葛麗麗,楊小昂,樸軍顏,尹艷慧,張 毓
(1.河南省鄭州市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科 450053;2.鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院 450052;3.北京大學(xué)免疫學(xué)系T細(xì)胞室 100083)
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論著·基礎(chǔ)研究
基因芯片篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FATE/BJ-HCC-2基因的肝癌細(xì)胞中腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)差異表達(dá)基因*
葛麗麗1,楊小昂2,樸軍顏2,尹艷慧3,張毓3
(1.河南省鄭州市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科450053;2.鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院450052;3.北京大學(xué)免疫學(xué)系T細(xì)胞室100083)
目的篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FATE/BJ-HCC-2基因的肝癌細(xì)胞中腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異表達(dá)基因。方法分別提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FATE/BJ-HCC-2的肝癌細(xì)胞(5B4)及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞(Mock)總RNA,通過(guò)基因芯片技術(shù)篩選差異表達(dá)基因。結(jié)果與Mock細(xì)胞比較,5B4細(xì)胞共篩選出1 694個(gè)差異表達(dá)基因,有11個(gè)基因表達(dá)差異明顯,其中MMP-1、PTGS2、FN、CA9、IL-8、ILK、Areg 7個(gè)基因在轉(zhuǎn)染FATE/BJ-HCC-2基因后表達(dá)量明顯上升,差異倍數(shù)分別為81.80、49.86、11.30、16.26,3.48、2.79、2.20。E-cadherin、RhoBTB3、ALPP、HLA-DRB 4個(gè)基因表達(dá)量明顯下降,差異倍數(shù)分別為-5.42、-2.23、-5.93、-8.03。結(jié)論采用基因芯片技術(shù)對(duì)FATE/BJ-HCC-2參與的肝癌轉(zhuǎn)移的差異表達(dá)基因進(jìn)行細(xì)致的篩選,其最終目的是為研究肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
肝腫瘤;基因芯片;基因差異表達(dá)
肝癌具有隱匿性強(qiáng)、容易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn),并且很多患者在確診的時(shí)候已經(jīng)處于疾病的晚期,還出現(xiàn)了嚴(yán)重的腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,所以高度轉(zhuǎn)移是肝癌的一個(gè)非常重要的生物學(xué)特征。如果肝癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移,就會(huì)對(duì)后期的預(yù)后及患者的生存概率產(chǎn)生非常嚴(yán)重的影響,是致死的主要原因[1]。作者前期的研究結(jié)果顯示,F(xiàn)ATE/BJ-HCC-2 mRNA在肝癌組織中高表達(dá),與肝癌組織分化程度相關(guān),并且能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[2-3]。經(jīng)過(guò)大量的研究分析發(fā)現(xiàn),肝癌細(xì)胞發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移的機(jī)制主要是由很多的分子和信號(hào)通路聯(lián)合形成的。這些分子的作用主要是對(duì)肝癌細(xì)胞在體內(nèi)的侵襲產(chǎn)生促進(jìn)作用,并且在惡性循環(huán)中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4-5]。
基因芯片,又稱DNA芯片、生物芯片,是將大量(通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高于400)探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷虾笈c標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交,主要是對(duì)所有的探針?lè)肿影l(fā)出的混雜信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè),然后獲得相應(yīng)樣品分子的數(shù)量及相關(guān)的信息等[6]。本文采用基因芯片技術(shù)在人全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FATE/BJ-HCC-2的肝癌細(xì)胞(5B4)及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞(Mock)之間基因表達(dá)譜的差異,尋找與FATE/BJ-HCC-2基因相關(guān)的肝癌轉(zhuǎn)移基因,探索肝癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
1.1材料穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FATE/BJ-HCC-2的肝癌細(xì)胞(5B4)及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞(Mock)均由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室建立及保存。10% 胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基(Gibco 公司);Trizol 試劑(Invitrogen 公司);Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array芯片 (北京博奧生物有限公司)。
1.2方法
1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng)將5B4和Mock細(xì)胞分別接種于含10%胎牛血清及10 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
1.2.2細(xì)胞總RNA提取取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5B4 和Mock細(xì)胞消化后分別加至1 mL Trizol試劑中,待液氮揮發(fā)后裝入EP管中,室溫靜置5 min;加入氯仿,劇烈振蕩15 s,室溫靜置5 min,4 ℃,離心半徑15 cm,12 000 r/min,低溫離心15 min;吸取上層水相,加入等量異丙醇,室溫放置10 min,12 000 r/min低溫離心15 min;棄上清液75%乙醇進(jìn)行漂洗,溫度控制在4 ℃。隨后10 000 r/min離心10 min。等到離心處理結(jié)束之后放到室溫環(huán)境中,并加入50 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水進(jìn)行溶解處理,最后放到-20 ℃的環(huán)境中儲(chǔ)存,以備下次使用。
1.2.3探針制備及芯片雜交首先,提取細(xì)胞總RNA,以T7Oligo(dT)Primer為引物,合成cDNA。然后,利用cDNA作為模板,選擇T7 Enzyme Mix進(jìn)行cRNA的合成,加入生物素biotin 100 μL,利用磁珠的純化作用對(duì)cRNA進(jìn)行處理,去掉其中的鹽類及酶類物質(zhì)。利用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array芯片進(jìn)行雜交。對(duì)cRNA進(jìn)行片段化處理(100 bp)后,置于預(yù)雜交液芯片中雜交,溫度為45 ℃,時(shí)間為10 min。將預(yù)雜交液取出,并加入相同體積的雜交液,利用生物素對(duì)cRNA進(jìn)行標(biāo)記處理后再次雜交,溫度為45 ℃,時(shí)間為16 h。最后,將芯片從爐中取出,進(jìn)行洗脫和染色處理。
1.2.4檢測(cè)與分析首先,芯片結(jié)果采用 Agilent Microarray Scanner 進(jìn)行細(xì)致的掃描,隨后會(huì)獲得相關(guān)基因表達(dá)的熒光信號(hào)的強(qiáng)度值,然后利用內(nèi)參基因信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)校對(duì)。接下來(lái)熒光信號(hào)的強(qiáng)度可以根據(jù)每個(gè)芯片上所檢測(cè)到P值,并結(jié)合數(shù)據(jù)集合的檢測(cè)值進(jìn)行分析:(1)檢測(cè)值(absolute call)不存在P(present)值的數(shù)據(jù)集合;(2)出現(xiàn)A(absent)或臨界值M(marginal)時(shí),表示不表達(dá)狀態(tài);(3)只有檢測(cè)值存在P的數(shù)據(jù)集才能夠進(jìn)行下一步的研究分析。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn):倍數(shù)變化值大于等于2.0或小于等于0.5。
1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)驗(yàn)證利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)差異基因在兩組細(xì)胞中的表達(dá)差異,觀察其檢測(cè)結(jié)果與基因芯片檢測(cè)結(jié)果是否一致。利用Primer5.0軟件自行設(shè)計(jì)引物,分別配置RT-PCR反應(yīng)體系,反應(yīng)體系如下:SYBR Green 10 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,dNTP 1 μL,Taq酶2 μL,cDNA 5 μL,ddH2O 30 μL,總體積為50 μL。將每管溶液混勻,6 000 r/min離心2 min。將配置好的反應(yīng)體系置于RT-PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性 3 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 25 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃ 延伸5 min。
2.1總 RNA提取結(jié)果 提取5B4 和Mock 細(xì)胞總 RNA,經(jīng)甲醛變性凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果可見(jiàn),細(xì)胞RNA電泳條帶清晰,5B4細(xì)胞RNA 的吸光度(A)值A(chǔ)260/A280為1.96;MOCK細(xì)胞RNA的A260/A280為1.97,均大于1.80;細(xì)胞總量大于或等于8 μg;電泳 28S與18S比值大于2∶1,樣品純度、總量及完整性均符合表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)要求。
2.2芯片雜交信號(hào)散點(diǎn)圖細(xì)胞的總RNA主要是利用基因芯片技術(shù)對(duì)差異表達(dá)基因結(jié)果進(jìn)行篩選,見(jiàn)圖1。該圖中的X軸表示的一個(gè)樣品的熒光信號(hào)強(qiáng)度值,Y軸表示的是另一個(gè)樣品的熒光信號(hào)強(qiáng)度值。圖中的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)都表示芯片上的對(duì)應(yīng)的一個(gè)基因點(diǎn)的雜交信號(hào),紅色的標(biāo)記表示B/A的比率值大于或等于2.0,綠色的標(biāo)記表示B/A的比率值小于或等于0.5,均為表達(dá)存在差異的基因,黑色的標(biāo)記表示的是B/A的比率值為0.5~2.0,這說(shuō)明表達(dá)幾乎不存在差異。該圖中的熒光信號(hào)值在對(duì)稱軸直線兩側(cè)也有少量的分布,說(shuō)明存在上調(diào)和下調(diào)基因。見(jiàn)圖1。
圖1 基因芯片雜交信號(hào)散點(diǎn)圖
2.3基因芯片檢測(cè)結(jié)果分析與Mock細(xì)胞相比,5B4細(xì)胞中11條基因表達(dá)差異顯著,其中上調(diào)基因7條,下調(diào)基因4條,見(jiàn)表1。按照基因GO的分類信息進(jìn)行研究,這些差異表達(dá)的基因大多數(shù)都分布在一些具有黏附、凋亡及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期特征的細(xì)胞上,有一些還會(huì)分布在具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的細(xì)胞中。
表1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FATE/BJ-HCC-2的肝癌細(xì)胞中 腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分子芯片分析
2.4RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,11條基因中有9條基因在兩組細(xì)胞中的mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中MPP1、PTGS2、CA9、IL-8、FN、ILK、Areg在5B4細(xì)胞中的mRNA表達(dá)量與Mock細(xì)胞相比明顯上調(diào),其差異倍數(shù)分別為:84.38、46.62、11.83、14.70、3.89、2.25、2.22。E-cadherin、RhoBTB3在5B4細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào),在Mock細(xì)胞中的mRNA表達(dá)量分別是5B4細(xì)胞中的15.06倍和5.68倍(P<0.05)。而ALPP和HLA-DRB在兩組細(xì)胞中的mRNA表達(dá)差異不明顯(P>0.05)。將RT-PCR檢測(cè)結(jié)果繪制成柱狀圖,結(jié)果表明,RT-PCR所測(cè)11條基因中有9條基因的表達(dá)結(jié)果與基因芯片檢測(cè)結(jié)果基本一致,超過(guò)80%以上,具有重要的參考價(jià)值,可以用于差異表達(dá)基因的篩選。
惡性腫瘤會(huì)向體內(nèi)的細(xì)胞侵犯,還會(huì)對(duì)周圍正常組織造成破壞,參與血液循環(huán),這一過(guò)程被稱為侵襲。腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程是互有關(guān)系的不同病理過(guò)程。侵襲是轉(zhuǎn)移的前奏和前提,轉(zhuǎn)移是侵襲的結(jié)果。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移指的是癌基因、抑癌基因參與到調(diào)節(jié)過(guò)程中并起到一定作用的復(fù)雜過(guò)程,能夠調(diào)控整個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程,具體途徑有:過(guò)度表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)系的基因以及所有相關(guān)基因產(chǎn)物參與其中。Liotta等[7]將癌細(xì)胞向細(xì)胞外浸潤(rùn)的步驟分成三大階段:(1)癌細(xì)胞與纖維連接蛋白、基質(zhì)成分板層素等特異性結(jié)合,這一步驟的實(shí)現(xiàn)必須有癌細(xì)胞受體分子參與;(2)癌細(xì)胞或其周圍的間質(zhì)細(xì)胞能夠與基質(zhì)相連接,它們所分泌的物質(zhì)可以將細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶分解;(3)細(xì)胞外基質(zhì)被分解以后,癌細(xì)胞可以在其中進(jìn)行移動(dòng)、轉(zhuǎn)移。經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn),多種分子及信號(hào)通路會(huì)促進(jìn)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生侵襲及轉(zhuǎn)移。肝癌細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的侵襲過(guò)程受到這些分子的促進(jìn),這些分子還在肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的惡性循環(huán)步驟中起到相當(dāng)重要的作用。所以說(shuō),將與肝癌轉(zhuǎn)移有關(guān)的一些分子篩選出來(lái)可以幫助探索肝癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制。
基因芯片技術(shù)與物理、化學(xué)、網(wǎng)絡(luò)信息學(xué)及生物學(xué)這些高新技術(shù)聯(lián)系到一起,操作步驟為cDNA或上千個(gè)特異性基因探針相雜交之后檢測(cè),然后再綜合分析及判斷所有基因表達(dá)的個(gè)體、組織、病變、刺激等特異性,這是一種實(shí)驗(yàn)方法。此方法利用綜合、全面、系統(tǒng)的觀點(diǎn)研究了生命這一現(xiàn)象。這一技術(shù)能夠避免出現(xiàn)像普通核酸印記技術(shù)這樣操作復(fù)雜、不能完全自動(dòng)化的缺點(diǎn),并且能夠采用大規(guī)模、高通量的方式來(lái)同時(shí)分析上千上萬(wàn)個(gè)基因[8]。所以說(shuō),基因芯片技術(shù)比其他尋找細(xì)胞或組織間差異表達(dá)基因的方法更好,能夠?qū)⒏鞣N細(xì)胞、組織中所有基因的表達(dá)規(guī)律、情況作出全面了解,該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用于同時(shí)成千上萬(wàn)基因的表達(dá)和大規(guī)?;虻陌l(fā)現(xiàn),以及多態(tài)性篩查和基因組DNA克隆的映射,為全面理解基因功能和基因之間的相互關(guān)系及發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。本研究通過(guò)提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FATE/BJ-HCC-2的肝癌細(xì)胞(5B4)及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞(MocK)中的總RNA,然后通過(guò)基因芯片技術(shù)將兩組細(xì)胞和肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的特異表達(dá)基因篩選出來(lái)。經(jīng)過(guò)篩選的基因一共有11條,其中7條上調(diào)基因和4條下調(diào)基因。這些基因主要作用是調(diào)控細(xì)胞的分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶活性及細(xì)胞因子之間的相互作用等。將11條基因進(jìn)行相關(guān)的RT-PCR反應(yīng),以確?;蛐酒Y(jié)果的準(zhǔn)確性,最終的結(jié)果表明,基因芯片的分析結(jié)果和RT-PCR反映實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本一致,由此可以說(shuō)明基因芯片分析結(jié)果具有較高的可信度。
根據(jù)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道可知,基因芯片篩查出來(lái)的11條基因均參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,與腫瘤的起始過(guò)程密不可分,并在腫瘤的遷移和侵襲中起著重要作用[9]。據(jù)報(bào)道,MMP1在甲狀腺癌、口腔鱗狀癌等腫瘤中高表達(dá),并與腫瘤的發(fā)展過(guò)程高度相關(guān)[10-11]。余海浪等[12]通過(guò)研究乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)譜,并對(duì)差異基因的相互關(guān)系進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)差異基因編碼蛋白間的相互作用主要表現(xiàn)在14個(gè)蛋白,而MMP1、MMP2、PTGS2在重要的節(jié)點(diǎn)位置,這些差異基因主要涉及細(xì)胞周期與增殖、細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、血管形成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物通路和生物過(guò)程[12]。有學(xué)者認(rèn)為,MMP與ILK可以相互影響共同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[13]。IL-8水平的高低與胃癌等多種腫瘤具有正相關(guān)性[14]。有文獻(xiàn)報(bào)道,HLA-DRB1的基因多態(tài)性也與乳腺癌的進(jìn)展過(guò)程具有密切關(guān)聯(lián)[15]。
本研究通過(guò)基因芯片技術(shù)成功篩選出了與FATE/BJ-HCC-2相關(guān)的肝癌轉(zhuǎn)移表達(dá)基因。與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞相比,這些與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FATE/BJ-HCC-2的肝癌細(xì)胞中明顯高表達(dá)或低表達(dá),說(shuō)明它們?cè)诟伟┺D(zhuǎn)移癌變過(guò)程中與FATE/BJ-HCC-2引起的肝癌轉(zhuǎn)移有著一定的聯(lián)系,其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。下一步研究將從基因組、蛋白質(zhì)組水平上對(duì)重點(diǎn)基因進(jìn)行檢測(cè),以確定肝癌轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵性分子和治療靶點(diǎn)。
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Screening of tumor metastasis related differentially expressed genes in hepatocellular carcinoma cells with FATE/BJ-HCC-2 gene stable transfection by gene chip*
GeLili1,YangXiaoang2,PiaoJunyan2,YinYanhui3,ZhangYu3
(1.DepartmentofClinicalLaboratory,ZhengzhouMunicipalChildren′sHospital,Zhengzhou,Henan450053,China;2.AcademyofMedicalandPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450052,China;3.TCellRoom,DepartmentofImmunology,PekingUniversity,Beijing100083,China)
ObjectiveTo screen the tumor metastasis related differentially expressed genes in hepatocelluar carcinoma(HCC)cells 7402 after stable transfection with FATE/BJ-HCC-2 gene.MethodsTotal RNA was extracted from FATE/BJ-HCC-2-transfected HCC(5B4)cells and empty vector control (Mock)cells respectively.Differentially expressed genes were obtained using cDNA microarray.ResultsCompared with Mock cells,a total of 1 694 differentially expressed genes were screened out in 5B4 cells,the 11 gene expressions had obvious differences,among which the expression amounts in 7 genes were significantly increased,including MMP-1,PTGS2,F(xiàn)N,CA9,IL-8,ILK and Areg.The fold changes were 81.80,49.86,11.30,16.26,3.48,2.79 and 2.20,respectively.The expression amounts in 4 genes were significantly decreased,including E-cadherin,E-cadherin,RHOBTB3,ALPP and HLA-DRB4.The fold changes were -5.42,-2.23,-5.93 and -8.03,respectively.ConclusionAdopting gene microarray technology can carefully screen the differentially expressed genes of FATE/BJ-HCC-2 involved HCC metastasis,its final goal is to lay a solid theoretical foundation for studying the HCC metastasis mechanism.
hepatocelluar neoplasms;gene chip;differential gene expression
10.3969/j.issn.1671-8348.2016.12.004
國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81071724);河南省基礎(chǔ)與前沿基金資助項(xiàng)目(142300413224)。作者簡(jiǎn)介:葛麗麗(1981-),檢驗(yàn)技師,碩士,主要從事免疫學(xué)檢驗(yàn)及研究工作。
R735.7
A
1671-8348(2016)12-1595-03
2015-11-08
2015-12-20)