官永河　杜蘭哲　霍文杰　鐘華林　趙徑華　陳向東（廣東一方制藥有限公司　佛山　528244）

·藥品質(zhì)量及檢驗(yàn)·

四物湯配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

官永河杜蘭哲霍文杰鐘華林趙徑華陳向東（廣東一方制藥有限公司佛山528244）

目的：建立四物湯配方顆粒的質(zhì)量控制方法。方法：采用薄層色譜（TLC）法鑒別四物湯配方顆粒中的熟地黃、當(dāng)歸、川芎、白芍，采用高效液相色譜（HPLC）法測定四物湯配方顆粒中的芍藥苷、阿魏酸的含量。結(jié)果：TLC法分離較好，陰性無干擾；HPLC法芍藥苷線性范圍為0.1031～1.6496μg，r=1.000；阿魏酸線性范圍為0.0209～0.3344μg，r=0.9997。平均回收率分別為100.46%、101.55%，RSD均小于2.0%。結(jié)論：該方法專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可用于控制四物湯配方顆粒的質(zhì)量。

四物湯配方顆粒 芍藥苷 阿魏酸 薄層色譜 高效液相色譜

四物湯由白芍、當(dāng)歸、熟地黃、川芎四味藥組成。該方最早見于唐代藺道人的《仙授理傷續(xù)斷秘方》，為治療營血虛滯的著名方劑，具有補(bǔ)血和血功效。四物湯臨床上用于血虛所致的面色萎黃、頭暈眼花、心悸氣短及月經(jīng)不調(diào)的治療，效果顯著。藥效學(xué)研究和臨床研究顯示，該方具有抗缺氧、免疫調(diào)節(jié)、抗自由基損傷、血液系統(tǒng)作用及雙向調(diào)節(jié)子宮平滑肌的作用，原方或其加減方現(xiàn)代臨床常用于治療胎位不正、月經(jīng)失調(diào)、功能性子宮出血、子宮肌瘤等婦科疾病，還可用于內(nèi)科、皮膚科疾病的治療，取得了較好的治療效果。2015年版《中國藥典》一部［1］收載了四物合劑的制劑標(biāo)準(zhǔn)，其中阿魏酸是川芎和當(dāng)歸共同含有的活性成分，具有抗血小板凝集和血栓的作用［2］，芍藥苷為白芍主要活性成分，用于對抗急性心肌缺血，降低血壓，擴(kuò)張冠狀動脈，增加冠脈流量［3］。

四物湯配方顆粒是由白芍、當(dāng)歸、熟地黃、川芎四味藥按古方比例用水煎煮后制粒而成，在傳承中藥配方顆粒的優(yōu)點(diǎn)的情況下，按照中醫(yī)藥整體觀念，將其制成復(fù)方顆粒劑，充分發(fā)揮群藥共煎及配伍的優(yōu)勢，同時(shí)克服湯劑臨時(shí)煎煮不便、服用量大、易霉敗變質(zhì)等缺點(diǎn)。本研究在參考文獻(xiàn)［4］的基礎(chǔ)上，對四物湯配方顆粒中的熟地黃、白芍、當(dāng)歸和川芎進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法測定芍藥苷、阿魏酸的含量。

1　儀器與試藥

1.1儀器：Waters 2695高效液相色譜儀、Waters 2489紫外檢測器、Empower 2 Personal Single System SW化學(xué)工作站；Kromasil 100-5 C18柱（4.6mm×150mm，5μm）；薄層色譜自動點(diǎn)樣儀（CAMAG AUTOMATIC TLC SAMPLER4）、薄層自動成像儀（CAMAG REPROSTAR 3）；BS110S萬分之一天平（賽多利斯）、xP26百萬分之一天平（METTLER TOLEDO）；CQ-25-6超聲波清洗器（上海音波聲電科技公司）。

1.2試藥：芍藥苷（供含量測定用，批號：110736-201035）；阿魏酸（供含量測定用，批號：110773-201012）；白芍對照藥材（供薄層鑒別用，批號：905-9204），均購自中國藥品生物制品檢定所；5-羥甲基糠醛（西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司提供，供含量測定用，批號：1001200655）；四物湯配方顆粒（自制，批號：20141101、20141102、20141103）；陰性對照樣品按處方藥味除去被測藥材，其余藥味，按四物湯配方顆粒的生產(chǎn)工藝及供試品溶液的制備方法制備，即得。實(shí)驗(yàn)用四批藥材均購自安徽省本草國藥飲片有限公司，經(jīng)魏梅副主任中藥師鑒定均為正品。

2　方法與結(jié)果

2.1薄層鑒別

2.1.1當(dāng)歸、川芎的薄層鑒別：取本品0.8g，研細(xì)，加水40mL使溶解，用乙醚萃取2次，每次30mL，合并乙醚，揮干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取阿魏酸對照品，加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液，作為對照品溶液。按處方比例及制法，制成缺當(dāng)歸、川芎的陰性對照樣品，取相當(dāng)于供試品的量，按照供試品溶液的制備方法，制成缺當(dāng)歸、川芎的陰性樣品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.3）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照樣品無干擾，結(jié)果見圖1。

2.1.2白芍的薄層鑒別：取本品1g，研細(xì)，加水30mL使溶解，用水飽和正丁醇溶液萃取2次，每次25mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取白芍對照藥材1g，加水60mL，煎煮30min，濾過，濾液用水飽和正丁醇溶液萃取2次，同法制成對照藥材溶液。按處方比例及制法，制成缺白芍的陰性對照樣品，取相當(dāng)于供試品的量，按照供試品溶液的制備方法，制成缺白芍的陰性樣品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液5μL，對照藥材溶液2μL分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛濃硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照樣品無干擾，結(jié)果見圖2。

2.1.3熟地黃的薄層鑒別：取本品2g，研細(xì)，加水50mL使溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次50mL，合并乙酸乙酯，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取5-羥甲基糠醛對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。按處方比例及制法，制成缺熟地黃的陰性對照樣品，取相當(dāng)于供試品的量，按照供試品溶液的制備方法，制成缺熟地黃的陰性樣品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述供試品10μL，對照品1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯（2∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對照樣品無干擾，結(jié)果見圖3。

2.2含量測定

2.2.1色譜條件：色譜柱：KromasiL 100-5 C18柱（4.6mm×150mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%醋酸（10∶90）；流速：1mL·min-1；檢測波長：240nm；柱溫30℃。進(jìn)樣量：10μL；塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

2.2.2溶液的制備

2.2.2.1對照品溶液的制備：精密稱取芍藥苷對照品2.58mg，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1mL含芍藥苷0.1032mg）；精密稱取阿魏酸對照品1.048mg（99.6%），置50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1mL含阿魏酸0.0209mg）。

2.2.2.2供試品溶液的制備：取本品，研細(xì)，取約0.4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率33kHz）30min，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.3陰性樣品溶液的制備：采用上述四物湯配方顆粒的制備方法分別制備缺白芍陰性樣品、缺熟地黃陰性樣品和缺當(dāng)歸、川芎陰性樣品，按供試品溶液的制備方法，分別制備陰性樣品溶液。2.2.3專屬性考察：分別吸取芍藥苷對照品溶液、阿魏酸對照品溶液、四物湯配方顆粒供試品溶液、陰性樣品溶液，按上述四物湯配方顆粒的含量測定方法，四物湯配方顆粒中芍藥苷、阿魏酸峰應(yīng)與相鄰的峰分離度大于1.5，陰性樣品色譜在芍藥苷、阿魏酸峰相應(yīng)位置上無干擾。結(jié)果見圖4。 2.2.4線性關(guān)系考察：分別精密吸取芍藥苷、阿魏酸對照品溶液0.5、1、2、4、8、12、16μL，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，芍藥苷進(jìn)樣量在0.1031～1.6496μg時(shí)與峰面積呈良好的線性關(guān)系?；貧w方程為Y=1052006x-4783，r=1.000。阿魏酸進(jìn)樣量在0.0209～0.3344μg時(shí)與峰面積呈良好的線性關(guān)系?；貧w方程為Y= 3337200x+1928，r=0.9997。

2.2.5精密度考察：取一份四物湯配方顆粒供試品溶液，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定芍藥苷、阿魏酸峰面積。結(jié)果，芍藥苷峰面積的RSD為1.76%，阿魏酸峰面積的RSD為1.11%，表明儀器的精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性考察：取同一四物湯配方顆粒供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、2、4、6、8、12h進(jìn)樣，測定芍藥苷、阿魏酸峰面積。結(jié)果，在12h內(nèi)測得四物湯配方顆粒中芍藥苷的峰面積RSD為1.10%、阿魏酸的峰面積RSD為1.36%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7重復(fù)性考察：取同一四物湯配方顆粒，按上述方法平行制備供試品溶液六份，分別測定芍藥苷、阿魏酸含量。結(jié)果，芍藥苷平均含量為6.198mg·g-1，RSD為0.37%；阿魏酸平均含量為0.606mg·g-1，RSD為1.29%，此樣品中含量測定方法重復(fù)性較好。

2.2.8回收率考察：取已知含量的四物湯配方顆粒粉末約0.2mg（芍藥苷含量：6.198mg·g-1、阿魏酸含量：0.606mg·g-1），精密稱定，共六份，置具塞錐形瓶中，精密加入含芍藥苷、阿魏酸混合對照品（甲醇溶解，芍藥苷濃度為0.05352g·L-1，阿魏酸濃度為0.005724g·L-1）25mL，按“2.3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1、表2。

表1　四物湯配方顆粒芍藥苷含量測定回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2　四物湯配方顆粒阿魏酸含量測定回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9樣品含量測定：分別制備3批四物湯顆粒劑供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，采用外標(biāo)法計(jì)算四物湯配方顆粒中2種成分含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3　3批四物湯配方顆粒含量測定結(jié)果

3　討論

本次熟地黃的薄層鑒別實(shí)驗(yàn)過程中，曾經(jīng)嘗試使用熟地黃對照藥材，但發(fā)現(xiàn)對照藥材色譜與供試品色譜斑點(diǎn)有差異，故只采用5-羥甲基糠醛對照品作對照。曾經(jīng)嘗試采用石油醚（60-90）-乙酸乙酯（1∶1）的方法展開，但展開效果不理想，最后選擇甲苯-乙酸乙酯（1∶1）的方法，經(jīng)過試驗(yàn)調(diào)整比例為甲苯-乙酸乙酯（2∶3），效果較好。

當(dāng)歸、川芎的薄層鑒別實(shí)驗(yàn)過程中，曾經(jīng)嘗試使用當(dāng)歸、川芎對照藥材，但發(fā)現(xiàn)對照藥材色譜比四物湯供試品色譜多了揮發(fā)油的斑點(diǎn)，故只采用阿魏酸對照品對照。曾經(jīng)嘗試采用正己烷-乙酸乙酯（9∶1）、甲苯-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶0.1）的方法展開，但展開效果不理想，最后選擇環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）的方法，經(jīng)過試驗(yàn)調(diào)整比例為環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.3），效果較好。

白芍的薄層鑒別實(shí)驗(yàn)過程中，參考藥典方法，曾采用乙醇提取，但斑點(diǎn)很多分不開，效果不好。使用正丁醇提取，并采用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，效果較好。

本次含量測定方法的建立，在流動相的選擇上，文獻(xiàn)中已有多種報(bào)道，曾經(jīng)嘗試以甲醇-0.1%醋酸（14∶86）、甲醇-0.1%磷酸（14∶86）、乙腈-0.1%磷酸（20∶80）等方法用于本樣品分離，但效果均不夠理想，本試驗(yàn)采用流動相乙腈-0.1%醋酸（10∶90）的比例，能使芍藥苷、阿魏酸的色譜峰形對稱、結(jié)果保留時(shí)間適中、分離效果較好，可以滿足含量測定的基本要求。

本次研究曾經(jīng)對四物湯配方顆粒供試品制備的提取方法（超聲提取、加熱回流提?。?、提取溶劑（甲醇、75%甲醇、50%甲醇）、提取時(shí)間（20、30、40min）進(jìn)行優(yōu)選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用超聲提取時(shí)，芍藥苷、阿魏酸的含量都比加熱回流提取高，故選擇超聲提取。采用甲醇提取時(shí)，芍藥苷、阿魏酸的含量都比75%甲醇、50%甲醇高，故選擇甲醇提取。提取時(shí)間為20、30、40min時(shí)，芍藥苷、阿魏酸含量相差不大，考慮到節(jié)能降耗及操作方便問題，故選擇超聲時(shí)間30min。本次研究建立的方法簡便可行、重復(fù)性好、陰性無干擾，為四物湯配方顆粒的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2015年版一部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：786-787.

［2］夏醒醒，張蓓蕾，陳勤.RP-HPLC法測定四物合劑中阿魏酸的含量［J］.中國藥事，2007，21（4）：247-249.

［3］孟令丹，陳曉輝，姚燕，等.RP-HPLC法同時(shí)測定四物合劑中芍藥苷和阿魏酸的含量［J］.藥物分析雜志，2006，26（10）：1398-1400.

［4］周海燕.四物湯配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)示范性研究［D］.成都中醫(yī)藥大學(xué)，2006.

Objective：To establish a quality standard for Siwutang Peifangkeli.Methods：Radix Paeoniae Alba，Radix Angelicae Sinensis，Rhizoma Chuanxiong and Radix Rehmanniae were indentified by TLC.The contents of Paeoniflorin and Ferulic acid were determined by HPLC.Results：The specific spots of Radix Paeoniae Alba，Radix Angelicae Sinensis，Rhizoma Chuanxiong and Radix Rehmanniae could be detected by TLC.The linear calibration curves were established in the concentration range of 0.1031～1.6496μg（r=1.000）for Paeoniflorin and 0.0209～0.3344μg（r=0.9997）for Ferulic acid.The average recoveries of Paeoniflorin and Ferulic acid were 100.46% and 101.55%，respectively.All the relative standard deviations were Less than2.0%.Conclusion：The method is simple，feasible and reproducible.It can be used for quality control of Siwutang Peifangkeli.

Siwutang Dispensing Granule Paeoniflorin；Ferulic acidTLC HPLC

R284.1

A

1672-8351（2016）02-0001-03