN,HasegawaN,etal.Theroleofareal-timePCRtechnologyforrapiddetectionandidentificationofbacterialandfungalpathogens

in whole-blood samples[J].J Infect Chemother,2011,17(3):327-333.

[10]Wallet F,Nseir S,Baumann L,et al.Preliminary clinical study using a multiplex real-time PCR test for the detection of bacterial and fungal DNA directly in blood[J].Clin Microbiol Infect,2010,16(6):774-779.

[11]Peng JS,Liu ZH,Li CJ,et al.Development of a real-time PCR method for the detection of bacterial colonization in rat models of severe acute pancreatitis[J].Chin Med J (Engl),2010,123(3):326-331.

[12]Fenollar F,Raoult D.Molecular diagnosis of bloodstream infections caused by non-cultivable bacteria[J].Int J Antimicrob Agents,2007,30(Suppl 1):S7-S15.

Application of real-time PCR in rapid detection of bloodstream infection pathogens

FANShizhen,LINSongqing,MoLi

(FutianDistrictHospitalofTraditionalChineseMedicine,Shenzhen,Guangdong518034,China)

ObjectiveTo investigate the clinical application value of real-time PCR in the detection of bloodstream infection pathogens.MethodsA total of 92 blood samples from 80 patients in our hospital were collected for conducting real time PCR detection and conventional blood culture.The sensitivity and specificity were compared between the two methods.ResultsAmong 92 samples,66 samples (71.7%) were negative in both assays.Ten different pathogens were detected by either blood culture system or real-time PCR or by both methods.Seven positive samples were detected by both assays.The consistence of the two methods was 79.3%.The negative predictive value of real-time PCR was 0.94,the sensitivity was 0.64 and the specificity was 0.82.Among them,15 samples were positive in real-time PCR,while negative in blood culture system,4 samples were positive in the blood culture,whereas were negative in the real-time PCR.The pathogens cultured in 2 samples were not in the detection range of real time PCR,moreover real time pCR could not detect Candida glabrata.ConclusionReal time PCR is a valuable method for rapidly detection the sample of bloodstream infection,but cannot completely replace the blood culture test.

bloodstream infection;sepsis;real-time PCR

范世珍，女，主任技師，主要從事臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.028

A

1673-4130(2016)16-2278-03

2016-03-29

2016-06-20)