胡延萍, 包　蕊, 王　莉， 石　琳,2， 李　毅*

( 1. 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所， 西寧 810008； 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049 )

?

西藏嵩草ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化研究

胡延萍1, 包蕊1, 王莉1， 石琳1,2， 李毅1*

( 1. 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所， 西寧 810008； 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049 )

西藏嵩草(Kobresiatibetica)為莎草科嵩草屬多年生草本，根狀莖短，稈密集叢生。生于海拔2 550～4 950 m的河灘地、濕潤(rùn)草地、高山灌叢草甸，分布于甘肅、青海、四川西部、西藏東部，其根系發(fā)達(dá)，喜濕，耐寒，生活力強(qiáng)。西藏嵩草繁殖以營(yíng)養(yǎng)繁殖為主、有性繁殖為輔，其莖葉茂盛，有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，產(chǎn)草量高，是青藏高原夏、秋兩季的主要放牧飼草。該研究以青藏高原高寒沼澤化草甸的建群種和優(yōu)勢(shì)種——西藏嵩草為材料，對(duì)影響其ISSR-PCR反應(yīng)的因素(Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP、引物和模板DNA)進(jìn)行5因素4水平的正交試驗(yàn)，以確定西藏嵩草ISSR分析的最佳反應(yīng)體系，并篩選適宜的ISSR引物及各引物的最佳退火溫度。結(jié)果表明：建立了適宜于西藏嵩草ISSR-PCR反應(yīng)的最佳體系為20 μL反應(yīng)液中包括10 × PCR buffer 2 μL、1.5 mmol·L-1Mg2+、1.0 UTaqDNA聚合酶、0.100 mmol·L-1dNTP、0.3 μmol·L-1引物和30～40 ng DNA模板；同時(shí)從100條ISSR引物中篩選出了擴(kuò)增結(jié)果清晰、穩(wěn)定的12條引物，各引物的最佳退火溫度為48.0～53.2 ℃(引物不同，其最佳退火溫度也不同)；西藏嵩草ISSR-PCR適宜的擴(kuò)增程序?yàn)槭紫阮A(yù)變性94 ℃ 5 min，然后變性94 ℃ 20 s、復(fù)性48.0～53.2 ℃ 1 min、延伸72 ℃ 80 s、38個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸6 min。體系穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果表明，該體系在西藏嵩草其他樣品中所得條帶清晰且多態(tài)性豐富，為后續(xù)西藏嵩草的遺傳多樣性分析和優(yōu)良牧草種質(zhì)資源篩選研究奠定了基礎(chǔ)。該研究結(jié)果對(duì)以西藏嵩草為優(yōu)勢(shì)種的高寒沼澤化草甸研究及濕地生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)和保護(hù)具有重要意義。

西藏嵩草, 莎草科, ISSR-PCR, 反應(yīng)體系, 正交設(shè)計(jì)

西藏嵩草(Kobresiatibetica)，為莎草科(Cyperaceae)嵩草屬(KobresiaWilld.)多年生草本。根狀莖短。稈密集叢生，較粗壯，高5～15 cm，直徑1～2 mm，有鈍棱或圓柱形，具條紋，基部具淺褐色至深褐色枯死葉鞘。葉短于稈，絲狀，寬約1 mm，邊緣席卷。生于海拔2 550～4 950 m的河灘地、濕潤(rùn)草地、高山灌叢草甸，分布于甘肅、青海、四川西部、西藏東部，其根系發(fā)達(dá)，喜濕，耐寒，生活力強(qiáng)(中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì), 2000; 張勝邦和盧學(xué)峰, 2012)。西藏嵩草的繁殖以營(yíng)養(yǎng)繁殖為主，有性繁殖為輔，其莖葉茂盛、有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，產(chǎn)草量高，是青藏高原夏、秋兩季的主要放牧飼草(鄧德山等, 1995; 馬玉壽和徐海峰, 2013)。以西藏嵩草為優(yōu)勢(shì)種形成的高寒沼澤化草甸，具有典型的高原濕地生態(tài)特征，是青藏高原高寒草甸類草地的組成部分，其獨(dú)特的水源涵養(yǎng)功能，在維持青藏高原生態(tài)系統(tǒng)平衡及保護(hù)生物多樣性等方面發(fā)揮著重要作用；其泥炭的形成與儲(chǔ)存對(duì)降低大氣中溫室氣體和穩(wěn)定全球變化有著重要意義(周興民, 2001; 李春秀和孫海松, 2009；田昆等, 2009)。

加拿大蒙特利爾大學(xué)Zietkiewicz et al(1994)創(chuàng)建了基于PCR的分子標(biāo)記Inter-simple Sequence Repeats (ISSR)。該標(biāo)記操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、穩(wěn)定性好而且多態(tài)性豐富(Nagaoka & Ogihara, 1997; Devarumath et al, 2002)。鑒于ISSR的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已在牧草遺傳結(jié)構(gòu)分析、基因作圖與定位、親緣關(guān)系及種質(zhì)資源篩選與育種等方面應(yīng)用廣泛(Li et al, 2013; 李鈺瑩和董寬虎, 2014)。本研究設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化影響青藏高原高寒草甸優(yōu)勢(shì)種西藏嵩草ISSR的主要因子(如TaqDNA polymerase、Mg2+、dNTP、引物和DNA模板)，旨在建立適合西藏嵩草ISSR的穩(wěn)定性及重復(fù)性好，多態(tài)性豐富的最佳反應(yīng)體系，為進(jìn)一步開展ISSR標(biāo)記在西藏嵩草遺傳多樣性及種質(zhì)資源篩選等方面的研究提供理論依據(jù)與遺傳基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1 材料

2013年7月赴青海省海北藏族自治州祁連縣境內(nèi)的石棉礦(38°240′43.8″ N, 99°16′37.1″ E)地區(qū)采集西藏嵩草葉片材料，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所盧學(xué)峰研究員鑒定為西藏嵩草(Kobresiatibetica)，憑證標(biāo)本放置于青藏高原生物標(biāo)本館(HNWP，標(biāo)本號(hào)2013003)。

1.2 試劑

dNTP、TaqDNA 聚合酶、100 bp和200 bp DNA molecular marker購(gòu)于TaKaRa公司。所用引物(Set#9，由加拿大哥倫比亞大學(xué)University of British Columbia提供)委托上海生工合成。

1.3 方法

1.3.1 提取DNA與質(zhì)量檢測(cè)基因組DNA提取采用Doyle JJ & Doyle JL(1987)改進(jìn)的CTAB法。NanoDrop 2000c微量紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific)檢測(cè)DNA的純度和濃度，其OD260/280值均在2.04～2.12之間，濃度在95～450 ng·μL-1之間，滿足ISSR-PCR對(duì)DNA模板質(zhì)量的要求。

1.3.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化對(duì)TaqDNA 聚合酶、Mg2+、dNTP、Primer及DNA等進(jìn)行5個(gè)因素4種不同梯度的L16(45)正交試驗(yàn)篩選(表1)。優(yōu)化試驗(yàn)選用UBC855(其序列為5′-ACACACACACACACACYT-3′)引物。每個(gè)體系還含有2 μL的10×PCR buffer，用超純水補(bǔ)至20 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在C1000 TouchTMThermal Cycler型 (Bio-Rad) PCR儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 20 s，復(fù)性50 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 80 s， 38 Cycles；72 ℃ 6 min延伸；并于4 ℃保存。PCR產(chǎn)物于水平板瓊脂糖凝膠(濃度為1.2%)上電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDocTMMP, Bio-Rad)拍照的方法記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.3 引物篩選及其最佳復(fù)性溫度優(yōu)化在優(yōu)化后的PCR體系上，從100條引物中篩選出擴(kuò)增條帶豐富且清晰、穩(wěn)定性和多態(tài)性好的引物。以引物UBC855(Tm=52 ℃)為例，在其Tm值上下浮動(dòng)4 ℃，設(shè)置8個(gè)溫度梯度(48.0、48.5、49.6、51.2、53.1、54.7、55.6、56.0 ℃)，其它反應(yīng)程序同前文正交試驗(yàn)的擴(kuò)增程序，篩選出該引物的最佳退火溫度。

1.3.4 ISSR-PCR體系的穩(wěn)定性驗(yàn)證用引物UBC855對(duì)西藏嵩草不同材料進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增體系的穩(wěn)定性檢測(cè)試驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

采用正交設(shè)計(jì)直觀分析方法評(píng)分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照擴(kuò)增條帶數(shù)量豐富度、清晰度及背景深淺的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分，條帶數(shù)量豐富、清晰且背景低的為16分，最差的為1分。用DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析(唐啟義等, 2006)。

2　結(jié)果與分析

2.1 西藏嵩草正交設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)分析

圖1是西藏嵩草ISSR-PCR正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，處理12擴(kuò)增片段清晰，重復(fù)性好，亮度適中。16個(gè)處理的直觀打分結(jié)果如表1。

表 1　西藏嵩草正交試驗(yàn) (5因素4水平)

表2為方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果，據(jù)F值，各因素對(duì)西藏嵩草ISSR-PCR的影響程度由強(qiáng)到弱依次為Mg2+、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA、dNTP，且每個(gè)因素的影響均達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)。因此，為確定各個(gè)因素的最佳水平，需對(duì)5個(gè)因素分別進(jìn)行因素內(nèi)水平間的Duncan多重比較(表3)。

Mg2+是影響西藏嵩草ISSR-PCR反應(yīng)最大的因素。當(dāng)Mg2+濃度在0.9～1.5 mmol·L-1之間時(shí)，隨Mg2+濃度增加，其評(píng)分結(jié)果均值呈增大趨勢(shì)；當(dāng)Mg2+濃度達(dá)1.8 mmol·L-1時(shí)，結(jié)果均值有減小趨勢(shì)(圖2)。Mg2+濃度為0.9～1.2 mmol·L-1，擴(kuò)增條帶豐度低且淡弱；使用1.5～1.8 mmol·L-1的Mg2+時(shí)，所得條帶豐度高且清晰明亮，特別是1.5 mmol·L-1時(shí)，所得條帶是實(shí)驗(yàn)中最清晰明亮的(處理12)。因此，1.5 mmol·L-1是Mg2+最適宜的濃度。

圖 1　西藏嵩草ISSR-PCR正交設(shè)計(jì)電泳結(jié)果(引物UBC855)　1-16. 處理編號(hào)(表1); M. 100 bp+200 bp標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物。Fig. 1　Electrophoresis results of ISSR-PCR in Kobresia tibetica with orthogonal design (Primer UBC855)　1-16. Treatment numbers as showed in Table 1; M. 100 bp+200 bp molecular ladder.

表 2　不同因素對(duì)西藏嵩草ISSR-PCR影響的方差分析

注： **差異極顯著(P<0.01)。

Note: **Highly significant differences(P<0.01).

圖 2　Mg2+濃度與評(píng)分結(jié)果均值間的關(guān)系　Fig. 2　Relationship between Mg2+ concentration and mean grading results

TaqDNA聚合酶對(duì)西藏嵩草ISSR反應(yīng)的影響僅次于Mg2+(表2)，評(píng)分結(jié)果均值隨酶量的增加呈增大趨勢(shì)(圖3)。當(dāng)TaqDNA聚合酶量為0.4～0.6 U時(shí)，擴(kuò)增條帶少；TaqDNA聚合酶量為0.8～1.0 U時(shí)，所得條帶逐漸增多。由Duncan比較(表3)結(jié)果可知，僅水平3與4差異不顯著，其它水平間均差異顯著。綜上結(jié)果及酶量的經(jīng)濟(jì)性原則，確定水平4(1.0 U·20 μL-1)是TaqDNA聚合酶的最佳用量。

對(duì)西藏嵩草ISSR-PCR影響較大的另一因素是引物濃度，引物濃度低時(shí)，擴(kuò)增效率低；引物濃度偏高，則會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)配、非特異性擴(kuò)增及引物二聚體生成等可能性(圖4)，對(duì)不同分子量大小片段的擴(kuò)增，引物濃度具有一定的選擇性。由圖1可知，引物濃度為0.3～0.4 μmol·L-1時(shí)，小于400 bp的片段未出現(xiàn)，而大于1 200 bp的片段被清晰明顯擴(kuò)增出來；當(dāng)濃度增加到0.6 μmol·L-1時(shí)(處理4、6、9、15)，大于1 200 bp的條帶少且弱，出現(xiàn)了小于400 bp的片段。說明低濃度引物對(duì)大片段條帶的擴(kuò)增有利，高濃度引物則有利于小片段條帶擴(kuò)增。多重比較表明，水平1與水平2和3差異不顯著，水平1與水平4差異顯著。確定引物的適宜濃度為0.3 μmol·L-1。

表 3　ISSR-PCR各因素水平間Duncan比較

注： 0.05顯著水平，不同字母表示處理間差異顯著，字母相同則表示不存在顯著差異。

Note: Data with different letters differ significantly while with the same letters not significantly at 0.05 level.

圖 3　Taq DNA聚合酶濃度與評(píng)分結(jié)果均值的關(guān)系Fig. 3　Relationship between the concentration of Taq DNA polymerase and the mean grading results

圖 4　引物濃度值與評(píng)分結(jié)果平均值的關(guān)系Fig. 4　Relationship between primer concentration and mean grading results

圖 5　模板DNA濃度對(duì)評(píng)分結(jié)果平均值的影響Fig. 5　Influence of the concentration of template DNA on the mean grading results

評(píng)分結(jié)果均值隨模板DNA用量的增加而減少(圖5)。當(dāng)DNA用量為20 ng時(shí)(處理1、8、10、15)，因模板量太少，擴(kuò)增的穩(wěn)定性差。僅水平2與水平3差異不顯著，水平1與其它3個(gè)水平差異顯著，水平4與水平2、3差異也顯著。因此，模板DNA的用量范圍在30～40 ng均可。

dNTP對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響最小(表3)，評(píng)分均值結(jié)果波動(dòng)不劇烈(圖6)。當(dāng)dNTP為0.075 mmol時(shí)(處理1、6、11、16)，擴(kuò)增條帶少且不清晰；當(dāng)dNTP大于0.100 mmol時(shí)，擴(kuò)增條帶逐漸增多。Duncan分析表明，水平1與水平3、水平2與水平4差異不顯著；水平1、3與水平2、4差異顯著。所以，選取dNTP的最佳濃度為0.100 mmol。

比較上述不同分析方法數(shù)據(jù)處理結(jié)果，本研究中每個(gè)因子(Mg2+、TaqDNA polymerase、 dNTP、primer和DNA template)的最適濃度組合是處理12，即20 μL反應(yīng)體系中含有1.5 mmol·L-1Mg2+、1.0 U·20 μL-1TaqDNA聚合酶、0.100 mmol·L-1dNTP、0.3 μmol·L-1primer和40 ng 模板DNA。

圖 6　dNTP濃度對(duì)評(píng)分結(jié)果均值的影響Fig. 6　Influence of dNTP concentration on mean grading results

2.2 引物篩選及其最佳退火溫度

圖7為退火溫度試驗(yàn)(UBC855引物)結(jié)果，退火溫度對(duì)ISSR-PCR結(jié)果影響明顯。當(dāng)退火溫度低于51.2 ℃時(shí)，小于800 bp的片段較少，1 200～1 400 bp的片段多，整體條帶亮度較弱。當(dāng)退火溫度高于53.1 ℃時(shí)，400～800 bp的片段增多且逐漸清晰，大于1 600 bp的片段亮度增強(qiáng)，但1 200～1 400 bp的片段逐漸消失。退火溫度為53.1 ℃時(shí)，所得擴(kuò)增條帶豐富且清晰穩(wěn)定，因此引物UBC855的最佳退火溫度為53.1 ℃。據(jù)此方法，篩選出12條理想的引物，其序列及最佳退火溫度見表4。

圖 7　引物(UBC855)退火溫度試驗(yàn)　1-8泳道的復(fù)性溫度分別為48.0、48.5、49.6、51.2、53.1、54.7、55.6、56.0 ℃； M. 200 bp標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物。Fig. 7　Annealing temperature experiment of primer UBC855 Renaturation temperatures of lanes 1-8 were 48.0, 48.5, 49.6, 51.2, 53.1, 54.7, 55.6, 56.0 ℃ respectively； M. 200 bp molecular marker.

2.3 ISSR-PCR優(yōu)化體系穩(wěn)定性檢測(cè)

用引物UBC855和UBC846對(duì)西藏嵩草不同個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證優(yōu)化體系的穩(wěn)定性。從圖8中可以看出，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶豐度高且清晰明亮。由此可見，優(yōu)化后的ISSR反應(yīng)體系是穩(wěn)定可靠的，可用于西藏嵩草種質(zhì)資源遺傳結(jié)構(gòu)分析。

3　 討論與結(jié)論

ISSR-PCR反應(yīng)擴(kuò)增結(jié)果受反應(yīng)體系各組成成分、反應(yīng)條件和實(shí)驗(yàn)材料等諸多因素的影響(胡延萍等, 2007; 李猛等, 2013)。對(duì)不同物種而言，其ISSR-PCR反應(yīng)的最佳條件各異，并且由于試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平不同，各因素水平的影響也有差異。為確保ISSR分析結(jié)果的正確性及可重復(fù)性，須在實(shí)驗(yàn)前事先對(duì)體系條件進(jìn)行優(yōu)化篩選。本研究中，西藏嵩草ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響因素為Mg2+>TaqDNA聚合酶>引物>模板DNA>dNTP。Mg2+對(duì)西藏嵩草ISSR-PCR反應(yīng)的影響最為顯著，這與蜆殼花椒(李猛等, 2013)和紫云英(孫清信等, 2012)中的研究結(jié)果一致。所以，確定合適的Mg2+濃度對(duì)西藏嵩草ISSR實(shí)驗(yàn)來說是非常重要的工作。反應(yīng)液中處于游離態(tài)的Mg2+不僅會(huì)影響反應(yīng)過程中TaqDNA聚合酶的活性，還可進(jìn)一步結(jié)合反應(yīng)液中的DNA template、dNTP和primer，從而會(huì)改變primer與template的結(jié)合效率、template與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度以及產(chǎn)物的特異性(胡延萍等, 2010)。因此，本研究適宜的Mg2+濃度為1.5 mmol·L-1。TaqDNA聚合酶對(duì)西藏嵩草ISSR-PCR的影響居第二位，僅次于Mg2+，TaqDNA聚合酶濃度過低會(huì)使PCR擴(kuò)增片段少且條帶弱，濃度過高不僅成本高而且會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。本研究以1.0 U為合適用量。引物是ISSR-PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，引物濃度過低僅能擴(kuò)增出大片段的條帶，小片段的條帶不能有效擴(kuò)增；濃度過高則會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且會(huì)形成引物二聚體(胡延萍等，2014)，本研究中適宜的引物濃度是0.3 μmol·L-1。模板DNA是ISSR-PCR的研究對(duì)象，在保證其質(zhì)量的前提下，ISSR對(duì)模板DNA用量的要求范圍通常較廣，本試驗(yàn)中模板DNA的用量為30～40 ng。dNTP是對(duì)西藏嵩草ISSR-PCR反應(yīng)影響最小的因素。本研究表明，dNTP濃度為0.100 mmol·L-1時(shí)，擴(kuò)增的結(jié)果最理想。

表 4　12條引物堿基組成及其最適復(fù)性溫度

注： R = (A, G); Y = (C, T)。

Note: R=(A, G); Y = (C, T).

圖 8　引物UBC846和UBC855對(duì)西藏嵩草不同個(gè)體ISSR-PCR擴(kuò)增的結(jié)果　M. 100 bp+200 bp標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物。Fig. 8　Electrophoresis results of different individuals in Kobresia tibetica by UBC846 and UBC855　M. 100 bp+200 bp molecular marker.

西藏嵩草ISSR-PCR不同引物的退火溫度各異，其范圍為48.0～53.2 ℃。不同的物種，不同的引物其堿基組成和序列長(zhǎng)短不同，引物的退火溫度也不同。包蕊等(2014)對(duì)華扁穗草ISSR分析時(shí)，引物UBC834的退火溫度為55.4 ℃，在唐古特大黃中UBC834的退火溫度為53 ℃(Hu et al, 2014)，而本研究中，該引物的最適退火溫度為48 ℃。因此，在ISSR-PCR反應(yīng)中，對(duì)于不同的引物，須根據(jù)其熔點(diǎn)各自篩選其適宜的退火溫度，不能統(tǒng)一而論。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系中的多個(gè)因素同時(shí)進(jìn)行篩選，能夠快速獲得滿意的水平組合，從而避免單因素試驗(yàn)繁瑣且費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)。本研究通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化西藏嵩草ISSR中每個(gè)因子的最適濃度，并采用直觀分析和方差分析的方法，篩選出其最佳反應(yīng)體系。即在20 μL反應(yīng)體系中包括10 × PCR buffer 2 μL、1.5 mmol·L-1Mg2+、1.0 U·20 μL-1TaqDNA聚合酶、0.100 mmol·L-1dNTP、0.3 μmol·L-1primer和30～40 ng DNA模板。篩選出具有理想擴(kuò)增結(jié)果的12條引物，并進(jìn)一步確定了這12條引物對(duì)應(yīng)的最適退火溫度。利用篩選出的最佳反應(yīng)條件對(duì)西藏嵩草不同個(gè)體進(jìn)行驗(yàn)證，所得電泳圖譜清晰穩(wěn)定，能夠迅速有效地檢測(cè)出不同個(gè)體之間的差異。西藏嵩草是青藏高原高寒沼澤草甸的優(yōu)勢(shì)種，利用ISSR分子標(biāo)記研究西藏嵩草種質(zhì)資源遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，對(duì)青藏高原退化草甸的修復(fù)和保護(hù)具有重要的意義。

BAO R, HU YP, WANG L, et al, 2014. Optimization of ISSR-PCR system and primer screening forBlysmussinocompressus[J]. Chin J Grassl, 36(6): 46-52. [包蕊, 胡延萍, 王莉, 等, 2014. 華扁穗草ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選 [J]. 中國(guó)草地學(xué)報(bào), 36(6): 46-52.]

DELECTIS FLORA REPUBLICAE POPULARIS SINICAE AGENDAE ACADEMIAE SINICAE EDITA, 2000. Flora Deipublicae Popularis Sinicae [M]. Beijing: Science Press, 12: 33-34. [中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì), 2000. 中國(guó)植物志 [M]. 北京: 科學(xué)出版社, 12: 33-34.]

DENG DS, LIU JQ, DENG ZF, et al, 1995. A preliminary study on the reproductive characters ofKobresiaon Qinghai-Xizang Plateau [J]. J Qinghai Norm Univ:Nat Sci Ed, 21(2): 24-29. [鄧德山, 劉建全, 鄧自發(fā), 等, 1995. 青藏高原嵩草屬植物繁殖系統(tǒng)生物學(xué)特性初探 [J]. 青海師范大學(xué)學(xué)報(bào)·自然科學(xué)版, 21(2): 24-29.]

DEVARUMATH RM, NANDY S, RANI V, et al, 2002. RAPD, ISSR and RFLP fingerprints as useful markers to evaluate genetic integrity of micropropagated plants of three diploid and triploid elite tea clones representingCamelliasinensis(China type) andC.assamicassp.assamica(Assam-India type) [J]. Plant Cell Rep, 21(2): 166-173.

DOYLE JJ, DOYLE JL, 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue [J]. Phytochem Bull, 19: 11-15.

HU YP, WANG L, XIE XL, et al, 2014. Genetic variation in cultivated rhubarb (RheumtanguticumMaxim. ex Balf.) and the relationship with their wild relatives in China revealed by ISSR markers [J]. Plant Syst Evol, 300: 2 217-2 227.

HU YP, WANG L, BAO R, et al, 2014. Optimizing ISSR-PCR system ofCarexatrofuscausing orthogonal design [J]. Acta Agr Sin, 22(4): 911-914. [胡延萍, 王莉, 包蕊, 等, 2014. 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化黑褐苔草ISSR-PCR反應(yīng)體系 [J]. 草地學(xué)報(bào), 22(4): 911-914.]

HU YP, XIE XL, WANG L, et al, 2010. Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction conditions forRheumtanguticum[J]. Guihaia, 30(1): 112-116. [胡延萍, 謝小龍, 王莉, 等, 2010. 唐古特大黃ISSR-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 [J]. 廣西植物, 30(1): 112-116.]

LI CX, SUN HS, 2009.Kobresiatibeticaswamping grassland resources and its protection in Qinghai [J]. Prat Sci, 26(9): 77-83. [李春秀, 孫海松, 2009. 青海省西藏嵩草沼澤化草甸資源及保護(hù) [J]. 草業(yè)科學(xué), 26(9): 77-83.]

LI HY, LI ZY, CAI LY, et al, 2013. Analysis of genetic diversity of Ruthenia Medic (MedicagoruthenicaL. Trautv.) in Inner Mongolia using ISSR and SSR markers [J]. Gen Resourc Crop Evol, 60: 1 687-1 694.

LI M, WANG P, SUN JK, et al, 2013. Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction system onZanthoxylumdissitum[J]. Guihaia, 33(2): 185-190. [李猛, 王平, 孫吉康, 等, 2013. 蜆殼花椒ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 [J]. 廣西植物, 33(2): 185-190.]

LI YY, DONG KH， 2014. ISSR analysis of genetic diversity of germplasm resources ofBothriochloaischaemumin Shanxi [J]. Acta Prat Sin, 23(1): 217-222. [李鈺瑩, 董寬虎， 2014. 山西白羊草種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析 [J]. 草業(yè)學(xué)報(bào), 23(1): 217-222.]

MA YS, XU HF, 2013. Forage plants of three-river source region [M]. Beijing: Science Press. [馬玉壽, 徐海峰, 2013. 三江源區(qū)飼用植物志 [M]. 北京: 科學(xué)出版社.]

NAGAOKA T, OGIHARA Y, 1997. Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers [J]. Theor Appl Gen, 94: 597-602.

SUN QX, CHEN J, ZHANG H, et al, 2012. Optimization of ISSR’s primer and PCR reaction system forAstragalussinicusL. [J]. J Plant Gen Resour, 13(5): 870-878. [孫清信, 陳堅(jiān), 張輝, 等, 2012. 紫云英ISSR引物的篩選及PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化 [J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 13(5): 870-878.]

TANG QY, FENG MG, 2006. DPS?data processing system-experimental design, statistical analysis and modeling [M]. Beijing: Science Press. [唐啟義, 馮明光, 2006. DPS?數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)-實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、統(tǒng)計(jì)分析及模型優(yōu)化 [M]. 北京: 科學(xué)出版社.]

TIAN K, GUO HJ, YANG YM, 2009. The characteristic of ecological structure and research and practice of functional zoning in the conservation area of plateau wetland [M]. Beijing: Science Press. [田昆, 郭輝軍, 楊宇明, 2009. 高原濕地保護(hù)區(qū)生態(tài)結(jié)構(gòu)特征及功能分區(qū)研究與實(shí)踐 [M]. 北京: 科學(xué)出版社.]

ZHANG SB, LU XF, 2012. Seed plants of Langcang River in Qinghai [M]. Xining: Qinghai Nationalities Publishing House: 362. [張勝邦, 盧學(xué)峰, 2012. 青海瀾滄江源種子植物 [M]. 西寧: 青海民族出版社: 362.]

ZHOU XM, 2001. Kobresia meadow of China [M]. Beijing: Science Press. [周興民, 2001. 中國(guó)嵩草草甸 [M]. 北京: 科學(xué)出版社.]ZIETKIEWICZ E, RAFALSKI A, LABUDA D, 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeats (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification [J]. Genomics, 20: 176-183.

Optimization of ISSR-PCR system onKobresiatibetica

HU Yan-Ping1, BAO Rui1, WANG Li1, SHI Lin1, 2, LI Yi1*

( 1.NorthwestInstituteofPlateauBiology,ChineseAcademyofSciences, Xining 810008,China; 2.UniversityofChineseAcademyofSciences, Beijing 100049, China )

Kobresiatibetica, belonging to the genus ofKobresiaand the family of Cyperaceae, is a perennial herb. The rhizomes ofK.tibeticaare short and culms are densely tufted. It is mainly distributed in Qinghai, Gansu, west of Sichuan provinces and east of Tibet Autonomous Region at altitudes ranging from 2 550 m to 4 950 m and can be found in alpine swampy meadows, weedy plains, marshes and riversides. The root system ofK.tibeticais developed. Besides, it is hygrophilous, resistant to cold and strong in vitality. For the reproduction ofK.tibetica, vegetative propagation is prior to sexual propagation.K.tibeticaplants are of highly ecological and economic importance. The stem and leaf ofK.tibeticaare luxuriant.K.tibeticacontains high levels of crude proteins and fats and is preferred by livestock over other plants found on the plateau. The production ofK.tibeticagrass is of high yield. As a consequence, it is the major grazing forage grass of summer and autumn in Qinghai-Tibet Plateau. Furthermore,K.tibeticais the constructive and dominant species of alpine swamp meadows in Qinghai-Tibet Plateau.K. meadows are also highly involved in carbon storage and serve as important carbon sinks in China. Therefore,K.tibeticawas chosen as the research object in this study. In order to establish the suitable Inter Simple Sequence Repeats Polymerase Chain Reaction (ISSR-PCR) system inK.tibetica, factors which affect the ISSR-PCR amplification, such as magnesium ion (Mg2+),TaqDNA polymerase, dNTP, primer and DNA template, were optimized and selected by orthogonal designed experiment of five factors in four levels. In addition, suitable ISSR primers and the annealing temperature of selected primers were screened from 100 ISSR primers by gradient PCR. As a result, the optimal reactions of ISSR-PCR inK.tibeticawere performed in a 20 μL volume containing 2 μL 10× PCR buffer, 1.5 mmol·L-1Mg2+, 1.0 UTaqDNA polymerase, 0.100 mmol·L-1dNTP, 0.3 μmol·L-1primer and 30-40 ng template DNA. Out of 100 ISSR primers screened, twelve primers were selected with clear and steady bands and suitable annealing temperature of each primer was 48.0-53.2 ℃, depending on primers used. The appropriate program of ISSR-PCR forK.tibeticawas as follows: an initial step of 5 min at 94 ℃ followed by 38 cycles of denaturing at 94 ℃ for 20 s, annealing at appropriate annealing temperature 48.0-53.2 ℃ (different primers with different annealing temperatures) for 1 min and extending at 72 ℃ for 80 s, ending with a final extension of 6 min at 72 ℃. The stability of the ISSR-PCR reaction system indicated that clear and rich polymorphism bands were obtained in different individuals ofK.tibeticawith the optimal system. The establishment of ISSR-PCR system was beneficial to the analysis of genetic diversity and genetic structure ofK.tibeticagermplasms. This study will provide the information for further study of screening high quality forage. Furthermore, it is of great significance for the study ofKobresia-swamp meadows in Qinghai-Tibet Plateau as well as the restoration and conservation of the wetland ecosystem.

Kobresiatibetica, Cyperaceae, ISSR-PCR, reaction sytem, orthogonal design

10.11931/guihaia.gxzw201411003胡延萍, 包蕊, 王莉， 等. 西藏嵩草ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化研究 [J]. 廣西植物， 2016， 36(8):915-922

HU YP, BAO R, WANG L， et al. Optimization of ISSR-PCR system onKobresiatibetica[J]. Guihaia， 2016， 36(8):915-922

2014-11-04

2015-05-07

國(guó)家自然科學(xué)基金(31200245)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAC08B04)；中國(guó)科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)項(xiàng)目(2014386)；青海省國(guó)際科技合作項(xiàng)目(2015-HZ-808) [Supported by the National Natural Science Foundation of China(31200245); National Key Technology R & D Program(2012BAC08B04); Youth Innovation Promotion Committee of Chinese Academy of Sciences(2014386); International Cooperation Program for Science and Technology of Qinghai Province(2015-HZ-808)]。

胡延萍(1981-)，女，山東定陶人，博士，副研究員，主要從事植物生物技術(shù)研究，(E-mail)yphu@nwipb.cas.cn。

李毅，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事植物遺傳資源與繁育研究，(E-mail)liyi@nwipb.cas.cn。

Q945

A

1000-3142(2016)08-0915-08