魏利潔,蘇建輝,軒淑欣,王彥華,申書興,趙建軍

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,河北省蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定　071001)

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大白菜單拷貝序列的長(zhǎng)片段PCR體系優(yōu)化

魏利潔,蘇建輝,軒淑欣,王彥華,申書興,趙建軍

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,河北省蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定071001)

目的序列長(zhǎng)片段PCR產(chǎn)物可作為FISH技術(shù)的有效探針進(jìn)行分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究。然而,傳統(tǒng)PCR技術(shù)對(duì)于5 kb以上的長(zhǎng)片段進(jìn)行有效擴(kuò)增很難。合適的反應(yīng)條件及反應(yīng)體系是進(jìn)行長(zhǎng)片段PCR有效擴(kuò)增的必要前提。為了獲得目的序列長(zhǎng)片段PCR產(chǎn)物以用于FISH研究,根據(jù)大白菜A03染色體頂端無(wú)重復(fù)序列區(qū)段設(shè)計(jì)了80對(duì)長(zhǎng)片段PCR引物,從基因組DNA模板質(zhì)量、dNTPs濃度以及退火溫度和延伸時(shí)間方面對(duì)PCR技術(shù)體系進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)證明,選用幼苗嫩葉的基因組DNA和LATaqDNA聚合酶可以提高長(zhǎng)片段PCR引物的擴(kuò)增質(zhì)量和擴(kuò)增效率;確定了適合5～15 kb長(zhǎng)片段PCR的反應(yīng)體系為20 μL:50 ng/μL模板DNA 2 μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL,10 μmol/μL正反引物各1 μL,10× LA PCR Buffer Ⅱ(含Mg2+) 2 μL,5 U/μL LATaq酶0.2 μL;反應(yīng)條件為98 ℃變性15 s;58～64 ℃退火10 s,68 ℃延伸5 min,35個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min,4 ℃保存。在大白菜基因組中成功獲得了60對(duì)5～15 kb的擴(kuò)增片段。為在大白菜粗線期染色體上開展長(zhǎng)片段PCR-FISH技術(shù)研究及在近緣種間開展比較染色體涂染揭示進(jìn)化關(guān)系奠定了理論基礎(chǔ)。

大白菜;長(zhǎng)片段PCR;體系優(yōu)化;單拷貝序列

染色體涂染(Chromosome painting,CP)是利用染色體或染色體區(qū)段特異性DNA文庫(kù)作為探針池在中期染色體或粗線期染色體進(jìn)行FISH(Fluorescenceinsituhybridization)可視化作圖的技術(shù),在染色體鑒定、結(jié)構(gòu)重排、染色體畸形診斷和物種進(jìn)化研究中扮演了重要角色[1-3]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人們發(fā)展了多種方法來(lái)制備染色體涂染探針,如通過(guò)流式細(xì)胞分揀或顯微解剖的染色體獲得[4-5]、或平行擴(kuò)增寡核苷酸探針文庫(kù)獲得[6-7]、或篩選無(wú)重復(fù)序列的毗鄰BAC克隆(BACs)獲得[8-10]。由于高等植物含有較高的重復(fù)序列,以流式細(xì)胞分揀或顯微解剖獲得的染色體DNA探針沒(méi)有取得較好的效果[11-12],而寡核苷酸探針在植物上的應(yīng)用效果尚有待證實(shí),大量無(wú)重復(fù)序列BACs的篩選工作量較大。Lou等[13]利用PCR擴(kuò)增無(wú)重復(fù)序列的單拷貝基因,以擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)成單拷貝基因池在黃瓜染色體上進(jìn)行涂染獲得成功。染色體涂染結(jié)果表明,2～15 kb的擴(kuò)增探針可以被成功檢測(cè),擴(kuò)增片段越長(zhǎng),檢測(cè)效率越高。這一結(jié)果為已測(cè)序植物上如何獲得染色體涂染探針進(jìn)而開展相關(guān)研究提供了參考。

近幾年發(fā)展起來(lái)的長(zhǎng)片段PCR(Long range PCR,LR-PCR)技術(shù)能快速、特異地?cái)U(kuò)增目的基因或較大的DNA片段,并已用于基因克隆、基因組作圖、DNA測(cè)序、連續(xù)重疊區(qū)(Contig)的構(gòu)建、基因突變分析以及單倍型分析等諸多領(lǐng)域[14-17]。理論上,常規(guī)PCR可以得到5.0 kb以上的PCR產(chǎn)物,但在實(shí)際的操作過(guò)程中很難穩(wěn)定得到擴(kuò)增片段,這就給利用單基因拷貝探針進(jìn)行染色體涂染帶來(lái)一定困難。根據(jù)不同的試驗(yàn)需要對(duì)PCR方法進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)也正在不斷地發(fā)展,利用擴(kuò)增長(zhǎng)片段的LATaq酶,結(jié)合使用GC Buffer I,以及熱啟動(dòng)PCR技術(shù)和兩步法擴(kuò)增出了大小為16.5 kb的全長(zhǎng)稻瘟病抗性基因Pi36[18]。采用巢式PCR或和降落PCR相結(jié)合的方法進(jìn)行了基因FMNL2編碼區(qū)全長(zhǎng)及FMNL2-NT、CT的擴(kuò)增[19]。通過(guò)直接測(cè)序長(zhǎng)片段PCR產(chǎn)物開發(fā)一種新型PKD1基因突變篩查檢測(cè)[20]。前人根據(jù)不同的試驗(yàn)需要對(duì)長(zhǎng)片段PCR方法進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn),表明引物設(shè)計(jì)、模板質(zhì)量、DNA聚合酶、dNTP濃度、熱啟動(dòng)和退火、延伸溫度等因素不同程度的影響和限制著長(zhǎng)片段的擴(kuò)增結(jié)果。

為了開展蕓薹屬A、C基因組比較染色體涂染研究,鑒定大白菜—結(jié)球甘藍(lán)漸滲系中外源片段的滲入情況,本試驗(yàn)以大白菜自交系85-1基因組DNA為模板,利用根據(jù)大白菜A03染色體序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增,通過(guò)研究PCR反應(yīng)體系中模板DNA質(zhì)量、dNTPs濃度、聚合酶種類和反應(yīng)程序中退火溫度、延伸溫度對(duì)擴(kuò)增效果的影響,擬建立適合長(zhǎng)片段擴(kuò)增的PCR技術(shù)體系,旨在為大白菜染色體涂染技術(shù)體系的建立提供探針依據(jù)。

1　材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

供試植物材料:大白菜自交系85-1。供試試劑:6×Loading Buffer、DNA Marker、LATaqDNA聚合酶(5 U/μL)、dNTP(2.5 mmol/L)、2×GC Buffer(含25 mmol/L Mg2+)均購(gòu)自TaKaRa公司;瓊脂糖購(gòu)自于上海GENE TECH公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA提取與檢測(cè)采用改良的CTAB法[21]提取大白菜85-1 5～6片苗期和開花期嫩葉基因組DNA,采用0.7%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)基因組DNA的質(zhì)量,采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成基于白菜基因組網(wǎng)站(http://brassicadb.org/brad/)A03染色體的序列數(shù)據(jù)資料,利用在線軟件Repeatmarker排除重復(fù)DNA序列區(qū)段,利用Primer 5.0軟件從A03染色體頂端至170 kb區(qū)段隨機(jī)設(shè)計(jì)引物80對(duì),引物長(zhǎng)度20～23 bp,預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度5～17 kb,引物相關(guān)信息見(jiàn)表1,引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2.3PCR擴(kuò)增和檢測(cè)PCR基本反應(yīng)體系20 μL,包含:50 ng/μL模板DNA 2 μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL,10 μmol/μL正反引物各1 μL,10× LA PCR Buffer Ⅱ(含Mg2+)2 μL,5 U/μL LATaq酶 0.2 μL,剩余體積用滅菌水補(bǔ)齊。其中對(duì)dNTPs的使用量分別進(jìn)行了0.125，0.150，0.200，0.250，0.300，0.350 mmol/L的調(diào)整。

PCR的基本擴(kuò)增程序參照Lou等[13]進(jìn)行:98 ℃變性15 s；60 ℃退火10 s,68 ℃延伸5 min,共計(jì)35個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min,4 ℃保存。根據(jù)引物序列不同對(duì)退火溫度進(jìn)行58,60,62,64 ℃和延伸時(shí)間進(jìn)行3,4,5 min的調(diào)整。

反應(yīng)結(jié)束后,取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL 6×Loading Buffer混合,點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠(含0.05%的Goldview)點(diǎn)樣孔中,在電壓100 V恒壓的條件下,電泳40 min后檢測(cè)。

表1　引物信息

2　結(jié)果與分析

2.1基因組DNA質(zhì)量檢測(cè)及對(duì)PCR擴(kuò)增效果影響

模板的完整性和濃度是LR-PCR擴(kuò)增質(zhì)量的關(guān)鍵因素,只有高質(zhì)量的DNA模板,才能擴(kuò)增出理想的帶譜。對(duì)不同時(shí)期的嫩葉采用改良CTAB法提取基因組DNA(gDNA),瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果表明:用苗期幼葉提取的gDNA約為23 kb,條帶清晰、完整,基本無(wú)降解,純度高;開花期嫩葉提取的gDNA也在23 kb左右,但條帶較弱,濃度低,且泳道中存在大量的降解DNA(圖1-A)。

將提取的gDNA濃度調(diào)整到50 ng/μL,以其為模板,利用引物A03Ⅱ-9按基本反應(yīng)體系和基本反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測(cè)結(jié)果表明:以苗期幼葉gDNA為模板,引物A03Ⅱ-9擴(kuò)增出了1條長(zhǎng)度大于5 kb的特異條帶,而以開花期幼葉gDNA為模板,擴(kuò)增的條帶弱,特異性差,且為非目的條帶。因此相比較而言,苗期幼葉提取的gDNA較適用于LR-PCR(圖1-B)。

A.提取的gDNA檢測(cè)圖:M.λHind Ⅲ Marker;1～4.苗期幼葉gDNA;5～6.開花期幼葉gDNA。

2.2dNTPs濃度和延伸時(shí)間對(duì)長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增的影響

隨機(jī)選取不同預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度的6對(duì)引物A03Ⅶ-4、A03Ⅷ-3、A03Ⅶ-12、A03Ⅶ-8、A03Ⅶ-10和A03Ⅶ-1,預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為6 983,7 425,8 702,9 770,11 550,14 996 bp,對(duì)反應(yīng)體系中dNTPs的濃度和反應(yīng)程序中延伸時(shí)間進(jìn)行了梯度設(shè)置,在退火溫度為60 ℃時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)dNTPs濃度為0.150～0.200 mmol/L,延伸時(shí)間為3 min時(shí),A03Ⅶ-4、A03Ⅷ-3和A03Ⅶ-12分別擴(kuò)增出了預(yù)期大小的DNA片段(圖2-A);當(dāng)dNTPs使?jié)舛葹?.150～0.200 mmol/L,延伸時(shí)間延長(zhǎng)為4 min時(shí),A03Ⅶ-8和A03Ⅶ-10分別擴(kuò)增出了預(yù)期大小的DNA片段(圖2-B、D),當(dāng)延伸時(shí)間延長(zhǎng)為5 min時(shí),A03Ⅶ-1擴(kuò)增出了預(yù)期大小的DNA片段(圖2-C、E);而dNTPs的濃度為0.300,0.350 mmol/L時(shí)在不同的延伸時(shí)間6對(duì)引物的擴(kuò)增效果不如濃度為0.200 mmol/L好,并且延伸時(shí)間為5 min時(shí)擴(kuò)增效率最高(圖2-F)。

M.λ-EcoT14Ⅰdigest Marker;1.A03Ⅶ-4;2.A03Ⅷ-3;3.A03Ⅶ-12;4.A03Ⅶ-8;5.A03Ⅶ-10;6.A03Ⅶ-1.

2.3長(zhǎng)片段引物的初篩

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果得出,在PCR反應(yīng)體系其他成分不變的情況下,采用0.200 mmol/L的dNTPs使用量,反應(yīng)程序采用60 ℃的退火溫度和5 min的延伸時(shí)間,對(duì)設(shè)計(jì)的80對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明,55對(duì)成功擴(kuò)增出了預(yù)期大小的DNA片段,條帶清晰,長(zhǎng)度為5～15 kb(表2),部分引物初篩瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

表2　60 ℃退火溫度下可獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的引物

1.A03Ⅶ-1;2.A03Ⅶ-2;3.A03Ⅶ-4;4.A03Ⅶ-5;5.A03Ⅶ-6;6.A03Ⅶ-7;7.A03Ⅶ-8;8.A03Ⅶ-9;9.A03Ⅶ-10;10.A03Ⅶ-11;11.A03Ⅶ-12;12.A03Ⅷ-1;13.A03Ⅷ-2;14.A03Ⅷ-3;15.A03Ⅸ-1;16.A03Ⅸ-2;M.λ-EcoT14Ⅰdigest Marker.

2.4退火溫度梯度設(shè)置對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的影響

對(duì)于60 ℃退火溫度下沒(méi)有擴(kuò)增出產(chǎn)物的26對(duì)引物,通過(guò)在58～64 ℃內(nèi)設(shè)置連續(xù)退火溫度,對(duì)85-1基因組DNA進(jìn)行了進(jìn)一步擴(kuò)增。

結(jié)果表明,有5對(duì)引物擴(kuò)增出了預(yù)期大小的DNA片段,其中,2對(duì)引物A03Ⅳ-3和A03Ⅶ-8在退火溫度為58 ℃時(shí)分別獲得了預(yù)期大小為11,9 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物;3對(duì)引物A03Ⅱ-13、A03Ⅲ-9和A03Ⅳ-5均在退火溫度為64 ℃時(shí)得了預(yù)期大小為12～13 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖4)。

1.A03Ⅱ-13;2.A03Ⅲ-9;3.A03Ⅳ-5;M.λ-EcoT14Ⅰdigest Marker.

3　討論

一般來(lái)說(shuō),普通的PCR技術(shù)通常情況下只能擴(kuò)增5 kb以內(nèi)的短片段。和普通的PCR技術(shù)相比來(lái)看,LR-PCR技術(shù)有很多難點(diǎn),因?yàn)殡S著擴(kuò)增片段的延長(zhǎng),擴(kuò)增效率也會(huì)隨之降低,在長(zhǎng)片段PCR過(guò)程中,其DNA分子的變性比短片段困難;高溫會(huì)降低緩沖液的緩沖能力,從而損害模板DNA和PCR產(chǎn)物;且高溫下其他二價(jià)離子的存在會(huì)促進(jìn)DNA的裂解;再者,DNA聚合酶與模板DNA的趨近和結(jié)合變得困難;錯(cuò)配堿基的摻入導(dǎo)致DNA聚合酶的作用不能正常發(fā)揮,從而限制產(chǎn)物的長(zhǎng)度;長(zhǎng)片段擴(kuò)增常常受到非特異短片段優(yōu)先擴(kuò)增的影響等問(wèn)題。

因此，為了提高長(zhǎng)片段產(chǎn)物擴(kuò)增效率,在反應(yīng)體系和反應(yīng)程序中,參考大多文獻(xiàn),筆者采取了以下優(yōu)化措施:首先,模板在LR-PCR中起著決定性作用,較長(zhǎng)的模板DNA中有更多位點(diǎn)容易在變性步驟中發(fā)生脫嘌呤和脫氨,所以長(zhǎng)片段PCR中使用的要求是完整的DNA模板[15,21]。試驗(yàn)證明用苗期幼葉為材料比開花期幼葉所提取的DNA條帶不容易降解,而且在DNA提取過(guò)程中,要注意操作輕柔,避免劇烈振蕩,以確保DNA的完整性;其次是調(diào)整反應(yīng)體系,以適合擴(kuò)增5～15 kb片段。在dNTPs用量上,在PCR反應(yīng)中,dNTPs是為其提供原料的,所以較長(zhǎng)目的片段可能需要較多的dNTPs;從原理上講是作為DNA合成的原料,片段越長(zhǎng)需要的dNTPs越多,而且多數(shù)文獻(xiàn)中dNTPs采用濃度為0.35 mmol/L[21],本試驗(yàn)中對(duì)dNTPs濃度進(jìn)行了0.125～0.350 mmol/L的梯度設(shè)置,表明dNTPs濃度0.200 mmol/L(1.6 μL)時(shí)就可以獲得預(yù)期的片段長(zhǎng)度;反應(yīng)程序中,由于長(zhǎng)片段PCR的擴(kuò)增對(duì)退火溫度的反應(yīng)特別敏感,筆者根據(jù)引物Tm值及預(yù)期片段長(zhǎng)度,并參考Lou等[13]LR-PCR程序中采用的退火溫度60 ℃,選擇60 ℃為退火溫度,然后為了獲得較好的擴(kuò)增效率,對(duì)退火溫度進(jìn)行了梯度設(shè)置,發(fā)現(xiàn)在60 ℃時(shí)擴(kuò)增效率最高,對(duì)沒(méi)有擴(kuò)增出產(chǎn)物的引物,選用其他退火溫度,可獲得的引物只有5對(duì),擴(kuò)增效率不高說(shuō)明退火溫度不是主要原因,可能與引物設(shè)計(jì)有關(guān);另外,LR-PCR要保證鏈延伸足夠長(zhǎng),必須要保證足夠的鏈延伸時(shí)間和校對(duì)酶活性,在本試驗(yàn)中證明采取延長(zhǎng)延伸時(shí)間(5 min)時(shí)擴(kuò)增效率最好。

通過(guò)調(diào)整PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序,本試驗(yàn)成功地獲得了60對(duì)長(zhǎng)度為5～15 kb的PCR產(chǎn)物,為長(zhǎng)片段探針在大白菜染色體涂染技術(shù)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of Long-range PCR System Based on Single Copy Sequences of Chinese Cabbage

WEI Lijie,SU Jianhui,XUAN Shuxin,WANG Yanhua,SHEN Shuxing,ZHAO Jianjun

(College of Horticulture,Hebei Agricultural University,Key Laboratory for Vegetable Germplasm Enhancement and Utilization of Hebei,Baoding071001,China)

The products obtained by long range PCR based on objective sequences were the effective probes for FISH to carry out molecular cytogenetic study.However,it is very difficult to amplify more than 5 kb-long fragments effectively by traditional PCR techniques.Suitable reaction conditions and reaction system are the necessary prerequisite for running effective LR-PCR amplification.In order to obtain LR-PCR products based on the objective sequences as FISH probes,80 pairs of LR-PCR primers were designed based on the sequences of repeat-free regions on the top of Chinese cabbage chromosome A03,and PCR technique system was optimized from the following aspects containing the template quality of Chinese cabbage genomic DNA,dNTPs concentration,annealing temperature and extended time.Results indicated that genomic DNA of seedling leaves and LATaqpolymerase enzyme could improve the amplification quality and efficiency of long-range PCR.And 5-15 kb PCR products could be amplified by the reaction system with 20 μL of total volume,comprising of 50 ng/μL DNA 2 μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL,10 μmol/μL of each primer 1 μL,10× LA PCR Buffer Ⅱ (including Mg2+) 2 μL,5 U/μL LATaqenzyme 0.2 μL.PCR reaction procedure was followed as:98 ℃ for 15 s;58-64 ℃ for 10 s,68 ℃ for 5 min,35 cycles;final extension at 68 ℃ for 10 min kept at 4 ℃.Under these conditions,60 fragments with 5-15 kb length were obtained from Chinese cabbage genome.This research would establish the basis for carrying out long range PCR-FISH on meiotic pachytene chromosomes of Chinese cabbage and for clarifying evolutionary by comparing chromosome painting among close related species.

Chinese cabbage;Long range PCR(LR-PCR);System optimization;Single copy sequences

2016-05-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31501758;31171964);農(nóng)業(yè)部杰出人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(2130106);“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA100202-5);河北省百人計(jì)劃項(xiàng)目(No.E2013100011);河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(16226304D)

魏利潔(1988-),女,河北邯鄲人,碩士,主要從事蔬菜育種研究。

趙建軍(1971-),男,河北滄州人,研究員，博士,博士生導(dǎo)師,主要從事蔬菜生物技術(shù)與遺傳育種研究。

軒淑欣(1977-),女,河北保定人,副研究員,博士，碩士生導(dǎo)師,主要從事分子細(xì)胞遺傳與育種研究。

Q78;S634.03

A

1000-7091(2016)04-0051-06

10.7668/hbnxb.2016.04.009