邸萬(wàn)山

（遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)系，遼寧 錦州 121001）

高效液相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定奶粉中三聚氰胺

邸萬(wàn)山

（遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)系，遼寧 錦州 121001）

以雙氰胺為內(nèi)標(biāo)物，采用高效液相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定奶粉中三聚氰胺的含量，通過(guò)對(duì)色譜條件的優(yōu)化，最后確立了有效的檢測(cè)方法。樣品經(jīng)20 mL 50℃熱水，0.5g無(wú)水硫酸鎂，10 mL乙腈提取后，采用Nova-Pak C18色譜柱（3.9 mm×15 mm×5 μm）分離，以0.01 mol/L乙酸銨∶乙腈=90∶10（V∶V）作為流動(dòng)相，218 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。結(jié)果表明，雙氰胺在該條件下能夠與三聚氰胺完全分離，可以作為測(cè)定三聚氰胺的內(nèi)標(biāo)物。在0.500～1.500 mg/kg的添加范圍內(nèi)，三聚氰胺的回收率為98.2%～100.5%。精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.44%。所測(cè)定奶粉樣品中三聚氰胺為0.223 mg/kg。此法處理樣品處理簡(jiǎn)便易行，回收率、準(zhǔn)確度高，分析速度快，具有良好的重復(fù)性和再現(xiàn)性，適于測(cè)定奶粉中的三聚氰胺。

三聚氰胺；高效液相色譜法；奶粉

三聚氰胺作為一種價(jià)格低廉的有機(jī)化工原料，其最大的特點(diǎn)就是含氮量高（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為66.6%），摻假增氮效果明顯，成本低。因此，在技術(shù)上和經(jīng)濟(jì)上存在奶粉中摻加三聚氰胺的可能。研究表明，三聚氰胺長(zhǎng)期累計(jì)攝入會(huì)導(dǎo)致腎、輸尿管和膀胱結(jié)石，并有生殖系統(tǒng)損傷的可能性［1］。因此有必要對(duì)奶粉中的三聚氰胺進(jìn)行監(jiān)測(cè)，明確其實(shí)際含量，防患于未然。

奶粉中總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中使用凱氏定氮法，該方法對(duì)設(shè)備要求低，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但精度差。國(guó)家規(guī)定奶粉中殘留三聚氰胺限量＜1 mg/kg。液態(tài)奶（包括原料乳）、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg，高于2.5 mg/kg的產(chǎn)品一律不得銷售。含乳15%以上的其他食品中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg，高于2.5 mg/kg的產(chǎn)品一律不得銷售。目前，三聚氰胺的分析方法主要有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography， HPLC）［2-5］、氣質(zhì)聯(lián)用法（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）［6-7］、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）［8-11］，大多采用外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定。外標(biāo)法容易受到測(cè)定條件變化而影響測(cè)定結(jié)果。而用雙氰胺作為內(nèi)標(biāo)物測(cè)定奶粉中三聚氰胺的測(cè)定方法報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)以雙氰胺為內(nèi)標(biāo)物，探索利用高效液相色譜內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)奶粉中的三聚氰胺含量，體現(xiàn)了內(nèi)標(biāo)法測(cè)定奶粉中的三聚氰胺含量時(shí)避免了因進(jìn)樣體積、檢測(cè)器靈敏度、流速以及流動(dòng)相組成發(fā)生變化對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。具有回收率高、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)。期望為奶粉的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1原料與試劑

奶粉樣品：市售；雙氰胺、三聚氰胺：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；乙腈色譜純（0.45 μm濾膜過(guò)濾，超聲波脫氣）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm，0.50 μm膜過(guò)濾）；乙酸銨（優(yōu)級(jí)純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

810型高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司；KQ-700DB數(shù)控超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；AUW120D電子分析天平：日本島津公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1色譜檢測(cè)條件

色譜柱：Nova-PakC18（3.9mm×15mm×5μm）；流動(dòng)相：乙腈/0.01 mol/L乙酸銨（10∶90，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：λ=218 nm；靈敏度：0.2 AUFS；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3.2溶液的配制

1.0000 mg/mL雙氰胺、三聚氰胺混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取雙氰胺、三聚氰胺各0.100 0 g，用乙腈溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容、搖勻，0.45 μm濾膜過(guò)濾。

0.1000 mg/mL雙氰胺、三聚氰胺混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：準(zhǔn)確移取雙氰胺、三聚氰胺混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液10.00 mL，置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度、搖勻，0.45 μm濾膜過(guò)濾，300 W超聲波脫氣10 min。

1.3.3試樣的處理

準(zhǔn)確稱取奶粉樣品10.000 0 g于50mL具塞離心管中，加入20 mL 50℃熱水，0.5 g無(wú)水硫酸鎂，混勻，冷卻至室溫。再緩慢加入10 mL乙腈，渦旋1 min后超聲提取10 min，8 000 r/min離心5 min。將離心液全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，再向容量瓶中加入0.001 0 mg雙氰胺，溶解后加入乙腈至刻度，搖勻。0.45 μm濾膜過(guò)濾，超聲波脫氣。處理液供液相色譜測(cè)定。

1.3.4雙氰胺、三聚氰胺的定性分析

將雙氰胺-三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)使用溶液及試樣處理液10 μL在相同的色譜條件下分別注入高效液相色譜儀進(jìn)行分離，以標(biāo)準(zhǔn)使用溶液色譜峰的保留時(shí)間為依據(jù)對(duì)試樣處理液中的成分進(jìn)行定性、定量分析。

1.3.5三聚氰胺對(duì)內(nèi)標(biāo)物雙氰胺的相對(duì)響應(yīng)值

取雙氰胺-三聚氰胺混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液10 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，得到雙氰胺-三聚氰胺的峰面積。計(jì)算三聚氰胺對(duì)雙氰胺的相對(duì)響應(yīng)值。

三聚氰胺對(duì)雙氰胺的相對(duì)響應(yīng)值Sa計(jì)算公式如下：

式中：Aa、As分別為混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液中三聚氰胺、雙氰胺的峰面積；Wa、Ws分別為混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液中三聚氰胺、雙氰胺的質(zhì)量，mg。

1.3.6試樣中三聚氰胺的定量分析

取試樣處理液10 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，得到雙氰胺、三聚氰胺的峰面積，根據(jù)相對(duì)響應(yīng)值計(jì)算奶粉試樣中三聚氰胺的質(zhì)量。計(jì)算試樣中三聚氰胺含量的公式如下：

式中：W三聚氰胺表示樣品中三聚氰胺的質(zhì)量，g；W樣雙氰胺表示樣品中雙氰胺的質(zhì)量，g；A三聚氰胺表示試樣中三聚氰胺的峰面積；A樣雙氰胺表示試樣中三聚氰胺的峰面積；W樣表示樣品質(zhì)量，g。

2　結(jié)果與分析

2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)參考文獻(xiàn)［13］，三聚氰胺、雙氰胺分別在波長(zhǎng)218 nm、210 nm處有較大紫外吸收，在此基礎(chǔ)上，在波長(zhǎng)200～400 nm處進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，三聚氰胺、雙氰胺最大吸收波長(zhǎng)分別為226nm、215nm，2種物質(zhì)在波長(zhǎng)218 nm處都有明顯吸收。因此，選擇218 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1　雙氰胺、三聚氰胺紫外吸收光譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of cyandiamide and melamine

2.2內(nèi)標(biāo)物的選擇

選擇雙氰胺作為內(nèi)標(biāo)物符合以下3點(diǎn)的要求：一是奶粉試樣中不應(yīng)含有內(nèi)標(biāo)物雙氰胺；二是雙氰胺與三聚氰胺的分離度＞1.5；三是雙氰胺的加入量與三聚氰胺的峰面積匹配性＞75%［14］，故雙氰胺滿足做內(nèi)標(biāo)物的要求。

2.3標(biāo)準(zhǔn)品及樣品HPLC色譜圖

采用高效液相色譜法對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及奶粉樣品按照色譜工作條件的要求進(jìn)行檢測(cè)，所得到的色譜圖見圖2。

由圖2可知，待測(cè)樣品色譜圖中出現(xiàn)雙氰胺、三聚氰2個(gè)色譜峰與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中出現(xiàn)雙氰胺、三聚氰2個(gè)色譜峰一一對(duì)應(yīng)，并且分離效果良好。因此，雙氰胺可以作為測(cè)定三聚氰的內(nèi)標(biāo)物。

圖2　雙氰胺和三聚氰胺混合標(biāo)準(zhǔn)液（A）和奶粉試樣（B）HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of dicyandiamide and melamine mixed standard（A）and milk powder sample（B）

2.4精密度的測(cè)定

取三聚氰胺標(biāo)樣，平行進(jìn)樣5次，檢測(cè)到三聚氰胺標(biāo)樣的相對(duì)響應(yīng)值分別為1.105、1.092、1.098、1.095、1.097，平均值為1.097。計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），RSD值為0.44%。結(jié)果顯示，該方法的精密度高，能滿足奶粉中三聚氰胺的分析要求。

2.5加標(biāo)回收率試驗(yàn)

在已知含量的試樣中分別加入不同質(zhì)量濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1　奶粉中三聚氰胺加標(biāo)回收率結(jié)果Table 1 Standard addition recovery results of melamine in milk powder

從表1可以看出，三聚氰胺在0.500 0～1.500 0 mg/kg添加范圍內(nèi)，其回收率為98.2%～100.5%，表示該方法的準(zhǔn)確度較高。

2.6奶粉樣品的檢測(cè)

對(duì)奶粉供試液進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算其三聚氰胺的含量，結(jié)果見表2。由表2可知，待測(cè)奶粉中三聚氰胺的含量平均值為0.223 mg/kg。國(guó)家規(guī)定奶粉中殘留三聚氰胺限量＜1 mg/kg，該奶粉樣品達(dá)到質(zhì)量要求。

表2　奶粉中三聚氰胺的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection results of melamine content in milk powder

3　結(jié)論

通過(guò)以雙氰胺作為測(cè)定三聚氰胺的內(nèi)標(biāo)物，建立了高效液相色譜內(nèi)標(biāo)法在測(cè)定乳制中三聚氰胺的方法。該方法在三聚氰胺0.500 0～1.500 0 mg/kg添加范圍內(nèi)，其回收率為98.2%～100.5%；精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.44%；反映了內(nèi)標(biāo)法避免了因進(jìn)樣體積、檢測(cè)器靈敏度、流速以及流動(dòng)相組成發(fā)生變化對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響［15］。具有回收率高、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)。該方法分析速度快，成本低，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，具有良好的重復(fù)性和再現(xiàn)性等優(yōu)點(diǎn)，是一種很好的檢測(cè)乳制中的三聚氰胺的方法，易于推廣，適用于實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)工作。

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Determination of melamine in milk powder by HPLC internal standard method

DI Wanshan

（Department of Applied Chemistry，Liaoning Petrochemical Vocational and Technical College，Jinzhou 121001，China）

With dicyandiamide as internal standard，the content of melamine in milk powder was determined by HPLC internal standard method. The effective detection method was finally established by optimizing chromatographic conditions.Sample was extracted by 50℃hot water 20 ml，anhydrous magnesium sulfate 0.5 g and methyl cyanide 10 ml，separated by Nova-Pak C18chromatographic column（3.9 mm×15 mm×5 μm），with 0.01 mol/L ammonium acetate∶acetonitrile=90∶10（V∶V）as mobile phase，218 nm as detection wavelength.The results showed that the dicyandiamide was completely separated with melamine，and it can be used as the internal standard determination of melamine.Within the limits of adding 0.500-1.500 mg/kg，the recovery was 98.2%-100.5%，the relative standard deviation of precision results was 0.44%.The determination of melamine in milk powder samples was 0.223 mg/kg.The method was easy，simple，with high recovery and accuracy，fast analysis speed，with good repeatability and reproducibility.It was suitable for determination of melamine in milk powder.

melamine；HPLC；milk powder

TS207.3

0254-5071（2016）03-0145-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.033

2015-12-01

邸萬(wàn)山（1966-），男，副教授，本科，研究方向?yàn)楣I(yè)分析、食品分析與環(huán)境分析。