杜業(yè)剛，陽洪波，古麗君，楊國武，李碧芳（深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測研究院，深圳518131）

UPLC-MS/MS法同時測定動物源性食品中8種多肽類抗生素

杜業(yè)剛，陽洪波，古麗君，楊國武，李碧芳*
（深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測研究院，深圳518131）

建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）同時測定動物源性食品中8種多肽類抗生素殘留量分析方法。試樣經(jīng)甲醇-水-甲酸（40∶60∶0.1，v/v/v）提取，固相萃取法凈化后，以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液為流動相，梯度洗脫，經(jīng)C18色譜柱分離后，在正離子掃描模式下，采用選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM），外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，8種多肽抗生素方法檢出限為0.1～10 μg/kg，去甲萬古霉素和萬古霉素在20～1000 μg/L范圍內(nèi)，多粘菌素B和E在40～1000 μg/L范圍內(nèi)，桿菌肽A在10～1000 μg/L范圍內(nèi)，桿菌肽B在6～614 μg/L范圍內(nèi)，維吉尼霉素M1和S1在1～100 μg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r＞0.999，加標(biāo)回收率為61.0%～99.6%，RSD為1.2%～9.8%。該方法簡便快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可滿足動物源性食品中多肽類抗生素殘留的同時測定。

多肽抗生素，動物源性食品，固相萃取，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

多肽類抗生素是具有多肽結(jié)構(gòu)特征的一類抗生素，常用的包括多粘菌素、桿菌肽、維吉尼霉素、萬古霉素等［1-2］。多肽抗生素抗革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌的感染，被廣泛用于家禽、豬、牛等的飼料添加劑和獸藥中，預(yù)防動物疾病、促進(jìn)動物生長［3］，過量濫用及不遵循休藥期使用，將可能導(dǎo)致動物源性食品中多肽類抗生素殘留。另外，多肽類抗生素引起耳、腎毒性，皮膚過敏反應(yīng)和神經(jīng)系統(tǒng)毒性，人若長期食用

有多肽類抗生素殘留的食品，會危及人體健康，而且還會增加細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險［4］。目前，國內(nèi)外關(guān)于動物源性食品中多肽抗生素的檢測大多只是針對一兩種抗生素進(jìn)行了檢測研究，最多的同時測定其中5種，但是實(shí)際樣品僅檢測了牛奶［5］。我國國家標(biāo)準(zhǔn)只有對維吉尼霉素M1［6］和桿菌肽［7］有相關(guān)動物性食品中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測標(biāo)準(zhǔn)方法。全國食品安全整頓工作辦公室發(fā)布關(guān)于印發(fā)《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單（第四批）》的通知（整頓辦函〔2010〕50號），將萬古霉素列為可能違法添加的非食用物質(zhì)，并提出需要研制動物性食品中測定萬古霉素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。目前主要的檢測方法有微生物法［8］、免疫分析法［9］、毛細(xì)管電泳法［10］、高效液相色譜法［11］和液質(zhì)聯(lián)用法［12］等。串聯(lián)質(zhì)譜具有快速，準(zhǔn)確，靈敏度高等特點(diǎn)，是多肽抗生素殘留檢測的理想方法。本次研究采用UPLC-MS/MS法可以同時檢測動物源性食品中的8種多肽類抗生素殘留，以期為政府進(jìn)一步打擊違法添加非食用物質(zhì)和食品安全標(biāo)準(zhǔn)體系的完善提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品（雞肉、鴨肉、豬肉、牛肉、羊肉、豬肝、豬腎、雞肝、雞腎、魚） 購自當(dāng)?shù)爻校蝗ゼ兹f古霉素 純度為83.4%，中國藥品生物制品檢定所；鹽酸萬古霉素、多粘菌素B、多粘菌素E 純度分別為91.2%、84.7%、80.6%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；桿菌肽 桿菌肽A純度為47.1%、桿菌肽B純度為28.9%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；維吉尼霉素M1 純度為90%，加拿大Toronto Research Chemicals公司；維吉尼霉素S1 純度為99%，澳大利亞BioAustralis Fine Chemicals公司；乙腈、甲醇、甲酸、正己烷 色譜純，德國Merck公司；固相萃取柱Oasis HLB（500 mg，6 mL） 美國Waters公司；實(shí)驗(yàn)用水 屈臣氏瓶裝蒸餾水；其他未注明試劑 均為市售國產(chǎn)分析純。

UPLC-TSQ Vantage超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧電離源和Accela超高效液相色譜系統(tǒng)）美國Thermo Fisher公司；Hypersil GOLD C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm） 美國Thermo Fisher公司；ks4000i型空氣控溫?fù)u床 德國IKA公司；2-16P型大容量離心機(jī) 美國Sigma公司；Turbo VAPLV全自動氮吹儀 瑞典Biotage公司；CPA224S型萬分位分析天平、CPA423S型千分位電子天平 德國賽多利斯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取適量（精確至0.1 mg）的去甲萬古霉素、萬古霉素、多粘菌素B、多粘菌素E、桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用0.1%甲酸水溶解并定容至100 mL，標(biāo)準(zhǔn)儲備液質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，密封-18℃背光保存。分別準(zhǔn)確稱取適量（精確至0.1 mg）的維吉尼霉素M1、維吉尼霉素S1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解并定容至50 mL，標(biāo)準(zhǔn)儲備液質(zhì)量濃度分別為180、99.0 μg/mL，密封-18℃背光保存。稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量是按純度修正過的質(zhì)量。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確量取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用乙腈-水-甲酸溶液（10∶90∶0.1，v/v）配制成所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，密封4℃背光保存。

1.2.2 樣品前處理 稱取樣品5 g（精確至0.001 g）于50 mL具塞離心管中，加入18 mL甲醇-水-甲酸（40∶60∶0.1，v/v/v）混合提取液后，加入2 mL 1 mol/L硫酸溶液，渦旋1 min，以300 r/min搖床振蕩15 min后，于同一離心管中加入10 mL乙腈飽和的正己烷渦旋2 min，以6500 r/min室溫離心5 min，取下層清液4 mL 過HLB固相萃取柱子（500 mg，6 mL）（5 mL甲醇+5 mL水預(yù)活化），用1 mL甲醇-水-甲酸（70∶30∶0.1，v/v/v）混合洗脫液洗脫，再加5 mL甲醇洗脫，合并洗脫液，氮?dú)獯蹈桑靡译?水-甲酸溶液（10∶90∶0.1，v/v）溶解定容至1 mL，過0.22 μm濾膜后移入進(jìn)樣瓶中，供UPLC-MS/MS分析。結(jié)果按公式X=c×V/（m×f）計(jì)算，其中X為試樣中被測組分含量，單位為μg/kg；c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到被測組分溶液的濃度，單位為μg/L；V為樣品溶液定容體積，單位為mL；m為試樣量，單位為g；f為換算系數(shù)。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液，0.1%甲酸乙腈；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table1 The program of gradient elution

1.2.4 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描模式：正離子掃描選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）模式；噴霧電壓3000 V；離子源溫度為300℃；離子傳輸管溫度為300℃；鞘氣為30 arb；輔助氣為10 arb；碰撞能量、S-lens電壓及SRM相關(guān)參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測條件的選擇

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 去甲萬古霉素、萬古霉素、桿菌肽、多粘菌素B、多粘菌素E、維吉尼霉素M1、維吉尼霉素S1等多肽類抗生素是由氨基酸縮合而成的肽類物質(zhì)，分子量從525～1448。多肽抗生素在電噴霧離子化時，容易與一個或多個H+結(jié)合，產(chǎn)生帶正電的單電荷或多電荷離子。桿菌肽、多粘菌素B、多粘菌素E三種多肽類抗生素的分子量均超過1000，電噴霧離子化時能產(chǎn)生不同豐度的雙電荷離子和三電荷離子，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)三電荷離子的響應(yīng)比雙電荷離子高，因此選擇的三電荷離子（［M+3H］3+）分別作為母離子。而對于去甲萬古霉素和萬古霉素而言，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化更易產(chǎn)生雙電荷離子，因此選擇雙電荷離子（［M+2H］2+）作為它們母離子。維基尼霉素M1和S1能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的準(zhǔn)分子離子峰（［M+H］+），因此選擇［M+H］+作為母離子。

表2 多肽抗生素的質(zhì)譜分析條件參數(shù)Table2 MS parameters for the analysis of polypeptide antibiotics

選擇多肽抗生素的［M+nH］n+離子作為母離子進(jìn)入二級質(zhì)譜后發(fā)生斷裂或重排等反應(yīng)產(chǎn)生不同碎片離子，選擇強(qiáng)度大的2個子離子作為定量及定性離子，并以此為基礎(chǔ)，對碰撞能量、透鏡電壓、鞘氣、輔助氣等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）為檢測方式，使目標(biāo)測定物質(zhì)的定性定量離子靈敏度達(dá)到最大。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化 去甲萬古霉素、萬古霉素、多粘菌素和桿菌肽易溶于酸性水溶液，微溶于甲醇、乙腈等有機(jī)試劑，維吉尼霉素易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯、氯仿、乙醚等極性溶劑。文獻(xiàn)報道分離此類藥物的流動相一般主要有銨鹽-乙腈（甲醇）或者酸性水溶液-乙腈（甲醇）［13-14］。實(shí)驗(yàn)中比較了10 mmol/L乙酸銨-乙腈（甲醇）、0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈和0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈不同流動相的分離效果。多肽抗生素含有較多個氨基和羧基，易和反相色譜柱的硅醇基相互作用，導(dǎo)致拖尾。使用乙酸銨作為緩沖溶液時，多粘菌素和桿菌肽不出峰，而使用甲酸作為酸度調(diào)節(jié)劑時，多粘菌素和桿菌肽出峰，因?yàn)榧姿峥梢詾殛栯x子的形成提供必需的質(zhì)子來源，從而提高其離子化效率，因此選用甲酸作為酸度調(diào)節(jié)劑。甲醇作為有機(jī)相時目標(biāo)物峰拖尾，保留時間延長，且柱壓較高。采用乙腈作為有機(jī)相可以有效改善峰型，乙腈中添加0.1%甲酸作為有機(jī)相時，可明顯提高目標(biāo)峰的響應(yīng)值。不同流動相條件對多粘菌素和桿菌肽的影響較大，以多粘菌素B1為例，不同流動相條件下的多粘菌素B1色譜峰型比較如圖1所示，在0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈體系下，目標(biāo)物的峰型最好，甲酸可以使色譜柱內(nèi)硅膠硅醇基質(zhì)子化，從而減弱硅醇基與多肽藥物之間的相互作用，使得色譜峰型良好，且拖尾現(xiàn)象減少，故選擇0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈作為流動相，調(diào)整流動相梯度，使各目標(biāo)峰達(dá)到有效的分離。桿菌肽A和B在不同梯度洗脫程序下的色譜峰型比較見圖2，如圖2（b）所示，各洗脫一個色譜峰，改變梯度，并延長洗脫時間，如圖2（a）所示，桿菌肽A和B的色譜峰分叉，桿菌肽A產(chǎn)生兩個基線分離的色譜峰，桿菌肽B則產(chǎn)生3個未達(dá)到基線分離的色譜峰，有文獻(xiàn)報道［15-16］桿菌肽A和B都含有多個同分異構(gòu)體，GB/T 20743-2006［7］檢測桿菌肽A時同樣產(chǎn)生兩個色譜峰，峰面積按保留時間長的計(jì)，因此本實(shí)驗(yàn)桿菌肽A峰面積以6.98 min的峰計(jì)算，桿菌肽B按總峰面積計(jì)算。多肽抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的SRM離子流圖見圖3。

圖1 不同流動相條件下的多粘菌素B1色譜峰型比較Fig.1 The comparison of chromatographic peak of polymyxin B1 under different mobile phases

圖2 不同梯度洗脫程序下桿菌肽的色譜峰型比較Fig.2 The comparison of chromatographic peak of bacitracin under different gradient elution programs

2.2 樣品前處理選擇

圖3 多肽抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的SRM提取離子流圖Fig.3 SRM chromatograms of polypeptide antibiotics

2.2.1 提取方法的優(yōu)化 多肽類物質(zhì)溶解性差別較大，去甲萬古霉素、萬古霉素、桿菌肽、多粘菌素B、多粘菌素E易溶于水，且在弱酸性條件下比較穩(wěn)定，微溶于甲醇等有機(jī)試劑，但是維吉尼霉素易溶于甲醇、乙腈等有機(jī)試劑。實(shí)驗(yàn)比較了0.1%甲酸水溶液-甲醇和0.1%甲酸水溶液-乙腈對提取效果的影響，結(jié)果表明甲醇的提取效果要好于乙腈，選擇0.1%甲酸水溶

液-甲醇作為提取劑。比較了不同比例的提取效果，結(jié)果表明水相越高，目標(biāo)物提取效果越好，但提取溶液粘度加大，不易于過柱，因此綜合考慮，選擇0.1%甲酸水溶液∶甲醇為40∶60（v/v）的提取液作多肽抗生素的提取溶劑。由于動物樣品提取液中雜質(zhì)含量較多，這些雜質(zhì)主要以蛋白、色素、脂肪為主，故在前期提取時加入1 mol/L硫酸除蛋白，加入乙腈飽和的正己烷除去脂肪類雜質(zhì)，可有效去除雜峰的干擾。

2.2.2 凈化方法的優(yōu)化 多肽抗生素樣品凈化方法主要采用C18和HLB固相萃取柱。本實(shí)驗(yàn)比較了2種不同的固相萃取柱Oasis HLB（500 mg，6 mL）和Sep-pak C18（500 mg，6 mL）分別在不同的加標(biāo)水平下的提取效果，結(jié)果表明C18對去甲萬古霉素和萬古霉素的提取效果較差，提取回收率在10%以下，C18和HLB對其他幾種抗生素的提取回收效果相當(dāng)，因此綜合考慮選擇HLB固相萃取小柱凈化樣品。實(shí)驗(yàn)采用純甲醇作為洗脫溶劑，發(fā)現(xiàn)去甲萬古霉素和萬古霉素回收較低，故采用分步洗脫的方式，先用甲醇-水-甲酸（70∶30∶0.1，v/v/v），再用甲醇洗脫，優(yōu)化洗脫比例，結(jié)果表明1 mL甲醇-水-甲酸（70∶30∶0.1，v/v/v）加5 mL甲醇洗脫效果最佳。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 樣品基質(zhì)效應(yīng) 將多肽抗生素溶解在空白基質(zhì)中的響應(yīng)與溶解在空白溶劑乙腈-水-甲酸溶液（10∶90∶0.1，v/v）中的響應(yīng)進(jìn)行比較，來評價不同基質(zhì)效應(yīng)，肌肉組織和內(nèi)臟組織對多肽抗生素的影響作用見表3，基質(zhì)效應(yīng)均在85%～115%之間，基質(zhì)影響較小，因此本研究采用空白溶劑稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。圖4為牛肉的基質(zhì)加標(biāo)和空白基質(zhì)的SRM離子流圖。

表3 肌肉組織和內(nèi)臟組織對目標(biāo)化合物的基質(zhì)影響Table3 Matrix effects of muscle tissue and internal organs on target compounds

2.3.2 方法的線性范圍、檢出限及定量限 精確配制一系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，其中多粘菌素B以B1和B2的峰面積總和計(jì)，多粘菌素E以E1和E2峰面積總和計(jì)，由實(shí)驗(yàn)得出的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)（r）、檢出限和定量限見表4。以3倍信噪比計(jì)算方法檢出限，以10倍信噪比計(jì)算方法定量限。方程線性相關(guān)系數(shù)均在0.9990以上，結(jié)果表明該方法在此濃度范圍內(nèi)線性良好。

圖4 牛肉的基質(zhì)加標(biāo)和空白基質(zhì)的多肽抗生素SRM離子流圖Fig.4 SRM chromatograms of polypeptide antibiotics in spiked beef matrix and blank matrix

2.3.3 方法的回收率與精密度 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，

在不同空白基質(zhì)（雞肉、鴨肉、豬肉、牛肉、羊肉、魚、豬肝、豬腎、雞肝、雞腎）的樣品中添加低、中、高3個不同濃度水平的多肽抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，并考察實(shí)驗(yàn)方法的精密度，每個添加濃度做6個平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率（Rce.%）及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。在3個添加水平上8種多肽的平均回收率為61.0%～99.6%，精密度RSD為1.2% ～9.8%。

2.3.4 實(shí)際樣品檢測 通過本實(shí)驗(yàn)建立的方法，對市場上購買的30個動物組織樣品（包括雞肉、鴨肉、豬肉、牛肉、羊肉、魚、豬肝、豬腎、雞肝、雞腎各3種）進(jìn)行8種多肽抗生素的檢測，結(jié)果均未檢出。

3 結(jié)論

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定動物源性食品中8種多肽類抗生素殘留的分析方法。方法采用Oasis HLB柱凈化提取液，UPLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測模式，實(shí)現(xiàn)了對10種動物組織樣品中8種多肽抗生素殘留的同時定量檢測及確證分析，該方法簡單快速，靈敏度高、準(zhǔn)確性好、分析時間短，可滿足大批量樣品的快速檢測。在食品安全備受關(guān)注的環(huán)境下，該方法能為動物源性食品中多肽抗生素的監(jiān)管和監(jiān)督提供技術(shù)依據(jù)，對于保障我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)

健康有序發(fā)展，保護(hù)廣大消費(fèi)者的利益和身體健康具有重要意義。

表4 8種多肽抗生素的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table4 Regression equations，linearity range，correlation coefficients，limits of determination and limits of quantification of 8 polypeptide antibiotics

表5 8種多肽抗生素在動物組織樣品中的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table5 Precision and recovery of the method in animal tissue sample（n=6）

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Determination of eight polypeptide antibiotics in animal derived food by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

DU Ye-gang，YANG Hong-bo，GU Li-jun，YANG Guo-wu，LI Bi-fang*
（Shenzhen Academy of Metrology and Quality Inspection，Shenzhen 518131，China）

An ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS-MS）method had been established for the simultaneous determination of eight polypeptide antibiotics in animal derived food.Test sample was extracted by methanol-water-formic acid（40∶60∶0.1，v/v/v），followed by cleaning up method based on solid phase extraction（SPE）.Extracts were separated on a C18column using a gradient elution of 0.1%formic acid water solution and 0.1% formic acid acetonitrile solution.Analytes were detected by ultraperform liquid chromatography tandem mass spectrometry in positive ion mode with selected reaction monitoring （SRM）.The results showed that the limits of detection（LOD）of 8 polypeptide antibiotics were 0.1～10 μg/kg.The calibration curves for norvancomycin and vancomycin（concentration range 20～1000 μg/L），polymyxin B and E（concentration range 40～1000 μg/L），bacitracin A（concentration range 10～1000 μg/L），bacitracin B （concentration range 6～614 μg/L），virginiamycin M1 and S1（concentration range 1～100 μg/L）were linear with correlation coefficients more than 0.999.The recoveries were in the range of 61.0%～99.6%.The relative standard deviations（RSDs）ranged from 1.2%～9.8%.The method was simple and rapid with high sensitivity and good reproducibility，and was appropriate for the identification and quantification of polypeptide antibiotics residue in animal derived food.

polypeptide antibiotic；animal derived food；solid-phase extraction；ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）

TS207.3

A

1002-0306（2016）08-085-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.009

2015－07－27

杜業(yè)剛（1978-），男，博士，研究方向：食品化學(xué)分析，E-mail：2634928520@qq.com。

*通訊作者：李碧芳（1978-），女，高級工程師，研究方向：食品化學(xué)分析，E-mail：libf@smq.com.cn。

深圳市技術(shù)創(chuàng)新計(jì)劃技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目（JSGG2014051911405031）。