張林霞，李曉東

(河北省唐山市工人醫(yī)院：1.老年病三科；2.腎內(nèi)科　063000)

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乙醛對人腎小管上皮細胞合成分泌TGF-β1的影響研究

張林霞1，李曉東2△

(河北省唐山市工人醫(yī)院：1.老年病三科；2.腎內(nèi)科063000)

目的通過研究乙醛對體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞合成分泌轉化生長因子-β1(TGF-β1)的影響，以探討乙醛導致腎小管間質(zhì)纖維化的機制。方法選取人腎小管上皮細胞(HK-2細胞)培養(yǎng)于含5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中。以不同濃度的乙醛(0、50、100、200、400 μmol/L)刺激HK-2細胞24 h。逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測HK-2細胞中TGF-β1的基因表達；蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測細胞中TGF-β1的蛋白表達。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的水平。結果RT-PCR和Western blot結果顯示，乙醛呈劑量依賴性地增加HK-2細胞中TGF-β1基因和蛋白的表達；ELISA法結果顯示，乙醛呈劑量依賴性地增加HK-2細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的水平。結論乙醛能夠促進體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞合成分泌TGF-β1，從而促進腎小管間質(zhì)纖維化的進展。

乙醛；腎小管上皮細胞；轉化生長因子-β1；腎小管間質(zhì)纖維化

眾所周知，長期大量飲酒會導致肝臟損害，嚴重時可造成酒精性肝硬化。機體攝入大量的乙醇后，約90%在肝臟乙醇脫氫酶的作用下轉化為乙醛，并進入血液循環(huán)。腎臟是僅次于肝臟的乙醇排泄器官。乙醇及其代謝產(chǎn)物通過腎臟排泄到尿中，尿中乙醇及代謝產(chǎn)物的水平高于肝臟及血液中的水平[1]。因此，長期過量飲酒也可導致乙醇性腎損害[2]。動物實驗表明，乙醇性腎損傷病理表現(xiàn)為腎小管間質(zhì)的炎癥改變及纖維化[3]，但其作用機制目前尚不清楚。轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是目前公認的促進腎小管間質(zhì)纖維化的關鍵性的細胞因子[4]。本實驗通過研究乙醇的代謝產(chǎn)物乙醛對體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞合成分泌TGF-β1的影響，為明確乙醇導致腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料人近端腎小管上皮細胞(HK-2細胞株)由唐山市工人醫(yī)院中心實驗室保存。乙醛購自天津鼎盛鑫化工有限公司，逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒為美國Promega公司產(chǎn)品，PCR引物由上海生工合成。兔抗人TGF-β1多克隆抗體、小鼠抗人Tubulin單克隆抗體購自美國Santa Cruze公司。堿性磷酶標記山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋公司，BCIP/NBP顯色試劑盒購自上海碧云天。TGF-β1ELISA試劑盒購自美國R & D公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)將HK-2細胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中。實驗前換成無血清培養(yǎng)液同步化24 h。參照有關文獻[5]，分別加入含終濃度為0、50、100、200、400 μmol/L乙醛的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細胞或培養(yǎng)上清液進行實驗。

1.2.2逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測TGF-β1基因表達應用0.25%胰酶和0.02% EDTA消化收集細胞，應用TRIzol試劑提取細胞總RNA，測定A260/A280=1.8～2.0，計算其水平。取1 μg總RNA反轉錄為cDNA。引物設計參考有關文獻[6]。TGF-β1(306 bp)：上游引物5′- AGG TCA CCC GCG TGC TAA T -3′，下游引物5′- TCA ACC ACT GCC GCA CAA CT -3′ 。β-actin (202 bp)：上游引物5′-CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCT G-3′，下游引物5′-GGA GCA ATG ATC TTG ATC TTC-3′ 。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共28個循環(huán)后，72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中觀察結果，應用Bio-Rad聯(lián)機專用軟件分析電泳條帶灰度值。

1.2.3蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測TGF-β1蛋白表達應用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化收集細胞，加入含PMSF的細胞裂解液，冰上放置30 min，4 ℃ 12 000 g/min離心5 min提取總蛋白。BCA法檢測蛋白水平。取20 μg總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入兔抗人TGF-β1多克隆抗體(1∶800)和小鼠抗人Tubulin單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜。洗膜后分別加入堿性磷酶標記的山羊抗兔(1∶1 000)、山羊抗小鼠二抗(1∶1 000)，BCIP/NBT顯色。應用Image J圖像分析軟件分析TGF-β1及Tubulin條帶的灰度值。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的水平收集細胞培養(yǎng)上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的水平。

2　結　　果

2.1乙醛對細胞中TGF-β1基因表達的影響正常HK-2細胞中有少量的TGF-β1的基因表達，50 μmol/L乙醛刺激HK-2細胞24 h后TGF-β1的基因表達較對照組比較明顯增強(P<0.05)；隨著乙醛濃度的升高，TGF-β1的基因表達量明顯增加，并具有一定的濃度依賴性。見圖1。

圖1　乙醛對TGF-β1基因表達的影響

2.2乙醛對細胞中TGF-β1蛋白表達的影響正常HK-2細胞中有少量的TGF-β1的蛋白表達，50 μmol/L乙醛刺激HK-2細胞24 h后TGF-β1的蛋白表達量沒有顯著增加(P>0.05)，但100 μmol/L乙醛刺激HK-2細胞24 h后TGF-β1的蛋白表達較對照組比較明顯增加(P<0.05)；隨著乙醛濃度的升高，TGF-β1的蛋白表達量明顯增加，具有一定的濃度依賴性。見圖2。

2.3乙醛對細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的水平的影響正常HK-2細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的水平很低(216.42±60.75)μg/L，100 μmol/L乙醛刺激HK-2細胞24 h后培養(yǎng)上清液中TGF-β1的水平開始增加(325.72±74.52)μg/L，較對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著乙醛濃度的升高，培養(yǎng)上清液中TGF-β1的水平明顯增加，分別為(515.72±49.08)μg/L、(585.08±78.03)μg/L，具有一定的濃度依賴性。

圖2　乙醛對TGF-β1蛋白表達的影響

3　討　　論

長期大量飲酒可導致全身多臟器損害。機體攝入乙醇后約90%在肝臟代謝，攝入的乙醇在肝臟乙醇脫氫酶的作用下轉化為乙醛并進入血液循環(huán)。肝臟是乙醇代謝的主要器官，也是最容易損傷的器官。乙醛能夠刺激肝星狀細胞活化、增殖，α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、I型膠原及TGF-β1的表達明顯增加，是形成乙醇性肝硬化的中心環(huán)節(jié)[7-8]。由于腎臟的血供豐富，過量飲酒后，超過肝臟的代謝能力，容易導致過量的乙醇、乙醛在腎臟蓄積，從而引起腎臟損害。乙醇灌胃導致的大鼠腎損傷模型，病理表現(xiàn)為腎小管間質(zhì)炎性細胞浸潤，α-SMA表達陽性[9]，促纖維化的細胞因子TGF-β1的表達明顯增強[10]，最終導致腎小管間質(zhì)纖維化。

TGF-β1是目前公認的導致腎小管間質(zhì)纖維化作用最強的細胞因子。本課題建立了乙醇的代謝產(chǎn)物乙醛導致腎小管上皮細胞損傷的體外模型。進一步研究證實，乙醛能夠促進體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞合成分泌TGF-β1。TGF-β1可能通過自分泌或旁分泌的方式，導致腎小管上皮細胞凋亡、轉分化為肌成纖維細胞、促進致炎性細胞因子的釋放等環(huán)節(jié)[11-13]，促進腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展。采取措施阻斷乙醛對腎小管上皮細胞內(nèi)TGF-β1的合成及分泌，對減輕乙醛對腎小管上皮細胞的損傷，保護腎小管上皮細胞功能，延緩腎小管間質(zhì)纖維化的進展具有一定的臨床意義。

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Effects of acetaldehyde on synthesis and secretion of TGF-β1in human renal tubular epithelial cells

Zhang Linxia1,Li Xiaodong2△

(1.Third Department of Geriatrics;2.Department of Nephrology,Tangshan City Workders′ Hospital, Tangshan,Hebei 063000,China)

ObjectiveTo investigate the effects of acetaldehyde on synthesis and secretion of transforming growth factor-β1(TGF-β1) in human renal tubular epithelial cells,and to explore the mechanism of alcohol induced renal tubulointerstitial fibrosis.MethodsIn vitro,the human renal tubular epithelial cells (HK-2 cell line) were cultured in DMEM/F12 medium supplemented with 5% fetal bovine serum.The cells were exposed to acetaldehyde at various concentrations (0,50,100,200 and 400 μmol/L) for 24 h.The expression of TGF-β1gene in HK-2 cells was detected by RT-PCR;and the expression of TGF-β1protein was detected by Western blot;The content of TGF-β1in the supernatant of the cells was measured by ELISA assay.ResultsRT-PCR and Western blot results showed that acetaldehyde increased the expressions of TGF-β1gene and protein in HK-2 cells in a dose-dependent manner.The results of ELISA method showed that acetaldehyde increased the content of TGF-β1in the supernatant of HK-2 cells in a dose-dependent manner.ConclusionAcetaldehyde can promote the synthesis and secretion of TGF-β1in cultured human renal tubular epithelial cells in vitro,thus promoting the progress of renal tubulointerstitial fibrosis.

acetaldehyde;renal tubular epithelial cells;transforming growth factor-β1;renal tubulointerstitial fibrosis

張林霞(1971-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事腎臟方面的研究?！?/p>

，E-mail:2460789769@qq.com。

論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.005

R392.11

A

1671-8348(2016)22-3038-02

2016-02-25

2016-04-11)