王　帥，陳根元，賈琦珍，張　玲，馬春暉,3

(1 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；2 塔里木大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；3 石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000)

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小花棘豆中毒對(duì)家兔丘腦-垂體-性腺軸α-甘露糖苷酶的影響

王帥1,2，陳根元1，賈琦珍1，張玲1,2，馬春暉1,3

(1 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；2 塔里木大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；3 石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000)

【目的】 探討小花棘豆中毒對(duì)家兔丘腦-垂體-性腺軸α-甘露糖苷酶(AMA)的影響，揭示小花棘豆的毒性作用機(jī)理?！痉椒ā?將24只家兔隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，對(duì)照組飼喂青干草，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別飼喂添加15%，30%和45%小花棘豆全草的混合飼料(其苦馬豆素含量分別為30，60和90 mg/kg)，分別于攻毒后第14，35和70 天時(shí)每組隨機(jī)采集2只家兔的丘腦、垂體和性腺，檢測(cè)AMA在家兔丘腦-垂體-性腺軸中的分布、活性及其基因mRNA的表達(dá)量。【結(jié)果】 AMA在家兔丘腦、垂體和性腺中均有分布，小花棘豆中毒可導(dǎo)致家兔丘腦-垂體-性腺軸AMA活性和分布明顯下降。試驗(yàn)組及對(duì)照組家兔丘腦-垂體-性腺軸高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ(AMA1)和溶酶體α-甘露糖苷酶(AMA2)均有表達(dá)，但各試驗(yàn)組表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平總體低于對(duì)照組，攻毒第70天時(shí)試驗(yàn)Ⅰ組家兔丘腦-垂體-性腺軸的AMA1和AMA2，試驗(yàn)Ⅱ組家兔丘腦-垂體-性腺軸及試驗(yàn)Ⅲ組家兔丘腦和垂體中AMA2的表達(dá)均與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)Ⅲ組家兔丘腦-垂體-性腺軸和試驗(yàn)Ⅱ組家兔丘腦、垂體、睪丸中AMA1 mRNA表達(dá)量均極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，試驗(yàn)Ⅱ組卵巢AMA1 mRNA表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，試驗(yàn)Ⅲ組家兔睪丸和卵巢AMA2 mRNA表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。【結(jié)論】 小花棘豆中毒可影響家兔丘腦-垂體-性腺軸AMA的活性及其基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

小花棘豆；苦馬豆素；α-甘露糖苷酶；丘腦-垂體-性腺軸

小花棘豆是廣泛分布于新疆天然草原的有毒植物之一，具有耐旱、耐貧瘠、返青早、生命力強(qiáng)、繁殖系數(shù)高等特點(diǎn)，已嚴(yán)重危害新疆草原畜牧業(yè)的發(fā)展[1]。目前僅南疆阿克蘇、和田地區(qū)廣泛叢生小花棘豆的草場(chǎng)面積已超過(guò)20%，每年因采食小花棘豆而中毒的家畜占放牧家畜總數(shù)的5%～10%，其中約50%的中毒家畜死亡。中毒家畜表現(xiàn)為機(jī)體的廣泛性損傷，其中尤以神經(jīng)系統(tǒng)和繁殖系統(tǒng)最為明顯[2]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，苦馬豆素(Swainsonine，SW)是小花棘豆的主要毒性成分[3]，其可通過(guò)抑制α-甘露糖苷酶(α-Mannosidase，AMA)活性，導(dǎo)致機(jī)體甘露糖代謝發(fā)生異常而表現(xiàn)出毒性作用[4-5]。AMA按其在亞細(xì)胞器中的分布可分為高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ(AMA1)和溶酶體α-甘露糖苷酶(AMA2)等，AMA活性是動(dòng)物小花棘豆中毒特異性最強(qiáng)的指標(biāo)[6]，中毒動(dòng)物的AMA活性受到明顯抑制，但中毒對(duì)其基因轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工修飾等的影響尚不清楚，而且中毒動(dòng)物繁殖系統(tǒng)AMA活性及表達(dá)的變化也未見相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)以新疆南疆地區(qū)小花棘豆為試驗(yàn)材料，采用ELISA、免疫組化和熒光實(shí)時(shí)定量PCR法研究了小花棘豆攻毒對(duì)家兔丘腦-垂體-性腺軸AMA活性、分布及其基因mRNA表達(dá)的影響，為小花棘豆的中毒機(jī)制研究提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

家兔24只，雌雄各半，體質(zhì)量(2.0±0.1) kg/只，均由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)站提供。

小花棘豆，2014年6月下旬采集于阿克蘇市烏什縣奧特貝希鄉(xiāng)，由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)學(xué)科組鑒定。取植株的地上部分，陰干、保存?zhèn)溆谩?/p>

AMA檢測(cè)試劑盒和S-P超敏組化試劑盒，南京建成生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒Hot-start PCR Mix、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix ExTaqTMⅡ，均為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。試驗(yàn)用水為超純水。

5331型PCR儀、Realplex2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，德國(guó)Eppendorf；PowerWave XS型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)BIO-RAD；DYY-Ⅱ型電泳儀，北京六一；PRO250型組織勻漿儀，美國(guó)Pro Scientific；GELDOC-IT型凝膠成像分析儀，美國(guó)UVP。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

將24只家兔隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，每組6只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水。對(duì)照組家兔飼喂青干草，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組家兔分別飼喂含15%，30%和45%粉碎小花棘豆的混合飼料(SW含量分別為30，60和90 mg/kg)攻毒。試驗(yàn)持續(xù)70 d。分別在攻毒后第14，35和70天每組隨機(jī)取雄兔和雌兔各1只，剖殺后分別取丘腦、垂體和性腺(睪丸或卵巢)，各組織部分進(jìn)行免疫組化染色分析；部分利用冰生理鹽水制成100 g/L的組織勻漿液用于AMA活性檢測(cè)；部分組織液氮保存，用于檢測(cè)mRNA水平表達(dá)的影響。所有解剖工具及凍存管均預(yù)先用DEPC水處理。

1.3小花棘豆對(duì)家兔丘腦-垂體-性腺軸中AMA分布的影響

家兔丘腦、垂體、睪丸和卵巢組織均使用體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋。對(duì)包埋組織進(jìn)行連續(xù)切片，片厚6 μm，二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水，然后按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫組化染色，其中生物素標(biāo)記的第二抗體稀釋比為1∶100，DAB顯色。常規(guī)脫水，透明，封片，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化，采用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)免疫組化獲得照片進(jìn)行分析。

1.4小花棘豆對(duì)家兔丘腦-垂體-性腺軸中AMA活性的影響

按照南京建成家兔血清AMA活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，采用間接ELISA法測(cè)定家兔丘腦-垂體-性腺軸組織中的AMA活性。

1.5小花棘豆對(duì)家兔丘腦-垂體-性腺軸中AMA基因mRNA表達(dá)水平的影響

1.5.1引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中家兔AMA1、AMA2和β-actin基因的核苷酸序列(GenBank登錄號(hào)分別為：NM_012979.2、NM_174561.2和NM_007393.2)，采用Beacon Designer軟件設(shè)計(jì)引物，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，相關(guān)信息見表1。

1.5.2總RNA的提取與cDNA合成參照Thermo公司總RNA提取試劑Trizol的說(shuō)明書提取家兔待測(cè)組織總RNA，用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定其OD260和RNA濃度，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。利用gDNA Eraser去除合格RNA中的基因組DNA，反應(yīng)條件：42 ℃ 2 min。以除去基因組DNA的RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒采用兩步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。

表 1　試驗(yàn)所用引物序列Table 1　Primer sequence in the test

1.5.3普通PCR及基因測(cè)序參照Thermo公司PCR擴(kuò)增試劑盒Hot-start PCR Mix的說(shuō)明書進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴(kuò)增陽(yáng)性者送寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序。

1.5.4家兔組織中AMA相對(duì)表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)采用SYBR?Premix ExTaqTMⅡ進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)所得實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行分析。

1.6數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0軟件中One-Way ANOVA方法進(jìn)行單因素方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1AMA在家兔丘腦-垂體-性腺組織中的分布

結(jié)果表明，AMA在對(duì)照組家兔分布于丘腦旁中央核、室旁核、背內(nèi)側(cè)核、腹內(nèi)側(cè)核(圖1-A)，垂體前葉、后葉、正中隆起(圖1-B)，睪丸精曲小管、精直小管、間質(zhì)細(xì)胞(圖1-C)及卵巢上皮細(xì)胞、絨毛細(xì)胞、顆粒層細(xì)胞(圖1-D)等區(qū)域。小花棘豆攻毒第35 天時(shí)，家兔丘腦背內(nèi)側(cè)核細(xì)胞、丘腦室旁核、垂體前葉和后葉、睪丸間質(zhì)細(xì)胞及卵巢絨毛細(xì)胞中AMA分布明顯下降；第70天時(shí)試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組家兔丘腦室旁核(圖1-E)、垂體前葉(圖1-F)、睪丸間質(zhì)細(xì)胞(圖1-G)和卵巢絨毛細(xì)胞(圖1-H)中AMA免疫組化染色極淡，表明這些區(qū)域AMA已幾乎不表達(dá)。

2.2家兔丘腦-垂體-性腺軸中AMA活性的變化

在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)，對(duì)照組家兔丘腦-垂體-性腺AMA活性無(wú)明顯變化，試驗(yàn)組家兔丘腦-垂體-性腺AMA活性均有一定程度的下降。由表2可知，攻毒第14天時(shí)，試驗(yàn)Ⅲ組家兔丘腦、垂體AMA活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，但睪丸和卵巢組織AMA活性與對(duì)照組差異均不顯著(P>0.05)。攻毒第35天時(shí)，試驗(yàn)Ⅲ組家兔丘腦-垂體-性腺AMA活性均極顯著低于對(duì)照及試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組(P<0.01)。攻毒第70天時(shí)試驗(yàn)Ⅲ組家兔丘腦-垂體-性腺軸AMA活性均極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；試驗(yàn)Ⅱ組丘腦、垂體、睪丸AMA活性均極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，卵巢AMA活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；試驗(yàn)Ⅰ組丘腦AMA活性極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，垂體AMA活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，睪丸和卵巢AMA活性與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，長(zhǎng)時(shí)間、高劑量地?cái)z食小花棘豆可顯著影響家兔丘腦-垂體-性腺軸中AMA的活性，其中丘腦受到的影響最為明顯。

圖 1　小花棘豆中毒對(duì)家兔AMA在丘腦-垂體-性腺軸分布的影響(IHC×400) A、B、 C、 D.分別為對(duì)照組丘腦、垂體、睪丸、卵巢組織；E、F、G、H.分別為攻毒第70 天時(shí)試驗(yàn)Ⅲ組丘腦、垂體、睪丸、卵巢組織Fig.1　Effects of Oxytropis glabra DC poisoning on distribution of AMA in hypothalamus- pituitary-gonad of rabbits (IHC×400) A,B,C and D were distribution of AMA in hypothalamus,pituitary,testis and ovary in control group,E,F,G and H were distribution of AMA in hypothalamus,pituitary,testis and ovary in experimental group Ⅲ in 70 d表 2　小花棘豆中毒對(duì)家兔丘腦-垂體-性腺軸中AMA活性的影響Table 2　Effects of Oxytropis glabra DC poisoning on activities of AMA in hypothalamus-pituitary-gonad of rabbits　nmol/(s·L)

表 2(續(xù))　Continued table 2

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

Note:Different small letters indicate significant difference (P<0.05),and different capital letters indicate very significant difference (P<0.01).The same below.

2.3小花棘豆對(duì)家兔丘腦-垂體-性腺軸AMAmRNA表達(dá)水平的影響

2.3.1引物的特異性驗(yàn)證普通PCR結(jié)果如圖2所示。由圖2可看出，β-actin在100 bp左右出現(xiàn)條帶，AMA1和AMA2基因分別在100 和200 bp間出現(xiàn)2條清晰條帶，與試驗(yàn)預(yù)期的目的條帶長(zhǎng)度相符，表明引物特異性良好。測(cè)序結(jié)果表明，β-actin、AMA1和AMA2基因的序列都與預(yù)期的片段長(zhǎng)度基本一致，且與 GenBank 中的物種序列進(jìn)行比對(duì)后，AMA1和AMA2基因與家兔序列的相似性均在 96%以上。

圖 2　家兔β-actin、AMA1和AMA2 基因的PCR擴(kuò)增M.DNA Marker；1.AMA1擴(kuò)增產(chǎn)物； 2.AMA2擴(kuò)增產(chǎn)物；3.β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2　PCR amplification of β-actin,AMA1 andAMA2 genes in rabbitsM.DNA Marker；1.AMA1 amplification products；2.AMA2 amplification products；3.β-actin amplification products

2.3.2AMA1 mRNA的表達(dá)水平由表3可知，各試驗(yàn)組家兔丘腦-垂體-性腺中AMA1均有表達(dá)。攻毒第14天時(shí)，試驗(yàn)Ⅲ組家兔AMA1 mRNA在丘腦中表達(dá)量較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)，而垂體、睪丸和卵巢中的表達(dá)量均與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)Ⅰ和Ⅱ組家兔丘腦-垂體-性腺中AMA1 mRNA表達(dá)量均與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。攻毒第35天時(shí)，試驗(yàn)Ⅲ組家兔丘腦-垂體-性腺軸中AMA1 mRNA表達(dá)量均極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；試驗(yàn)Ⅱ組家兔丘腦的表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，垂體的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；試驗(yàn)Ⅰ組的表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。攻毒第70天時(shí)，試驗(yàn)Ⅲ組家兔丘腦-垂體-性腺中AMA1 mRNA表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；試驗(yàn)Ⅱ組家兔丘腦、垂體和睪丸中的表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，而卵巢的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；試驗(yàn)Ⅰ組家兔的表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，大劑量、長(zhǎng)時(shí)間飼喂小花棘豆可顯著影響家兔丘腦-垂體-性腺軸中AMA1 mRNA的表達(dá)水平。

2.3.3AMA2 mRNA的表達(dá)水平由表4可知，AMA2在各試驗(yàn)組家兔丘腦-垂體-性腺軸中均有表達(dá)。與對(duì)照組相比，攻毒第14和35 天時(shí)，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組家兔丘腦-垂體-性腺軸中AMA2 mRNA表達(dá)量均與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。攻毒第70天時(shí)，試驗(yàn)Ⅲ組家兔睪丸和卵巢組織中AMA2 mRNA表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而丘腦和垂體組織中的表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)Ⅰ和Ⅱ組家兔丘腦-垂體-性腺軸中AMA2 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。結(jié)合表3結(jié)果可知，小花棘豆中毒對(duì)家兔丘腦-垂體-性腺軸中AMA1 mRNA表達(dá)量的影響較為顯著，對(duì)AMA2 mRNA表達(dá)量的影響不明顯。

表 3　小花棘豆中毒對(duì)家兔丘腦-垂體-性腺軸中AMA1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Table 3　Effects of Oxytropis glabra DC poisoning on relative expressions of AMA1 mRNA in hypothalamus-pituitary-gonad of rabbits

3　討　論

SW是小花棘豆的主要毒性成分，可強(qiáng)烈地、特異性地與AMA結(jié)合，從而使機(jī)體甘露糖代謝發(fā)生異常，導(dǎo)致甘露糖在細(xì)胞中大量蓄積而造成細(xì)胞空泡變性，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷[7]。賈琦珍等[8]研究表明，小花棘豆中毒可導(dǎo)致家兔腦組織與性腺損傷，而且腦指數(shù)、睪丸指數(shù)、卵巢指數(shù)與小花棘豆中毒均極顯著相關(guān)(P<0.01)。丁伯良等[9-10]研究認(rèn)為，甘肅棘豆(主要毒性成分為SW)中毒山羊睪丸、附睪、卵巢、胎盤組織細(xì)胞的空泡變性與AMA活性下降有關(guān)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AMA在家兔丘腦-垂體-性腺軸中均有分布，但在小花棘豆中毒家兔該組織中的AMA活性顯著下降，而且與時(shí)間-劑量呈正相關(guān)，表明SW可通過(guò)影響AMA導(dǎo)致動(dòng)物中毒。

AMA在機(jī)體糖蛋白合成和代謝方面具有重要的作用，可在N-糖基化過(guò)程中對(duì)甘露糖進(jìn)行加工。該過(guò)程與蛋白的折疊、運(yùn)輸、成熟、構(gòu)象維持、半衰期及生物活性密切相關(guān)。AMA既是N-聚糖成熟的必要酶，也參與N-聚糖的降解[11]。榮杰[5]、宋巖巖[12]研究發(fā)現(xiàn)，SW可顯著影響大鼠AMA在腦組織中的相對(duì)表達(dá)量；張建軍等[13]研究發(fā)現(xiàn)，小花棘豆中毒可顯著影響小鼠肝臟組織內(nèi)AMA的相對(duì)表達(dá)量，中、高劑量攻毒組可顯著降低肝臟組織內(nèi)的AMA基因的相對(duì)表達(dá)量。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小花棘豆毒性成分SW可顯著影響家兔丘腦-垂體-性腺軸中AMA1和AMA2在mRNA水平的表達(dá)量，而且其對(duì)AMA1 mRNA表達(dá)量的影響更為顯著，該結(jié)果與文獻(xiàn)[5,12-13]的研究結(jié)果一致。另外免疫組化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小花棘豆中毒家兔丘腦-垂體-性腺軸中AMA分布均有一定程度的下降。AMA按其在亞細(xì)胞器中的分布可分為AMA1、AMA2和細(xì)胞質(zhì)α-甘露糖苷酶，動(dòng)物小花棘豆中毒主要抑制哪種AMA尚不明確，對(duì)其轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工修飾是否產(chǎn)生影響還不清楚。本試驗(yàn)結(jié)果表明，小花棘豆毒性成分可從mRNA水平和蛋白表達(dá)水平影響AMA的表達(dá)，這為揭示小花棘豆中毒的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

丘腦和垂體是動(dòng)物內(nèi)分泌的控制中心，并分泌大量與生殖相關(guān)的激素，性腺是多種性激素的受體。丘腦-垂體-性腺軸任何部位出現(xiàn)功能紊亂或病變，都會(huì)影響動(dòng)物性激素的分泌，從而導(dǎo)致一系列的臨床病癥出現(xiàn)。AMA活性受到抑制可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)糖蛋白的N-糖基化合成、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程發(fā)生變化，臨床上表現(xiàn)為生殖、內(nèi)分泌和免疫功能紊亂[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，中、高劑量小花棘豆攻毒對(duì)家兔丘腦-垂體-性腺AMA的活性與表達(dá)產(chǎn)生顯著影響。本項(xiàng)目組前期研究表明，小花棘豆中毒可導(dǎo)致動(dòng)物性欲下降，其原因是否與中毒導(dǎo)致丘腦-垂體-性腺軸損傷有關(guān)有待于進(jìn)一步研究。

4　結(jié)　論

小花棘豆中毒可導(dǎo)致家兔丘腦-垂體-性腺軸AMA活性與表達(dá)水平顯著下降，而且下降程度與小花棘豆攝入量呈正相關(guān)。小花棘豆中毒對(duì)AMA1的影響較為顯著，其可通過(guò)mRNA水平和蛋白表達(dá)水平影響AMA1在機(jī)體中的作用。

[1]王帥,張玲,陳根元,等.小花棘豆生態(tài)學(xué)研究概況 [J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2014,35(3):85-88.

Wang S,Zhang L,Chen G Y,et al.An overview of ecological research onOxytropisglabraDC [J].Acta Ecologiae Animals Domastici,2014,35(3):85-88.

[2]王帥,胡建軍,陳根元,等.小花棘豆中毒家兔的病理形態(tài)學(xué)觀察 [J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(6):175-178.

Wang S,Hu J J,Chen G Y,et al.Pathomorphological observation ofOxytropisglabraDC poisoning in rabbits [J].Jiangsu Agricultural Sciences,2014,42(6):175-178.

[3]王帥,吳書奇,胡建軍,等.南疆地區(qū)小花棘豆中苦馬豆素的分離與鑒定 [J].草業(yè)科學(xué),2011,28(6):1194-1197.

Wang S,Wu S Q,Hu J J,et al.Isolation and detection of swainsonine fromOxytropisglabraDC in Southern Xingjiang [J].Pratacultural Sciences,2011,28(6):1194-1197.

[4]賈琦珍,王帥,張玲,等.小花棘豆中毒對(duì)家兔腦組織α-甘露糖苷酶的影響 [J].塔里木大學(xué)學(xué)報(bào),2015,27(1):11-15.

Jia Q Z,Wang S,Zhang L,et al.Effects ofOxytropisglabraDC poisoning on α-mannosidase in rabbit brain [J].Journal of Tarim University,2015,27(1):11-15.

[5]榮杰.甘肅棘豆對(duì)大鼠亞急性毒性及α-甘露糖苷酶分布與表達(dá)的影響 [D].陜西楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2011.

Rong J.Effects of subacute ofOxytropiskansuensisbunge poisoning on the distribution and the expression of α-mannosidase in rats [D].Yangling,Shaanxi:Northwest A&F University,2011.

[6]賈琦珍,陳根元,胡建軍,等.家兔小花棘豆中毒與血液生化指標(biāo)的相關(guān)性研究 [J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,50(11):2125-2129.

Jia Q Z,Chen G Y,Hu J J,et al.Study on correlation between serum biochemical indexes andOxytropisglabraDC poisoning in rabbits [J].Xinjiang Agricultural Sciences,2013,50(11):2125-2129.

[7]陳根元,賈琦珍,潘伊微,等.家兔抗苦馬豆素多克隆抗體的制備及其治療小花棘豆中毒家兔的研究 [J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014,23(1):23-29.

Chen G Y,Jia Q Z,Pan Y W,et al.Preparation of polyclonal antibody against swainsonine of rabbits and its effects on poisoning byOxytropisglabraDC [J].Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica,2014,23(1):23-29.

[8]賈琦珍,陳根元,廖秋萍,等.小花棘豆中毒對(duì)家兔臟器指標(biāo)的影響 [J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,53(12):2584-2586.

Jia Q Z,Chen G Y,Liao Q P,et al.Effect of oxygen parameters ofOxytropisglabraDC poisoning in rabbits [J].Hubei Agricultural Sciences,2014,53(12):2584-2586.

[9]丁伯良,王建辰,薛登民,等.山羊甘肅棘豆中毒睪丸、附睪的病理學(xué)研究 [J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),1994,25(4):368-374.

Ding B L,Wang J C,Xue D M,et al.A study on the pathology ofOxytropiskansuensisintoxication on testis and epididymis of goats [J].Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences,1994,25(4):368-374.

[10]丁伯良,王建辰,薛登民,等. 奶山羊甘肅棘豆中毒卵巢、胎盤的病理學(xué)研究 [J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),1995,15(1):27-32.

Ding B L,Wang J C,Xue D M,et al.A study on the pathology ofOxytropiskansuensisintoxication on ovary and placenta of goats [J].Chinese Journal of Veterinary Science,1995,15(1):27-32 .

[11]Douglas A K,Shinichi N,Kaylashea,et al.Structural investigation of the binding of 5-Substituted swainsonine analogues to golgi α-mannosidase Ⅱ [J].Chem Bio Chem,2010,11(5):673-680.

[12]宋巖巖.甘肅棘豆致大鼠腦組織細(xì)胞凋亡及α-甘露糖苷酶變化的研究 [D].陜西楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2012.

Song Y Y.Study of apoptosis and expression of α-mannosidase in rat brain by contactingOxytropiskansuensis[D].Yangling,Shaanxi:Northwest A&F University,2012.

[13]張建軍,韓敏,王宇,等.小花棘豆苦馬豆素對(duì)小白鼠肝臟α-甘露糖苷酶基因相對(duì)表達(dá)的影響 [J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2014,41(2):50-53.

Zhang J J,Han M,Wang Y,et al.Effects of swainsonine ofOxytrpisglabraDC on of α-mannosidase gene relative expression in mouse liver [J].China Animal Husbandry & Veterinary Medicine,2014,41(2):50-53.

[14]Polakova M,Sestak S,Lattova E,et al.α-D-mannose derivatives as models designed for selective inhibition of golgi α-mannosidase [J].J Vet Diagn Invest,2011,23(2):221-232.

Effects ofOxytropisglabraDC poisoning on α-mannosidase of Hypothalamus-Pituitary-Gonad in rabbit

WANG Shuai1,2,CHEN Genyuan1,JIA Qizhen1,ZHANG Ling1,2,MA Chunhui1,3

(1KeyLaboratoryofTarimAnimalHusbandryScienceandTechnology,XinjiangProduction&ConstructionCorps,Alar,Xinjiang843300,China;2CollegeofAnimalScience,TarimUniversity,Alar,Xinjiang843300,China;3CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832000,China)

【Objective】 This study investigated the effects ofOxytropisglabraDC poisoning on content and transcriptional expression of α-mannosidase(AMA) in hypothalamus-pituitary-gonad to reveal its toxicity mechanism.【Method】 A total of 24 rabbits were randomly and equally divided into control group and experimental groups Ⅰ,Ⅱ,and Ⅲ.The control group was feed with green hay only while the experimental groups were fed with mixed forage with 15%,30% and 45% driedO.glabraDC plant and the corresponding swainsonine contents were 30 mg/kg,60 mg/kg,and 90 mg/kg,respectively.Two rabbits were randomly selected from each group on the 14th,35th and 70th days to collect hypothalamus,pituitary and gonad for the measurement of distribution and content of AMA as well as the mRNA expression in different encephalic regions.【Result】 AMA distributed in hypothalamus-pituitary-gonad in rabbits,andO.glabraDC reduced the distribution and content of hypothalamus-pituitary-gonad in experimental groups.AMA in golgi and lysosomal expressed in hypothalamus-pituitary-gonad of all experimental groups,andO.glabraDC reduced the expression of hypothalamus-pituitary-gonad AMA1 and AMA2 mRNA.The difference in AMA1 and AMA2 expressions was not significant between experimental groupⅠand control group in hypothalamus-pituitary-gonad at 70 d (P>0.05),so was the difference in AMA2 expression between experimental groups Ⅱ and Ⅲ with control group.The difference in AMA1 expression was very significant between experimental group Ⅲ and control group in hypothalamus-pituitary-gonad at 70 d(P<0.01),so as the difference between experimental groupⅡ and control group in hypothalamus,pituitary and testis (P<0.01).The difference was not significant between experimental group Ⅱ and control group in ovary (P>0.05),but the difference of AMA2 expression was extremely significant between experimental groupⅢ and control group in testis and ovary (P<0.01).【Conclusion】O.glabraDC had effects on content and transcriptional expression of AMA in rabbit hypothalamus-pituitary-gonad.

OxytropisglabraDC;swainsonine;α-mannosidase;hypothalamus-pituitary-gonad

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-07-1208:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.08.007

2015-01-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460678)；國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2015GA891015)

王帥(1984-)，男，山西長(zhǎng)治人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事動(dòng)物毒理學(xué)研究。E-mail:wangshuaidky@126.com

馬春暉(1966-)，男，新疆哈密人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事牧草資源開發(fā)利用研究。

E-mail:chunhuima@126.com

S856.9

A

1671-9387(2016)08-0041-08

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