趙興秀，何義國(guó)，趙長(zhǎng)青，方春玉，張 靜，鄒 偉（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

產(chǎn)醬香功能菌的篩選及其風(fēng)味物質(zhì)研究

趙興秀，何義國(guó)，趙長(zhǎng)青，方春玉，張 靜，鄒 偉
（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

本實(shí)驗(yàn)從四川某酒廠醬香型大曲中分離得到5株形態(tài)各異的菌株，分別進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色和感官評(píng)價(jià)篩選出產(chǎn)醬香菌，然后用HS-SPME結(jié)合GC-MS對(duì)醬香成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明，BL-1、BL-2和BL-5三株菌具有產(chǎn)醬香特性，生理生化分析初步判定三株菌都為枯草芽孢桿菌，HS-SPME和GC-MS檢測(cè)結(jié)果顯示，三株菌的醬香成分中吡嗪類、酮類種類和含量都較多，BL-1吡嗪類和酮類的相對(duì)含量為75.286%，BL-2的吡嗪類和酮類的相對(duì)含量為93.803%，BL-5吡嗪類和酮類的相對(duì)含量為86.92%，吡嗪和酮類對(duì)醬香風(fēng)味的貢獻(xiàn)較大。

枯草芽孢桿菌，醬香，GC-MS

醬香型白酒是我國(guó)白酒行業(yè)比較典型和有特色的種類之一，其風(fēng)味具有醬香突出、優(yōu)雅細(xì)膩、醇厚豐滿、空杯留香等特點(diǎn)［1］，廣受消費(fèi)者的喜愛。醬香型白酒主體香成分一直是白酒行業(yè)的研究熱點(diǎn)［2］，高溫堆積是醬香型白酒和濃醬結(jié)合型白酒普遍使用的重要環(huán)節(jié)，其目的是使糟醅中的淀粉、蛋白質(zhì)酶解成糖和氨基酸，進(jìn)行反應(yīng)而生成香味物質(zhì)［3-4］。胡國(guó)棟等認(rèn)為：醬香型白酒以呋喃化合物、芳香族化合物和吡嗪化合物為特征性成分［5］。莊名揚(yáng)表示，醬香的特征物質(zhì)為2，3-2H-3，5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮等，醬香型酒最突出的特點(diǎn)是總酸含量高［6］。醬香型白酒的主體特征香氣成分究竟是什么，是許多學(xué)者和釀酒大師一直爭(zhēng)論的問(wèn)題，如果從產(chǎn)醬香細(xì)菌的角度來(lái)分析醬香型白酒的主要呈香物質(zhì)，將為醬香型白酒的主體特征香氣成分研究提供一種新的思路和方法。本實(shí)驗(yàn)從醬香型大曲中篩選出五株形態(tài)各異的菌株，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和感官評(píng)價(jià)得到三株產(chǎn)醬香的菌株，分別命名為BL-1、BL-2和BL-5，經(jīng)生理生化反應(yīng)對(duì)其進(jìn)行鑒定。以小麥固體為培養(yǎng)基采取35、45 和55℃升溫梯度培養(yǎng)，復(fù)合發(fā)酵6 d后產(chǎn)生醬香氣味，并用HS-SPME結(jié)合GC-MS對(duì)醬香成分進(jìn)行分析，探索醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程中最主要的風(fēng)味物質(zhì)及其含量，以期對(duì)改善酒體質(zhì)量提供實(shí)際指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醬香型大曲 為四川郎酒集團(tuán)提供。

手動(dòng)SPME進(jìn)樣器和65 μm PDMS/DVB固相微萃取頭 美國(guó)Supelco公司；GC-MS（6890N-5973） 美國(guó)Agilent；生化培養(yǎng)箱（SHP） 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；WFJ7200型紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏5，瓊脂20，NaCl 5，pH7.0，1×105Pa，121℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：將小麥麥粒粉碎，加等量水，潤(rùn)浸18 h后，蒸熟、冷卻、打散，稱取適量于三角瓶中，1×105Pa，121℃滅菌30 min。

1.2.2 材料預(yù)處理 將大曲碾碎后稱取25 g溶入到225 mL無(wú)菌生理鹽水中，充分振蕩搖勻，備用。

1.2.3 產(chǎn)醬香菌株的篩選 將處理好的大曲樣品制備成10-2～10-6的菌懸液，涂布在分離培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)48 h，取其中具有典型特征的菌落進(jìn)行純化［7］。

“肇慶市水上搜救分中心收到，請(qǐng)你船立即組織船員拋錨控制船舶，并對(duì)油艙進(jìn)行堵漏，防止溢油；同時(shí)對(duì)濃硫酸罐體破孔進(jìn)行堵漏，防止泄漏擴(kuò)大，我中心馬上組織力量前往救助?！?/p>

復(fù)篩：將純化后的菌落用無(wú)菌生理鹽水洗脫后，取2 mL接種到25 mL液體培養(yǎng)基中，于37℃搖床（轉(zhuǎn)速：160 r/min）培養(yǎng)24 h，再取2 mL菌懸液接種到小麥培養(yǎng)基上進(jìn)行梯度升溫培養(yǎng)（0～2 d，培養(yǎng)溫度35℃，相對(duì)濕度50%；2～4 d，培養(yǎng)溫度45℃，相對(duì)濕度60%；4～6 d，培養(yǎng)溫度55℃，相對(duì)濕度70%）。然后對(duì)不同菌株培養(yǎng)基褐變（美拉德反應(yīng)）和產(chǎn)香情況進(jìn)行感官評(píng)定［7］，從中篩選出產(chǎn)醬香的菌株。

1.2.4 產(chǎn)醬香細(xì)菌的生理生化實(shí)驗(yàn) 參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）的生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定，分別對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行糖酵解、乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)、甲基紅、檸檬酸鹽等實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 產(chǎn)醬香菌株發(fā)酵香味物質(zhì)HS-SPME和GC-MS分析［8］取3 g發(fā)酵6 d的發(fā)酵樣品于萃取瓶中，用頂空萃取方法，將萃取頭插入萃取瓶中，先平衡5 min，再60℃加熱萃取50 min。萃取后將萃取針打入氣質(zhì)聯(lián)用儀，當(dāng)出現(xiàn)峰時(shí)，可拔出萃取針。

色譜分離條件：進(jìn)口溫度250℃；氦載氣流速1.0 mL/min；色譜柱：HP-5MS 5%Pheny Methyl Siloxance（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。升溫程序：柱溫50℃（保留2 min），以5℃/min升溫至280℃，保持2 min。

質(zhì)譜條件：離子源為EI，離子源溫度230℃，電離能70 eV，倍增器電壓380 V，接口溫度280℃，發(fā)射電流34.6 mA，掃描范圍10～550 u。

GC-MS圖譜中所得各組分及含量由安捷倫工作站分析得出。

2 結(jié)果與討論

2.1 初篩特征菌株及感官評(píng)定

初篩后得到了5株具有典型特征的細(xì)菌分別命名為BL-1、BL-2、BL-3、BL-4、BL-5，將其在小麥培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d，記錄每株功能菌在不同時(shí)間的產(chǎn)香情況及培養(yǎng)基褐變情況，如表1、表2所示。

從表1可以看出，BL-1、BL-2和BL-5具備一定的產(chǎn)香能力，其中，BL-1有淡淡的芝麻香味，BL-2有淡淡的醬香味，同時(shí)帶有油味，BL-5有醬香味，帶有酸味。而BL-3和BL-4不具備產(chǎn)醬香能力。一般來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基褐變可視為美拉德反應(yīng)，美拉德反應(yīng)能夠一定程度上體現(xiàn)培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性香氣的情況［9］，其中，BL-1、BL-2、BL-3和BL-5有褐變，且都不同程度產(chǎn)生醬香味（BL-3除外），而BL-4無(wú)明顯褐變，表明BL-4未發(fā)生美拉德反應(yīng)。

2.2 復(fù)篩菌落特征

經(jīng)固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩后，僅有BL-1、BL-2、BL-5這3株細(xì)菌產(chǎn)醬香氣味。圖1～圖3是篩選出產(chǎn)醬香細(xì)菌的菌落形態(tài)和革蘭氏染色后的圖像。

BL-1菌落形態(tài)：菌落呈圓形，周圍光滑，表面濕潤(rùn)，中間凸起，粘稠，易挑取，不透明。正反兩面顏色一致菌落直徑1～2 mm；BL-1個(gè)體形態(tài)：柱狀，染色均勻，革蘭氏染色呈紫色。

表1 發(fā)酵4 d后培養(yǎng)基褐變及產(chǎn)香情況Table1 The browning of medium and flavor producing after 4 days

表2 發(fā)酵6 d后培養(yǎng)基褐變及產(chǎn)香情況Table2 The browning of medium and flavor producing after 6 days

圖1 BL-1菌落形態(tài)（A）以及革蘭氏鏡檢圖片（B）Fig.1 The colony morphology（A）and gram microscopic examination（B）of BL-1

圖2 BL-2菌落形態(tài)（A）以及革蘭氏鏡檢圖片（B）Fig.2 The colony morphology（A）and gram microscopic examination（B）of BL-2

BL-2菌落形態(tài)：柱狀，兩端橢圓，染色均勻，革蘭氏染色為紫色。

圖3 BL-5菌落形態(tài)（A）以及革蘭氏鏡檢圖片（B）Fig.3 The colony morphology（A）and gram microscopic examination（B）of BL-5

BL-5菌落形態(tài)：菌落呈圓形，表面濕潤(rùn)，正反兩面顏色一致，為乳白色，菌落易挑取，革蘭氏染色呈紫色。

通過(guò)感官評(píng)定，篩選出BL-1、BL-2和BL-5三株產(chǎn)醬香較好的細(xì)菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 功能細(xì)菌生理生化反應(yīng)鑒定結(jié)果

參見《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》產(chǎn)醬香的BL-1、BL-2、BL-5菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3所示。

從表3中得出：對(duì)于可產(chǎn)醬香氣味的BL-1、BL-2 和BL-5細(xì)菌都可以分解葡萄糖和甘露醇，同時(shí)產(chǎn)酸；在無(wú)氧的情況下，這3株菌不能生長(zhǎng)；它們可以產(chǎn)生分解酪素、淀粉和明膠的酶類物質(zhì)；在乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)和過(guò)氧化氫酶促實(shí)驗(yàn)中，三株菌鑒定均呈陽(yáng)性；都能在5%和7%的NaCl的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；BL-1和BL-2在甲基紅實(shí)驗(yàn)中呈陽(yáng)性，BL-5在甲基紅實(shí)驗(yàn)中呈陰性。

將上述結(jié)果對(duì)比《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌分類手冊(cè)》，所篩選出的三株菌的生理生化特性與枯草芽孢桿菌幾乎符合。僅僅BL-5在甲基紅實(shí)驗(yàn)中呈陰性這一反應(yīng)和枯草芽孢桿菌的生理生化反應(yīng)不一致，其他生理生化反應(yīng)和枯草芽孢桿菌一致。結(jié)合所觀察到的菌落形態(tài)以及菌株個(gè)體形態(tài)特征，判定BL-1、BL-2 和BL-5三株菌為枯草芽孢桿菌，將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中通過(guò)16s DNA進(jìn)行分子鑒定。

表3 產(chǎn)醬香細(xì)菌生理生化反應(yīng)結(jié)果Table3 The physiological and biochemical response of the sauce-producing strains

2.4 產(chǎn)醬香菌株發(fā)酵產(chǎn)物的GC-MS檢測(cè)

2.4.1 BL-1菌株發(fā)酵液中產(chǎn)揮發(fā)性化合物GC-MS圖譜及檢測(cè) BL-1菌株發(fā)酵6 d后，用固相微萃取及GC-MS檢測(cè)其發(fā)酵液的揮發(fā)性物質(zhì)，其GC-MS圖譜如圖4所示，揮發(fā)性成分檢測(cè)結(jié)果如表4所示。

圖4 BL-1香氣成分GC-MS圖譜Fig.4 The GC/MS spectra of the aroma from BL-1

由表4可知，BL-1菌株發(fā)酵液中共檢測(cè)出12種風(fēng)味物質(zhì)，其中吡嗪類3種，相對(duì)含量為43.175%，2，3，5，6-四甲基吡嗪的含量最高為30.737%，吡嗪是白酒中重要的香氣化合物，在醬香、芝麻香等采用高溫曲發(fā)酵的白酒中普遍存在，賦予白酒有益健康的功效［11］；酮類2種，相對(duì)含量為32.111%；醛類1種，相對(duì)含量為19.063%；醇類2種，相對(duì)含量為0.718%；2，4，5-三甲基唑的相對(duì)含量為2.283%；剩余三種分別為L(zhǎng)-胱氨酸（0.671%）、順-烏頭酸酐（0.501%）和1，3-二甲氧基丙烷（1.007%）。

表4 BL-1發(fā)酵液中揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果Table4 The volatile substances of BL-1 broth

表5 BL-2發(fā)酵液中揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果Table5 The volatile substances of BL-2 broth

2.4.2 BL-2菌株發(fā)酵液中揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS圖譜及檢測(cè)結(jié)果 BL-2菌株發(fā)酵6 d后，用固相微萃取及GC-MS檢測(cè)其發(fā)酵液的揮發(fā)性物質(zhì)，其GC-MS圖譜如圖5，揮發(fā)性成分檢測(cè)結(jié)果如表5所示。

圖5 BL-2香氣成分GC-MS圖譜Fig.5 The GC/MS spectra of the aroma from BL-2

由表5可知，BL-2菌株發(fā)酵液中共檢測(cè)出9種風(fēng)味物質(zhì)，其中吡嗪類3種，相對(duì)含量為50.461%，2，3，5，6-四甲基吡嗪的含量為33.152%；酮類2種，相對(duì)含量為43.342%，其中，3-羥基-2-丁酮的含量最高為35.463%；醛類1種，相對(duì)含量為2.236%；醇類1種，相對(duì)含量為0.369%；其余三種分別為右旋萜二烯（2.056%）、石炭酸（1.326%）和2，3-丁二醇（0.369%）。

2.4.3 BL-5菌株發(fā)酵后產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS圖譜及檢測(cè)結(jié)果 BL-5菌株發(fā)酵6 d后，用固相微萃取及GC-MS檢測(cè)其發(fā)酵液的揮發(fā)性物質(zhì)，其GC-MS圖譜如圖6，揮發(fā)性成分檢測(cè)結(jié)果如表6所示。

圖6 BL-5香氣成分GC-MS圖譜Fig.6 The GC/MS spectra of the aroma from BL-3

由表6可知，BL-5菌株發(fā)酵液中共檢測(cè)出10種風(fēng)味物質(zhì)，其中吡嗪類3種，相對(duì)含量為45.955%，2，5-二甲基吡嗪的含量為26.902%；酮類1種，3-羥基-2-丁酮的含量為40.965%；酯類1種，相對(duì)含量為1.961%；醇類1種，相對(duì)含量為4.392%；雙乙酰的相對(duì)含量為3.059%，其余三種分別為右旋萜二烯（0.851%）、石炭酸（1.297%）和2-氨基丁烷（1.519%）。

表6 BL-5菌種發(fā)酵后產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果Table6 The volatile substances of BL-5 broth

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)采用稀釋涂布平板法從醬香型大曲中分離篩選出三株菌落形態(tài)各異的產(chǎn)醬香香氣的細(xì)菌，分別定名為BL-1、BL-2、BL-5。產(chǎn)醬香細(xì)菌在小麥固體培養(yǎng)基上以梯度升溫培養(yǎng)6 d后產(chǎn)生醬香氣味，說(shuō)明升溫梯度培養(yǎng)可以促進(jìn)醬香味的產(chǎn)生。

3.2 從醬香型大曲中篩選出的三株產(chǎn)醬香的細(xì)菌，其革蘭氏染色都呈陽(yáng)性，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征并結(jié)合生理生化反應(yīng)初步判定該菌為枯草芽孢桿菌。

3.3 經(jīng)HS-SPME和GC-MS對(duì)醬香成分進(jìn)行分析，三株菌的醬香成分中吡嗪類和酮類種類和含量都較多，對(duì)醬香型白酒風(fēng)味的貢獻(xiàn)較大。其中，BL-1的吡嗪類3種，相對(duì)含量為43.175%，酮類2種，相對(duì)含量為32.111%；BL-2吡嗪類3種，相對(duì)含量為50.461%，酮類2種，相對(duì)含量為43.342%；BL-5吡嗪類3種，相對(duì)含量為45.955%，酮類1種，相對(duì)含量為40.965%。

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Screening of sauce flavor producing bacteria and flavor compounds research

ZHAO Xing-xiu，HE Yi-guo，ZHAO Chang-qing，F(xiàn)ANG Chun-yu，ZHANG Jing，ZOU Wei
（College of Biological Engineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，China）

Five different forms of strain were isolated from a winery in Sichuan sauce flavor Daqu，colony morphology，Gram stain and sensory evaluation of which were conducted and sauce producing bacteria was screened，and the sauce flavor compounds were analyzed by HS-SPME combined with GC-MS.The results showed that，BL-1，BL-2 and BL-5 could produce sauce flavor，which were Bacillus subtilis analyzed by the physiological and biochemical mechods.The results detected by HS-SPME and GC-MS showed that the type and content of pyrazine and ketones were more than others among the sauce ingredients of the three strain.The relative content of pyrazines and ketones in BL-1 was 75.286%，and the relative content of pyrazines and ketones in BL-2 was 93.803%，and the relative content of pyrazines and ketones in BL-5 was 86.92%，which showed that pyrazine and ketones were greater contribution on producing sauce flavor than others.

Bacillus subtilis；sauce flavor；GC-MS

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0196-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.032

2015－07－27

趙興秀（1977-），女，碩士，副教授，主要從事微生物方面的研究，E-mail：zhaoxingxiu@sohu.com。

釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（NJ2012-16）；瀘州老窖科研獎(jiǎng)學(xué)金項(xiàng)目（13ljzk05）；四川省教育廳項(xiàng)目（14ZA0206）；綠色催化四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（LYJ1304）；四川理工學(xué)院科研項(xiàng)目（2012PY08，2015PY02）。