李建誼， 張　波， 汪　璇

(1.上海歐陸科儀有限公司， 上海 201216； 2.河北海事局， 河北 秦皇島 066000； 3.上海船舶工藝研究所， 上海200032)

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熒光法測(cè)葉綠素在壓載水檢測(cè)中的應(yīng)用及前景

李建誼1， 張波2， 汪璇3

(1.上海歐陸科儀有限公司， 上海 201216； 2.河北海事局， 河北 秦皇島 066000； 3.上海船舶工藝研究所， 上海200032)

熒光法是一種被行業(yè)公認(rèn)的檢測(cè)壓載水中葉綠素含量最有效的方法，已被廣泛應(yīng)用于壓載水檢測(cè)領(lǐng)域，此方法也顯示出了極大的發(fā)展前景和應(yīng)用價(jià)值。提出了一種新型的葉綠素檢測(cè)儀器，經(jīng)過一系列的試驗(yàn)，驗(yàn)證了此儀器的實(shí)用性、精確性和有效性。并分析了此技術(shù)的前景，為未來的發(fā)展提出了方向和展望。

熒光法葉綠素壓載水檢測(cè)

0　引言

由船舶壓載水?dāng)y帶的海洋物種對(duì)海洋環(huán)境的侵害被認(rèn)為是海洋的四大危害之一。據(jù)估計(jì)，每年約有100億噸的壓載水在全球轉(zhuǎn)移，每天約有超過3 000種生物通過壓載水在全世界范圍內(nèi)遷徙[1]。為此，國(guó)際海事組織(IMO)于2004年2月13日在倫敦通過了《國(guó)際船舶壓載水和沉積物管理與控制公約》，以更好地管理和控制壓載水的取排。該公約共有22條條款和一條規(guī)則附則，附則的D-2為壓載水性能標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)未來船舶排放壓載水中的活體生物數(shù)量做了明確規(guī)定[2]，如表1所示。

大洋水中主要的小型活體是微藻，而葉綠素α廣泛存在于所有的藻類中，通過對(duì)浮游植物葉綠素的測(cè)量可以得知有生產(chǎn)力的活體細(xì)胞豐度。浮游植物葉綠素α濃度的測(cè)定有多種方法，其中常用的有分光光度法、熒光光度法和高效液相色譜法(HPLC)[3]。高效液相色譜法能夠精確地測(cè)定各種光合色素的含量，但由于儀器昂貴，分析操作步驟繁瑣，一般不能用于野外大量樣品的快速分析[4]。分光光度法最為常用，其測(cè)定儀器簡(jiǎn)單，一般實(shí)驗(yàn)室都有配備，且已具備完善的測(cè)定體系。這種方法得到的數(shù)據(jù)相對(duì)準(zhǔn)確，但測(cè)試程序耗時(shí)，需要有經(jīng)驗(yàn)的分析人員操作，以確保良好的數(shù)據(jù)及長(zhǎng)期的一致性，遺憾的是不能用于大量樣本的快速、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[5]。熒光光度法作為微量分析的經(jīng)典方法，能精確地測(cè)定葉綠素α的含量，其靈敏度是分光光度法的50倍以上, 且不需要萃取。 特別是脈沖幅度調(diào)制(PAM)熒光技術(shù)的出現(xiàn)，為葉綠素?zé)晒獾囊巴猬F(xiàn)場(chǎng)、原位測(cè)量提供了技術(shù)支持。PAM熒光技術(shù)還能測(cè)量植物在光合作用中葉綠素對(duì)光能的利用效率，進(jìn)而可判斷植物細(xì)胞的活性，為分析壓載水中的微藻奠定了良好的基礎(chǔ)。PAM 脈沖幅度調(diào)制熒光技術(shù)信號(hào)原理如圖1所示。

表1　IMO D-2排放標(biāo)準(zhǔn)

圖1　PAM 脈沖幅度調(diào)制熒光技術(shù)信號(hào)原理

1　儀器開發(fā)

普通的葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量多是在萃取液中進(jìn)行(見圖2)。葉綠素α熒光在不同介質(zhì)中激發(fā)與誘導(dǎo)出的波長(zhǎng)會(huì)有所不同，其中紅色激發(fā)波長(zhǎng)與誘導(dǎo)出的波長(zhǎng)很接近。因此，如何有效地檢測(cè)水體中微藻的葉綠素α熒光微弱的信號(hào)，并且儀器體積小、方便現(xiàn)場(chǎng)使用，都是儀器開發(fā)者必須考慮的問題。

圖2　樣品池中飽和光通過樣品后激發(fā)出近紅熒光

儀器開發(fā)首先尋找、試驗(yàn)葉綠素α在水體中的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，然后進(jìn)一步優(yōu)化有關(guān)光學(xué)器件，控制好激發(fā)與接受熒光的光譜帶寬以及截止深度，使到達(dá)接受器的是干凈的熒光，即不含有其它波長(zhǎng)的干擾光。其次，篩選合適的接受器。接受器不僅要求靈敏度高，還要求響應(yīng)時(shí)間短，以滿足PAM技術(shù)的需要。隨后采用可靠的前置光電轉(zhuǎn)化電路、濾波和鎖相放大技術(shù)將微弱的熒光有效地提取并轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，經(jīng)放大并濾去噪聲，成為平穩(wěn)的直流信號(hào)。然后通過數(shù)模轉(zhuǎn)換器件轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)送入單片機(jī)，再輔以軟件的數(shù)字濾波技術(shù)對(duì)數(shù)字信號(hào)進(jìn)一步濾波降噪，得到穩(wěn)定的信號(hào)值。最后通過測(cè)量已知濃度葉綠素α的熒光值建立起葉綠素α濃度與熒光值之間的關(guān)系，再配制不同濃度的葉綠素α溶液驗(yàn)證儀器的準(zhǔn)確度及線性。在儀器能夠準(zhǔn)確測(cè)量葉綠素α濃度的前提下，直接測(cè)量水體中微藻，以嘗試?yán)萌~綠素?zé)晒夥y(cè)量壓載水中的微藻。

2　儀器試驗(yàn)

目前開發(fā)的便攜式快速檢測(cè)設(shè)施一般在船上、海上以及戶外使用，保證在測(cè)量范圍內(nèi)其可靠性及重復(fù)性達(dá)到應(yīng)用的要求。ET 1301是一臺(tái)防水(灑水) 、不用預(yù)熱、使用5號(hào)電池運(yùn)作、受環(huán)境光線影響小、操作簡(jiǎn)便的儀器。該儀器有多個(gè)模式, 包括可同時(shí)手動(dòng)輸入水樣品的其他參數(shù), 以便在之后的數(shù)據(jù)處理中有更完整的參數(shù)。針對(duì)活體藻細(xì)胞, 使用1 mm×1 mm的熒光比色皿, 但不要求嚴(yán)格的配對(duì)使用, 令測(cè)量的操作出錯(cuò)機(jī)會(huì)更低。圖3為ET 1301便攜式葉綠素?zé)晒鈨x。整個(gè)儀器可以放在手掌上操作。儀器表面有一個(gè)放置標(biāo)準(zhǔn)熒光比色皿的樣品室、操作鍵盤和顯示屏。操作時(shí)，可以在鍵盤上輸入并顯示日期等信息。測(cè)量葉綠素α的熒光值時(shí)，會(huì)顯示出葉綠素α的濃度和生產(chǎn)量，以及原始的熒光值Fo、Fm。另有校準(zhǔn)功能供用戶定期檢查和標(biāo)定儀器。

圖3　ET 1301便攜式葉綠素?zé)晒鈨x

2.1葉綠素α標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)

將購(gòu)得的葉綠素α標(biāo)準(zhǔn)品在弱光下小心地稱取1 mg，溶于100 mL 100%甲醇中，充分混勻后，得標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10 mg/L，用鋁箔紙包覆以避光。

將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋100倍，分別檢測(cè)在665.2 nm和652.0 nm的吸光度A665.2、A652.0，經(jīng)公式Chl α= 16.29A665.2-8.54A652.0計(jì)算結(jié)果[6]，標(biāo)定葉綠素α溶液濃度為98.22 μg/L。

將此溶液分別稀釋2、5、10、20、40、100、200、400、1 000倍，用ET 1301熒光儀檢測(cè)，結(jié)果如表2所示。

表2　葉綠素α標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果

注：表中實(shí)測(cè)值為三次檢測(cè)后的平均值。

由表2可以看出，熒光法檢測(cè)葉綠素α濃度的準(zhǔn)確度和靈敏度都很好。由于是標(biāo)準(zhǔn)品，本身并沒有葉綠素生產(chǎn)量，所以其實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)都接近0。

2.2活藻的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)樣品使用采購(gòu)的單純?cè)自逡?，如圖4所示。圖中左側(cè)是活的甲藻，葉綠體仍有豐富的葉綠素；右側(cè)的是死亡的甲藻，體內(nèi)的物質(zhì)已基本分解。吸取0.5 mL注入計(jì)數(shù)板，在500倍的顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)不分是否存活，但不計(jì)算死亡后由于分解不含葉綠素的細(xì)胞。同時(shí)將原液按一定的比例稀釋，用已校準(zhǔn)過的葉綠素?zé)晒鈨x檢測(cè)其葉綠素的濃度和生產(chǎn)量，以觀察單一藻種的葉綠素濃度與個(gè)體之間的關(guān)系。所有操作過程中不使用固定劑。

圖4　測(cè)試水樣中的甲藻

由于微藻含量稀少，需多次取液觀察計(jì)數(shù)，取每次計(jì)數(shù)的平均值作為原液的原甲藻含量，約為5 560個(gè)/mL。以兩組不同的稀釋比例試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3　不同含量的原甲藻液與葉綠素濃度及其熒光值

表中原甲藻的含量由原液的含量按稀釋的比例計(jì)算而得，熒光值F0、Fm為儀器測(cè)量所得數(shù)據(jù)，葉綠素濃度和葉綠素生產(chǎn)量則是儀器由熒光值計(jì)算所得，其中儀器已自動(dòng)扣除本身的本底值。

由表3的數(shù)據(jù)可知，葉綠素?zé)晒庵礔0或葉綠素濃度與原甲藻的含量成較好的線性關(guān)系，其線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9983，而葉綠素的生產(chǎn)量與原甲藻的含量基本沒有線性關(guān)系。

因此，對(duì)單一藻種而言，通過標(biāo)定后的儀器直接檢測(cè)微藻的個(gè)數(shù)是可行的，且靈敏度高，能達(dá)到檢測(cè)近百個(gè)中型原甲藻數(shù)量。然而，表3的數(shù)據(jù)也說明，即使是單一的藻種，用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)直接檢測(cè)壓載水中低至10個(gè)/mL的微藻活體數(shù)量，還存在很大差距。

葉綠素生產(chǎn)量是葉綠素對(duì)光能量利用效率的表征，可間接表達(dá)微藻的活性，或微藻的活體量。葉綠素生產(chǎn)量與原甲藻含量沒有線性關(guān)系正說明了微藻活體量與微藻整體含量沒有關(guān)聯(lián)。

3　應(yīng)用前景

應(yīng)用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)可直接測(cè)量水體中微藻的含量, 無需萃取等樣品前處理過程。由于實(shí)際水體中含有各類藻種，且溫度、鹽度、光照等都會(huì)影響微藻生理狀況與葉綠素?zé)晒饧吧a(chǎn)量，而葉綠素?zé)晒夥y(cè)量的是葉綠素濃度和生產(chǎn)量，不能給出各種微藻活體的數(shù)量，只能是一種半定量的方法。因此，單獨(dú)使用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)檢測(cè)水體中的微藻含量，具

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有一定的局限性，特別是微藻活體含量稀少至10個(gè)/mL以下的合格壓載水。然而，葉綠素?zé)晒夥ㄗ鳛楦哽`敏度、快速、簡(jiǎn)便、無污染的檢測(cè)方法，若輔以采樣時(shí)的富集濃縮手段，對(duì)壓載水微藻含量的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)仍具有參考價(jià)值，而濃縮所需要的水體量也顯著低于傳統(tǒng)分析方法所需要的水體量。ET1301便攜式葉綠素?zé)晒鈨x設(shè)計(jì)體積小、操作簡(jiǎn)單，使用電池供電、保證本質(zhì)安全，沒有萃取、染色等前處理過程，可有效避免繁瑣的前處理過程可能產(chǎn)生的偏差，使用人員無需特別培訓(xùn)即可操作，可攜帶上船直接測(cè)量，縮減了壓載水傳統(tǒng)分析方法的取樣時(shí)間和工作量及費(fèi)用，對(duì)加快船舶的進(jìn)出港運(yùn)營(yíng)和港口國(guó)檢查(PSC)的實(shí)施也有幫助。

D-2標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于浮游植物的指標(biāo)檢測(cè)存在兩個(gè)問題：一方面，這兩個(gè)指標(biāo)限值很低，必須采集大量的水樣，并對(duì)水樣進(jìn)行濃縮，才能達(dá)到大多計(jì)數(shù)方法的檢測(cè)底限。另一方面，指標(biāo)要求將壓載水中不同種類活體數(shù)量的總和計(jì)數(shù)出來，這意味著采用的計(jì)數(shù)方法不但需能區(qū)別不同種類的生物，且能區(qū)分不同種類生物的死活。此外，港口每天要靠港大量船舶，船舶的靠港費(fèi)用昂貴，這就要求檢測(cè)耗時(shí)要盡可能短。而葉綠素?zé)晒鈨x檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)單、樣品量小、靈敏度高、可直接用活體檢測(cè)的特點(diǎn)，在國(guó)際上已獲得越來越多的認(rèn)可。

[1]黨坤，宋家慧，趙殿榮，等.船舶壓載水問題綜述[J]. 航海技術(shù)，2001(4)：60-63.

[2]廖銘勝. 《國(guó)際船舶壓載水和沉積物管理與控制公約》簡(jiǎn)介[J].交通環(huán)保，2004，25(5)：48-50.

[3]Wetzel R G, Likens G E. Limnology：Lake and River Ecosystems, 3rd edition[M]. New York: Springer,2000.

[4]Jacobsen T R. Comparison of chlorophyll a measurements by fluorometric, spectrophotometric and high pressure liquid chromatographic methods in aquatic environment[J]. Ergebnisse Der Limnologie, 1982(16):35-45.

[5]張江龍. 葉綠素監(jiān)測(cè)儀器在水質(zhì)自動(dòng)監(jiān)測(cè)應(yīng)用中的優(yōu)劣淺析[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器,2007(1):41-43.

[6]高坤山. 藻類固碳——理論、進(jìn)展與方法[M]. 北京：科學(xué)出版社,2014.

Application and Prospect of Measuring Chlorophyll Using Fluorescence Method for Ballast Water Tests

LI Jian-yi1, ZHANG Bo2, WANG Xuan3

(1.Shanghai Euro Tech Co., Ltd., Shanghai 201216, China; 2.HEBEI Maritime Safety Administration of People’s Republic of China, Qinghuangdao Hebei 066000, China;3.Shanghai Shipbuilding Technology Research Institute, Shanghai 200032, China)

The widely used Fluorescence Method is considered as the most effective way to measure chlorophyll in ballast water test and it has tremendous development prospect and application value. A new kind of chlorophyll measurement equipment with practicability, precision and effectiveness after experimental verification was proposed. Prospect of the technology and comes up with the future development and expectation was analyzed.

Fluorescence MethodChlorophyllBallast waterTest

李建誼(1962-)，男，高級(jí)工程師，主要研究方向?yàn)閮x器儀表技術(shù)。

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