盛晶夢(mèng)，張發(fā)宇，袁夢(mèng)媛，汪家權(quán)

合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥　230009

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粉末活性炭吸附-雙水相萃取法提純?cè)逅{(lán)蛋白工藝研究

盛晶夢(mèng)，張發(fā)宇，袁夢(mèng)媛，汪家權(quán)*

合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥230009

采取粉末活性炭吸附-雙水相萃取的工藝方法，以巢湖新鮮藍(lán)藻藻泥為原料提純?cè)逅{(lán)蛋白，在考慮煤質(zhì)粉末活性炭添加量的基礎(chǔ)上，探究粉末活性炭純化藻藍(lán)蛋白的效果。通過單因素和正交試驗(yàn)，確定粉末活性炭吸附-雙水相萃取法純化藻藍(lán)蛋白的最優(yōu)工藝條件：PEG分子量為4 000做高聚物，PEG濃度為4%，磷酸鉀鹽濃度為16%，體系pH為7.0。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過優(yōu)化工藝純化后藻藍(lán)蛋白純度可達(dá)到3.461 7，組合工藝回收率為63%。與傳統(tǒng)方法相比，該工藝具有設(shè)備小、成本低、周期短等特點(diǎn)。

粉末活性炭；雙水相；提取純化；藻藍(lán)蛋白

巢湖的富營養(yǎng)化進(jìn)程加劇、藍(lán)藻滋生，成為全國富營養(yǎng)化最為嚴(yán)重的淡水湖泊之一[1-3]。藍(lán)藻的資源化利用已經(jīng)成為巢湖藍(lán)藻重點(diǎn)研究的課題[4]。目前，國內(nèi)外對(duì)藍(lán)藻處理的研究主要集中在無害化處理和資源化利用方面，以制作有機(jī)肥料和發(fā)酵制沼氣為主[5-6]。但這2種方法的經(jīng)濟(jì)效益較低，產(chǎn)品附加值不高，難以市場(chǎng)化推廣。近年來，利用藍(lán)藻生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品——藻藍(lán)蛋白成為研究重點(diǎn)。

藻藍(lán)蛋白是一種重要的藻膽蛋白，呈藍(lán)色粉末狀，無毒，溶于水。研究表明，藻藍(lán)蛋白具有抗氧化性[7-8]、抗癌性[9]、抗炎性[10]、抗衰老性[11]、免疫熒光性[12-13]等特點(diǎn)。藻藍(lán)蛋白純度的高低決定了其應(yīng)用和價(jià)值，純度越高，售價(jià)越高，根據(jù)藻藍(lán)蛋白純度的不同可將其分為食品級(jí)(純度>0.7)和試劑級(jí)(純度>4.0)[14]。

國內(nèi)外對(duì)藻藍(lán)蛋白的提取純化工藝的研究有很多[15-20]，在細(xì)胞破碎和粗提階段多采用反復(fù)凍融法、超聲波破碎法或者二者相結(jié)合來破碎藻細(xì)胞，再用硫酸銨鹽析沉淀出粗蛋白；在精制階段，多為2種以上色譜技術(shù)的聯(lián)用或重復(fù)多次使用。這些工藝在推廣到實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)過程中往往具有操作步驟復(fù)雜、產(chǎn)量損失大、能耗高、周期長(zhǎng)等問題[21]。粉末活性炭吸附法具有效果穩(wěn)定、成本低等特點(diǎn)，多用于水處理工藝中，有關(guān)活性炭及與其他方法聯(lián)合應(yīng)用純化藻藍(lán)蛋白的研究卻很少[22]。而雙水相萃取技術(shù)作為近年來發(fā)展較快的新技術(shù)，在生物質(zhì)純化過程中應(yīng)用較多[21]。筆者采用粉末活性炭粗提-雙水相萃取的組合工藝提純?cè)逅{(lán)蛋白，該方法具有操作簡(jiǎn)單、試驗(yàn)周期短、藻藍(lán)蛋白純化效率高的特點(diǎn)，對(duì)于藻藍(lán)蛋白規(guī)模化生產(chǎn)具有十分重要的借鑒意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

藍(lán)藻原料采用實(shí)驗(yàn)室冷柜中儲(chǔ)存的巢湖新鮮藍(lán)藻藻泥，取自西湖區(qū)水華表層20 cm水體處，含水量約為96.2%，采集日期為2015年8月4日，室外溫度37～38 ℃。

試劑：煤質(zhì)粉末活性炭(廣州市鴻生炭業(yè)化工有限公司)、鹽酸(HCl，上海博河精細(xì)化學(xué)品有限公司)、氫氧化鈉(NaOH，西隴化工股份有限公司)、聚乙二醇1000(PEG 1000，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)、聚乙二醇2000(PEG 2000，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)、聚乙二醇4000(PEG 4000，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)、聚乙二醇6000(PEG 6000，西隴化工股份有限公司)、磷酸鉀鹽(KH2PO4和K2HPO4，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；KH2PO4與K2HPO4的質(zhì)量比為1∶1.85)。

1.2儀器與設(shè)備

1.3分析方法

粉末活性炭粗提后藻藍(lán)蛋白存在于上清液中，雙水相萃取后藻藍(lán)蛋白富集于體系上相高聚物中。將藻藍(lán)蛋白溶液在波長(zhǎng)為200～700 nm下進(jìn)行紫外光譜掃描，藻藍(lán)蛋白的純度參考Herrera等[23]推薦的公式，藻藍(lán)蛋白的濃度參考Soni等[24]推薦的公式。并計(jì)算出上清液中藻藍(lán)蛋白的回收率和雙水相上相中藻藍(lán)蛋白的得率。

藻藍(lán)蛋白純度(P)=A620A280

藻藍(lán)蛋白濃度(C)=(A620-0.7×A650)7.38

藻藍(lán)蛋白回收率(Y活)=(CtVtC0V0)×100%

雙水相上相中藻藍(lán)蛋白得率(Y雙)=

CAVA(CAVA+CBVB)×100%

式中：A280、A620和A650分別為波長(zhǎng)280、620和650 nm處的吸光度；Ct為上清液中的藻藍(lán)蛋白濃度；C0為粗提液中的藻藍(lán)蛋白濃度；CA為雙水相上相中藻藍(lán)蛋白濃度；CB為雙水相下相中藻藍(lán)蛋白濃度；Vt為樣品溶液的體積；V0為粗提液的體積；VA為雙水相上相溶液的體積；VB為雙水相下相溶液的體積。

1.4制備藻藍(lán)蛋白粗提液

取-4 ℃下冷凍保存的巢湖新鮮藍(lán)藻藻泥在室溫(25 ℃)下融解，完成一次凍融破壁。重復(fù)該過程3次，將解凍后的藍(lán)藻溶液用4層普通紗布過濾去除藻渣，所得溶液于4 ℃、8 000 rmin下離心20 min后取上清液，即得到藻藍(lán)蛋白粗提液。

1.5藻藍(lán)蛋白提純

室溫(25 ℃)條件下，取藻藍(lán)蛋白粗提液20 mL，將適量粉末活性炭與粗提液充分?jǐn)嚢?0 min，離心取上清液，測(cè)定并計(jì)算溶液中藻藍(lán)蛋白的純度和回收率。將粉末活性炭處理后的上清液移入燒杯中置于磁力攪拌器上，向燒杯中逐步加入適量PEG和磷酸鉀鹽，并用去離子水調(diào)節(jié)，使雙水相體系總質(zhì)量為30 g，充分?jǐn)嚢杈鶆蚴筆EG和磷酸鉀鹽全部溶解后將溶液移入離心管，在4 ℃、6 000 rmin下離心1 min以加速體系分層，分別吸取雙水相體系上下相，測(cè)定上下相體積、上下相中藻藍(lán)蛋白純度與濃度，計(jì)算藻藍(lán)蛋白回收率和雙水相體系分配系數(shù)。

1.6藻藍(lán)蛋白光譜分析

分別將藻藍(lán)蛋白粗提液和純化后的藻藍(lán)蛋白溶液用去離子水稀釋至25倍，用紫外可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為200～700 nm進(jìn)行全波段掃描。

2　結(jié)果與討論

2.1粉末活性炭粗提藻藍(lán)蛋白條件優(yōu)化

前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，粉末活性炭添加量對(duì)其純化藻藍(lán)蛋白的效果影響最為顯著，因此在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)研究粉末活性炭添加量對(duì)藻藍(lán)蛋白純化效果的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1　粉末活性炭添加量對(duì)藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響(25 ℃)Fig.1　Effect of powered activated carbon dosage on C-phycocyanin purity and recovery(25 ℃)

由圖1可知，隨著粉末活性炭添加量的增加，藻藍(lán)蛋白的純度先增加后減少，而回收率則持續(xù)下降。這可能是由于隨著粉末活性炭添加量的增加，中孔和大孔的比例增加、容積增大，對(duì)藻藍(lán)蛋白的不可逆吸附逐漸增強(qiáng)，從而使藻藍(lán)蛋白的損失量逐漸大于粉末活性炭對(duì)雜質(zhì)蛋白的吸收量。綜合考慮純度和回收率，粉末活性炭的添加量定為100 gL，此時(shí)藻藍(lán)蛋白的純度為1.849 4，回收率為62%，溶液呈清亮的藍(lán)色。

2.2雙水相萃取藻藍(lán)蛋白條件優(yōu)化

2.2.1高聚物分子量的確定

設(shè)定磷酸鉀鹽濃度為20%，體系pH為7.0，PEG濃度為10%，取分子量分別為1 000、2 000、4 000、6 000的PEG進(jìn)行雙水相萃取試驗(yàn)，測(cè)定上下相體積、上下相中藻藍(lán)蛋白純度與濃度，計(jì)算藻藍(lán)蛋白回收率和雙水相體系分配系數(shù)，結(jié)果見圖2。

圖2　PEG分子量對(duì)藻藍(lán)蛋白萃取效果的影響Fig.2　The effect of PEG formula weight on C-phycocyanin extraction

由圖2可知，隨著PEG分子量的增加，藻藍(lán)蛋白的純度、回收率和分配系數(shù)均先增加后減少。藻藍(lán)蛋白的純度和回收率在PEG分子量為4 000時(shí)達(dá)到最大值，而分配系數(shù)則在PEG分子量為2 000時(shí)達(dá)到最大值。原因可能是隨著PEG分子量的增加，上相的疏水性也增加，親水性的藻藍(lán)蛋白便轉(zhuǎn)向下相。綜合考慮回收率、分配系數(shù)和純度3項(xiàng)指標(biāo)，選取PEG分子量為4 000作為雙水相萃取最優(yōu)條件之一。

2.2.2PEG濃度的確定

設(shè)定磷酸鉀鹽濃度為20%，體系pH為7.0，PEG分子量為4 000，PEG濃度為2%～14%進(jìn)行雙水相萃取試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。

圖3　PEG 4000濃度對(duì)藻藍(lán)蛋白萃取效果的影響Fig.3　The effect of PEG 4000 concentration on C-phycocyanin extraction

由圖3可知，隨著PEG濃度的增加，藻藍(lán)蛋白的純度和分配系數(shù)緩慢下降，回收率一直處于較高水平且保持穩(wěn)定。這是由于隨著PEG濃度的增加，上相的黏稠度也逐漸增加，分子阻力增大，導(dǎo)致藻藍(lán)蛋白越難以進(jìn)入上相。綜合考慮回收率、分配系數(shù)和純度3項(xiàng)指標(biāo)，選取PEG濃度為6%作為雙水相萃取最優(yōu)條件之一。

2.2.3磷酸鉀鹽濃度的確定

設(shè)定PEG 4000濃度為6%，體系pH為7.0，磷酸鉀鹽濃度為12%～24%進(jìn)行雙水相萃取試驗(yàn)，結(jié)果見圖4。

圖4　磷酸鉀鹽濃度對(duì)藻藍(lán)蛋白萃取效果的影響Fig.4　The effect of potassium phosphate concentration on C-phycocyanin extraction

由圖4可知，隨著磷酸鉀鹽濃度的增加，藻藍(lán)蛋白的純度緩慢下降，分配系數(shù)緩慢提高然后降低，回收率一直處于較高水平且保持穩(wěn)定。這可能是由于隨著磷酸鉀鹽濃度的升高，下相鹽析的作用增加，藻藍(lán)蛋白及其他雜蛋白向上相遷移；而當(dāng)磷酸鉀鹽濃度過高時(shí)，藻藍(lán)蛋白被部分或全部析出，上相分配系數(shù)下降。綜合考慮回收率、分配系數(shù)和純度3項(xiàng)指標(biāo)，選取磷酸鉀鹽濃度為16%作為雙水相萃取最優(yōu)條件之一。

2.2.4體系pH確定

設(shè)定PEG 4000濃度為6%，磷酸鉀鹽濃度為16%，分別調(diào)節(jié)體系pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0進(jìn)行雙水相萃取試驗(yàn)，結(jié)果見圖5。

圖5　pH對(duì)藻藍(lán)蛋白萃取效果的影響(25 ℃)Fig.5　The effect of pH on C-phycocyanin extraction

由圖5可知，隨著體系pH的增加，藻藍(lán)蛋白的純度和分配系數(shù)先增后減，在pH為7.0時(shí)均達(dá)到最大值；藻藍(lán)蛋白的回收率則一直保持在較高水平且基本不變。這是由于pH會(huì)改變?cè)逅{(lán)蛋白分子、成相分子和相界面的電性，從而改變?cè)逅{(lán)蛋白在上下相的分配；當(dāng)體系pH為7.0時(shí)，藻藍(lán)蛋白表面所帶的靜電荷幾乎為0，與PEG之間的作用最強(qiáng)。綜合考慮藻藍(lán)蛋白的純度、分配系數(shù)和回收率3項(xiàng)指標(biāo)，選擇體系pH為7.0作為雙水相萃取的最優(yōu)水平之一。

2.2.5雙水相萃取正交試驗(yàn)

以PEG分子量、PEG濃度、磷酸鉀鹽濃度和體系pH為正交試驗(yàn)的4個(gè)因素，根據(jù)之前單因素試驗(yàn)的結(jié)果來確定每個(gè)因素合適的4個(gè)水平，按照L16(44)建立正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)水平設(shè)置和結(jié)果見表1，直觀分析結(jié)果見表2。

表1　雙水相萃取正交試驗(yàn)結(jié)果

(續(xù)表1)

表2　雙水相萃取正交直觀分析

根據(jù)表2可知，因素A、D關(guān)于3個(gè)指標(biāo)的優(yōu)水平是一致的，所以可以直接作為最優(yōu)水平；而因素B對(duì)于純度和分配率2個(gè)指標(biāo)的影響次序均為第一、優(yōu)水平均為B1，對(duì)于回收率指標(biāo)的影響次序?yàn)榈诙?、?yōu)水平為B2，考慮試驗(yàn)指標(biāo)k值減少最小原則，B因素的優(yōu)水平確定為B1；同樣，C因素的優(yōu)水平確定為C2。綜合衡量評(píng)價(jià)所有指標(biāo)優(yōu)組合，最終確定雙水相萃取藻藍(lán)蛋白最優(yōu)工藝條件為A3B1C2D2。

在優(yōu)化條件下驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明:雙水相萃取后，藻藍(lán)蛋白的純度為3.461 7，組合工藝綜合回收率為63%。丙瀟瀟[25]用PEG 1000與硫酸銨組成的雙水相體系純化藻藍(lán)蛋白粗提液，藻藍(lán)蛋白的純度僅能由0.57升至1.00，回收率為97.2%。由此可見，本研究所得粉末活性炭粗提-雙水相萃取工藝具有設(shè)備小、成本低、操作周期短等特點(diǎn)，對(duì)藻藍(lán)蛋白市場(chǎng)化推廣具有實(shí)際指導(dǎo)意義。

3　結(jié)論

采用粉末活性炭吸附-雙水相萃取法提純?cè)逅{(lán)蛋白，通過對(duì)粉末活性炭添加量和雙水相萃取條件進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，得出最優(yōu)工藝條件：粉末活性炭添加量為100 gL，PEG 4000濃度為4%，磷酸鉀鹽濃度為16%，雙水相體系pH為7.0。在最優(yōu)工藝條件下，純化后的藻藍(lán)蛋白純度可達(dá)3.461 7，提純效果遠(yuǎn)好于僅使用雙水相萃取藻藍(lán)蛋白粗提液。由此可見，將粉末活性炭吸附法與雙水相萃取法聯(lián)合應(yīng)用能夠達(dá)到進(jìn)一步純化藻藍(lán)蛋白的目的，且操作簡(jiǎn)單，純化效率高。

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Study on Extraction and Purification of C-phycocyanin by Combined Use of Powdered Activated Carbon Treatment and Aqueous Two-phase Extraction from Cyanobacteria

SHENG Jingmeng, ZHANG Fayu, YUAN Mengyuan, WANG Jiaquan

School of Resources and Environmental Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China

Extraction and purification of C-phycocyanin were performed by the combined use of powdered activated carbon (PAC) treatment and aqueous two-phase extraction from fresh Cyanobacteria mud in Chaohu Lake. Firstly, the effects of PAC on purification of C-phycocyanin were studied by considering the dosage of powdered activated carbon. Then, the single factor and orthogonal experiments were conducted to determine the optimum conditions in the PAC treatment and aqueous two-phase purification, which were PEG 4000 as polymer, the PEG 4000 concentration 4%, the potassium phosphate concentration 16% and pH 7.0. The verification test showed that after the purification by the optimized process, the purity and recovery rate of C-phycocyanin could reach to 3.461 7 and 63%, respectively. It was with less equipment requirements, lower cost and shorter time, etc., compared with traditional methods.

powdered activated carbon; aqueous two-phase extraction; extraction and purification; C-phycocyanin

2016-02-27

國家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)(2012ZX07103-004)

盛晶夢(mèng)(1991—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境污染控制工程，abbylw2015@163.com

*責(zé)任作者：汪家權(quán)(1957—)，男，教授，研究方向?yàn)樗幚砑夹g(shù)，jiaquan.wang@163.com

X703

1674-991X(2016)05-0469-07

10.3969j.issn.1674-991X.2016.05.069