徐禮羿，譚禮強(qiáng)，王麗鴛，齊桂年，成浩，韋康

1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川 成都 611130；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國(guó)家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008

茶樹炭疽病抗性的QTL分析

徐禮羿1，2，譚禮強(qiáng)1，2，王麗鴛2，齊桂年1*，成浩2，韋康2

1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川 成都 611130；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國(guó)家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008

以茶樹SSR遺傳連鎖圖譜為基礎(chǔ)，選取龍井43為母本，白毫早為父本的170株F1遺傳群體為試驗(yàn)材料，于2014年對(duì)該群體分別進(jìn)行了茶樹炭疽病抗性性狀的田間觀測(cè)和室內(nèi)侵染試驗(yàn)，并采用復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)該性狀進(jìn)行 QTL定位與分析。結(jié)果顯示：從 F1群體病葉上分離純化出一種茶樹炭疽病病菌 HZ-1，經(jīng)NCBI BLAST比對(duì)，其ITS基因序列與炭疽菌（Colletotrichum sp.）的親緣關(guān)系最近，序列相似度為99%。對(duì)F1群體的炭疽病抗性表型分析發(fā)現(xiàn)，田間環(huán)境下的感病單株的占比（41%）高于室內(nèi)環(huán)境（24%）。QTL分析顯示，在6個(gè)不同的遺傳連鎖群（Linkage group，LG）上共檢測(cè)到8個(gè)QTLs，單個(gè)QTL的LOD閾值變幅為2.53～6.80，單個(gè)QTL的表型變異貢獻(xiàn)率的變幅為5.6%～13.8%。LG10存在1個(gè)控制茶樹炭疽病抗性性狀的主效QTL，LOD值6.80，表型變異貢獻(xiàn)率13.8%。

炭疽病抗性；QTL定位；茶樹；SSR遺傳圖譜

炭疽病是廣泛存在于木本、草本植物中，由炭疽菌（Colletotrichum）引起的真菌病害，主要分布在熱帶與亞熱帶地區(qū)［1］。在園藝植物中炭疽病原菌會(huì)攻擊草莓［2-3］、芒果［4］、咖啡豆［5］、梨［6］、茶樹［7］等經(jīng)濟(jì)作物的果實(shí)、葉片等部位，極大地降低作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植株枯死。因此，炭疽病菌被認(rèn)為是世界上排名第八的植物病原真菌［8］。目前有研究顯示［9］，能侵染茶樹的炭疽病菌包括 C.karstii、C.fioriniae、C.fructicola、C.siamense、C.sp.1和C.sp.2等6個(gè)種。

茶樹［Camellia sinensis（L.）kuntze］是多年生木本植物，其葉片是加工茶葉的原料。2015年中國(guó)茶葉產(chǎn)量 227.8萬(wàn) t，為世界第一，因此茶樹已成為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物［10-12］。我國(guó)四大茶區(qū)主要分布在亞熱帶和熱帶地區(qū)，氣候很適宜炭疽菌的生長(zhǎng)和繁殖，每年的春夏之際是炭疽病害爆發(fā)的時(shí)期，全國(guó)各茶區(qū)受害嚴(yán)重。因此，選育具有優(yōu)良炭疽病抗性茶樹品種成為茶樹育種的一個(gè)新方向。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，進(jìn)而通過QTL（Quantitative trait locus，QTL）解析能揭示由多基因或寡基因控制的自然抗性等數(shù)量性狀，找到與目標(biāo)性狀緊密連鎖或共分離的標(biāo)記，借助分子標(biāo)記輔助選擇能顯著提高育種效率［13-14］。目前，國(guó)內(nèi)外研究已發(fā)現(xiàn)多個(gè)控制辣椒炭疽病抗性相關(guān)的主效QTLs［15-17］，茶樹方面卻尚未發(fā)現(xiàn)與炭疽病抗性相關(guān)的QTLs，故而本研究旨在利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建完成的SSR（Simple sequences repeats）連鎖遺傳圖譜，對(duì)作圖群體的炭疽病抗性進(jìn)行田間觀測(cè)和室內(nèi)侵染試驗(yàn)，比較不同環(huán)境下群體的抗性差異，并分別進(jìn)行QTL分析，發(fā)掘相關(guān)的QTL位點(diǎn)，為進(jìn)一步精細(xì)定位和克隆相關(guān)功能基因，以及分子標(biāo)記輔助育種提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

選用龍井43（LJ43，母本）與白毫早（BHZ，父本）為親本雜交得到的367株F1代中隨機(jī)選取170株用于QTL定位的材料。

1.2炭疽病菌的鑒定

從群體中挑取病害葉片，用刀片將病菌孢子（HZ-1）從病葉病斑上刮下置于顯微鏡下觀察后涂于PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d。3 d后經(jīng)篩選純化培養(yǎng)于新的PDA培養(yǎng)基中。培養(yǎng)7 d后用得到純化的病菌菌落提取 DNA（DP305 Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN），采用真菌通用引物ITS1/ITS4（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：2×Taq Master Mix for PAGE（Vazyme biotech，Nanjing，China）3.5μL，ddH2O4.1μL，上下游引物各0.2 μL和DNA模板20 ng。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；72℃最終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA測(cè)序，結(jié)果在NCBI上比對(duì)確認(rèn)菌種。

1.3田間觀測(cè)

于2014年8～9月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所資源圃分別調(diào)查了群體親本和 170株單株的葉片罹病率并進(jìn)行分級(jí)。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)［18］（表1）。

1.4室內(nèi)侵染試驗(yàn)

參照 Yoshiyuki和 Katsuyuki［19-20］的病菌接種方法，取帶有2片成熟葉的嫩梢5個(gè)，在葉片表面用昆蟲針刺傷形成傷口，用小噴霧器噴施純化后的茶樹炭疽病菌的孢子懸浮液（事先將孢子懸浮液濃度配制為1×106個(gè)·mL-1）。侵染后將嫩梢插在裝有水的容器中并套袋保濕在密閉環(huán)境中（26℃，10 000 lx，12 h light/12 h dark），7 d后觀察并記錄病斑直徑。重復(fù)試驗(yàn)1次，以計(jì)算算術(shù)平均數(shù)作為結(jié)果進(jìn)行抗性分級(jí)（表1）。

1.5數(shù)據(jù)分析，圖譜構(gòu)建與QTL定位

使用DNASTAR SeqMan（http：//www.dnastar.com）對(duì)菌株測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，拼接序列在NCBI上比對(duì)。采用Excel2016（https：//products.office.com）進(jìn)行表型數(shù)據(jù)分析并作圖。利用已構(gòu)建完成的具有237個(gè)標(biāo)記的SSR遺傳連鎖圖譜（LJ43♀×BHZ♂）作為定位圖譜［21］，該圖譜總長(zhǎng)1156.0 cM，平均圖距為5.21 cM，共有15個(gè)連鎖群。在MapQTL5.0（https：//www.kyazma.nl/index.php/mc.MapQTL）軟件中對(duì)茶樹炭疽病抗性進(jìn)行分析，采用復(fù)合區(qū)間作圖法（MQM Mapping，MQM），先根據(jù)區(qū)間作圖法（Interval Mapping，IM）的結(jié)果選擇離連鎖群上LOD峰值最近的標(biāo)記作為輔因子（Cofactor），再進(jìn)行 MQM Mapping。本試驗(yàn)中若連鎖群區(qū)間的 LOD 值>2.5，則認(rèn)為該連鎖群區(qū)間中存在1個(gè)QTL位點(diǎn)，并計(jì)算QTLs對(duì)應(yīng)的貢獻(xiàn)率。QTL的命名遵循McCouch［22］的命名原則。QTL定位結(jié)果通過Mapchart（http：//www.microm-online.de）軟件作圖。

表1　茶樹炭疽病抗性分級(jí)Table 1 The classification of anthracnose resistance in tea plants

2　結(jié)果與分析

2.1茶樹炭疽病菌的鑒定

拼接序列（表2）經(jīng)NCBI BLAST比對(duì)結(jié)果表明（圖1），本試驗(yàn)中所觀測(cè)、分離、純化的病菌菌株 HZ-1與 Colletotrichum sp.和Colletotrichum gloeosporioides的親緣關(guān)系最近，且序列相似度均為 99%。因此，可以推斷本試驗(yàn)中所使用的病菌 HZ-1確為炭疽菌。

圖1　真菌ITS基因序列的進(jìn)化樹Fig.1 The evolutionary tree of ITS gene in fungi

表2　炭疽菌（HZ-1）ITS基因序列Table 2 ITS gene sequence of HZ-1

圖2　室內(nèi)試驗(yàn)前后病菌孢子形態(tài)對(duì)比Fig.2 The shape contrast of spores before and after the indoor test

室內(nèi)試驗(yàn)中發(fā)病葉上的病菌孢子與用于侵染的病菌孢子在顯微鏡下觀察形態(tài)一致（圖2），表明發(fā)病葉的病斑確為病菌HZ-1的侵染而造成的。

2.2親本與F1群體的表型抗性

室內(nèi)試驗(yàn)表明（圖 3），病菌感染造成的病斑直徑在0.95～7.15 mm之間，并呈現(xiàn)出正態(tài)分布的趨勢(shì)。其中，病斑直徑在2～3 mm范圍的群體單株數(shù)最多，達(dá)到85株。親本BHZ和LJ43的病斑直徑分別為0.95 mm和3.10 mm。說(shuō)明該群體及親本對(duì)炭疽菌的抗性存在明顯的差異。

對(duì)室內(nèi)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行抗性分級(jí)后與田間調(diào)查進(jìn)行比較，結(jié)果表明（圖4）：雙親的抗性表型保持一致，母本 BHZ抗性等級(jí)均為L(zhǎng)v.3，父本 LJ43抗性等級(jí)均為 Lv.7，而 F1群體的抗性表型分布存在一定差異。在田間調(diào)查的數(shù)據(jù)中，除抗性等級(jí)Lv.9的單株僅占9%外，Lv.3、Lv.5、Lv.7各抗性等級(jí)分布較為均衡，分別為28%、31%、32%。在室內(nèi)試驗(yàn)中，抗性等級(jí)分布較為集中，超過70%的單株抗性等級(jí)為L(zhǎng)v.5，而Lv.3、Lv.9僅各占2%和4%。

圖3　室內(nèi)試驗(yàn)中病斑平均直徑的分布情況Fig.3 The distribution of average diameters of lesions in the indoor test

圖4　親本與F1群體的茶樹炭疽病抗性等級(jí)分布Fig.4 The distribution of resistance levels of tea plant in the parent and F1 group

2.3炭疽病抗性的QTL分析

田間觀測(cè)的數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示（表3，圖5），共檢測(cè)到3個(gè)炭疽病抗性的QTL位點(diǎn)，分別分布在第6、第8、第10號(hào)連鎖群上，命名為 qAR-6.1、qAR-8.1、qAR-10.1，貢獻(xiàn)率的變異幅度為8.3%～13.8%。與qAR-6.1相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記為CsFM1719，與qAR-8.1相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記為 CsFM1865，與 qAR-10.1相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記為CsFM1889，上述QTL位點(diǎn)的LOD值分別為4.31、4.31、6.80。

室內(nèi)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，共檢測(cè)到5個(gè)炭疽病抗性的QTL位點(diǎn)，分別分布在第3、第6、第10、第13、第15連鎖群上，命名為qAR-3.1、qAR-6.2、qAR-10.2、qAR-13.1、qAR-15.1，貢獻(xiàn)率的變異幅度為5.6%～7.9%。與 qAR-3.1相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記為 CsSSR110，與qAR-6.2相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記為 CsFM1769，與qAR-10.2相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記為 CsFM1106，與qAR-13.1相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記為TM425，與qAR-15.1相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記為CsFM1931，上述QTL位點(diǎn)的LOD值分別為6.0、5.6、6.9、6.7、7.9。

綜上所述，在田間觀測(cè)和室內(nèi)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的抗炭疽病的QTL位點(diǎn)并不完全一致，并且表型數(shù)據(jù)顯示各抗性等級(jí)占比存在差異，說(shuō)明該性狀受環(huán)境因素影響較大。

表3　炭疽病抗性QTL定位結(jié)果Table 3 The consequence of QTL mapping for anthracnose resistance

圖5 茶樹炭疽病QTLs在連鎖群上的位置Fig.5 Location of QTLs for tea plant anthracnose on the linkage map

3　討論

3.1不同環(huán)境條件下茶樹炭疽病抗性的差異

茶樹的炭疽病抗性是受環(huán)境因素影響較大的性狀，因此本研究主要從田間觀測(cè)數(shù)據(jù)與室內(nèi)試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)該性狀進(jìn)行QTL定位，并相互驗(yàn)證。在表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和QTL分析中，通過比較可以發(fā)現(xiàn)田間觀察數(shù)據(jù)和室內(nèi)試驗(yàn)數(shù)據(jù)均不完全一致。本研究中，在田間環(huán)境感病植株（Lv.7、Lv.9）所占的比例（41%）要高于室內(nèi)環(huán)境（24%）。因此我們推測(cè)：相較于室內(nèi)試驗(yàn)的密閉、恒定光照和溫度的環(huán)境，田間環(huán)境開放，所具有的空氣流動(dòng)、氣溫變化，降雨量的改變等因素有利于病菌孢子在群體間相互傳播，對(duì)植株造成多次侵染。該推測(cè)與Mouen［23］的研究結(jié)果相一致，其研究認(rèn)為氣溫的波動(dòng)和降水的變化是炭疽病蔓延的重要因素。

3.2茶樹炭疽病QTL分析

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)茶樹數(shù)量性狀的相關(guān)QTL研究較少。田中淳一等［24］采用 RAPD標(biāo)記對(duì)“藪北”ד靜-印雜131”F1群體的46個(gè)單株構(gòu)建遺傳連鎖圖譜后進(jìn)行QTL定位，檢測(cè)到 1個(gè)與茶氨酸含量相關(guān)的 QTL。Kamunya等［25］采用 100個(gè)標(biāo)記對(duì)阿薩姆茶種內(nèi)雜交的43個(gè)F1單株構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，共檢測(cè)到18個(gè)與茶樹產(chǎn)量相關(guān)的QTLs。馬建強(qiáng)［26］、王雪敏［27］采用SSR標(biāo)記以“迎霜”ד北躍單株”F1群體的 183個(gè)單株構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，共檢測(cè)到3個(gè)與咖啡堿含量相關(guān)的主效QTLs、3個(gè)可可堿含量相關(guān)的主效QTLs、12個(gè)芽葉形態(tài)相關(guān)的主效 QTLs、9個(gè)與兒茶素組分相關(guān)的主效QTLs。

本研究首次對(duì)茶樹炭疽病抗性性狀進(jìn)行QTL定位，在QTL定位過程中，共有8個(gè)與茶樹炭疽病抗性相關(guān)的QTLs被發(fā)現(xiàn)。其中第10號(hào)遺傳連鎖群上28.7～30.7 cM處的QTL位點(diǎn) qAR-10.1，LOD閾值 6.80，表型變異率13.8%為主效 QTL位點(diǎn)，受環(huán)境因素影響較小，而且在室內(nèi)試驗(yàn)中其鄰近區(qū)域 36.9～38.7 cM處也檢測(cè)到一個(gè)QTL位點(diǎn)qAR-10.2，LOD閾值2.92，表型變異率6.9%。其他QTL位點(diǎn)的表型變異率在5.6%～8.8%之間。李慧慧等［28］研究認(rèn)為，對(duì)200個(gè)樣本的群體而言，PVE=5% 的 QTL定位到 10 cM置信區(qū)間內(nèi)的概率為77%，PVE=10%的QTL定位到10 cM置信區(qū)間內(nèi)的概率為 97%。因此我們初步判斷 QTL位點(diǎn)qAR-10.1的鄰近區(qū)間內(nèi)應(yīng)存在與茶樹炭疽病抗性的相關(guān)基因。第 3、6、8、13、15號(hào)連鎖群上檢測(cè)到的QTLs未能在田間環(huán)境和室內(nèi)環(huán)境條件下于連鎖群的鄰近區(qū)間上重復(fù)檢測(cè)到，推測(cè)其為受環(huán)境影響較大的微效QTLs。下一步可以結(jié)合QTL位點(diǎn)緊密連鎖的SSR標(biāo)記對(duì)QTL進(jìn)行精細(xì)定位，發(fā)掘出相關(guān)基因。

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QTL Analysis for Anthracnose Resistance in Tea Plant（Camellia sinensis）

XU Liyi1，2，TAN Liqiang1，2，WANG Liyuan2，QI Guinian1*，CHENG Hao2，WEI Kang2
1.College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China； 2.National Center for Tea Improvement，Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences（TRICAAS），Hangzhou 310008，China

In order to provide a basis for breeding tea plants with anthracnose resistance，170 F1 plants，derived from LJ43♀×BHZ♂，were used to constructed a linkage map by SSR markers.Field observation and indoor test were carried out in 2014.The data of phenotypic characters were used for QTL mapping and analysis by the method of MQM mapping.A pathogen was isolated from a diseased leaf of the F1 plants，and its gene sequence of ITS had 99% similarity with Colletotrichum sp.based on NCBI BLAST.The plants grown in open field were more easy to be infected by the pathogen than those grown in rooms.Eight QTLs were detected in six different linkage groups by QTL analysis.The LOD and PVE of individual QTLs ranged from 2.53 to 6.80 and 5.6% to 13.8%，respectively.A main QTL with LOD 6.80 and PVE 13.8% was detected in LG10.

anthracnose resistance，QTL mapping，tea plant，SSR linkage map

S571.1；S435.711

A

1000-369X（2016）04-432-08

2016-01-19

2016-02-15

四川省茶樹育種科技專項(xiàng)（2012-12CGZHZX0579）、浙江省茶樹農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng)（2012C12905）、國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（nycytx-23）。

徐禮羿，男，碩士研究生，主要從事茶樹分子生物學(xué)研究。*通訊作者：guinian5612@163.com