開(kāi)亮，蔡月，付艷輝，宋小平，陳光英，韓長(zhǎng)日

(1.海南師范大學(xué) 熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571158；2.海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？?571158)

革葉山姜葉揮發(fā)油GC-MS分析及活性研究△

開(kāi)亮1，2，蔡月1，付艷輝1，宋小平1，陳光英1，韓長(zhǎng)日

(1.海南師范大學(xué) 熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571158；2.海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？?571158)

目的：分析研究革葉山姜葉揮發(fā)油的主要成分及其抗腫瘤活性。方法：采取水蒸氣蒸餾法從革葉山姜葉中提取揮發(fā)油，利用GC-MS對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析。采用MTT法檢測(cè)革葉山姜葉揮發(fā)油對(duì)細(xì)胞Hela、A549的增殖抑制作用。結(jié)果：共分離出39個(gè)峰，鑒定出31個(gè)化學(xué)成分，占揮發(fā)油總量的94.81%。其主要成分為芳樟醇(34.91%)、橙花叔醇(18.23%)和桉葉油醇(14.48%)。抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性結(jié)果表明革葉山姜葉揮發(fā)油對(duì)2種腫瘤細(xì)胞株均有一定的抑制活性，其中對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549的抑制活性相對(duì)較好，其IC50值為14.01 μg·mL-1。結(jié)論：該實(shí)驗(yàn)為革葉山姜的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

革葉山姜；揮發(fā)油；GC-MS；抗腫瘤活性

山姜屬(AlpiniaL.)系姜科植物，總共約有250多種，主要分布在亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)約有46種，產(chǎn)于東南部至西南部[1]。山姜屬植物具有很高的藥用價(jià)值，其性味辛溫，具有保護(hù)胃黏膜、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化、抗應(yīng)激等藥理活性，臨床上主要用于脾胃寒證[2]。該屬植物紅豆蔻、草豆蔻、益智、高良姜均被《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》收錄[3]。山姜屬植物的揮發(fā)性成分研究主要集中在高良姜、大高良姜、草豆蔻、紅豆蔻、艷山姜等植物，對(duì)其他山姜屬植物的研究較少[4]。革葉山姜Alpiniacoriacea為姜科山姜屬植物，是海南特有植物，截至目前未見(jiàn)任何關(guān)于革葉山姜的揮發(fā)油成分及其藥理活性報(bào)道。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)革葉山姜的乙醇提取物具有顯著的抗人類免疫缺陷病毒(HIV)活性，為了合理開(kāi)發(fā)利用革葉山姜這一海南特有植物資源，本課題組首次對(duì)革葉山姜揮發(fā)油成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)水蒸氣蒸餾法提取革葉山姜新鮮葉中的揮發(fā)油成分，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對(duì)革葉山姜葉揮發(fā)油進(jìn)行成分分析，經(jīng)計(jì)算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索，面積歸一化法確定各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。同時(shí)進(jìn)行抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性測(cè)試，為革葉山姜藥用價(jià)值的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

革葉山姜全草于2014年5月采自海南省昌江霸王嶺國(guó)家森林公園，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所李蓉濤研究員鑒定為姜科山姜屬植物革葉山姜Alpiniacoriacea的全草，憑證標(biāo)本(No.H20140502)保存于海南師范大學(xué)熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本室。

Agilent 5975B/6890N型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司)，Elx800 型酶標(biāo)儀(美國(guó)寶特公司)，揮發(fā)油專用提取裝置。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為市售分析純?cè)噭?，水為蒸餾水。供試腫瘤細(xì)胞：人宮頸癌Hela細(xì)胞、人肺腺癌A549細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生物研究所)。

2 方法

2.1 揮發(fā)油的提取

將新鮮的革葉山姜葉粉碎，取100 g加水浸泡，使用水蒸氣蒸餾法[5]提取4 h，再用無(wú)水乙醚萃取，得到淡黃色透明油狀物。

2.2 分析條件

進(jìn)樣條件：樣品瓶溫度為100 ℃，定量環(huán)(1.0 mL)溫度為110 ℃，傳輸線溫度為120 ℃，氣相平衡時(shí)間為5.5 min，樣品平衡時(shí)間為7.0 min，樣品瓶加壓時(shí)間為0.1 min，定量環(huán)增量時(shí)間為0.5 min，樣品環(huán)平衡時(shí)間為0.05 min，進(jìn)樣時(shí)間為1.0 min。

GC條件：石英毛細(xì)管柱HP-FFAP(30 m×250 μm，0.25 μm)，初始溫度為50 ℃，保持 1 min，以5 ℃·min-1速率升溫，升溫到200 ℃保持5 min，再以8 ℃·min-1升溫速率升溫到280 ℃保持至完成分析，載氣為氦氣(99.99%)，柱流量為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，分流比為 50∶1。

MS條件：電離方式為EI電離源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，四級(jí)桿溫度為150 ℃，溶劑延遲為2.5 min，全掃描(Scan)采集模式，質(zhì)量范圍m/z50～550，掃描間隔0.50 s，EM電壓1400 V。

2.3 抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性測(cè)試

用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液(DMEM)配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔5000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100 μL，貼壁細(xì)胞提前12 h接種培養(yǎng)。加100 μL待測(cè)樣，設(shè)定加6孔，以40 μg·mL-1質(zhì)量濃度為初篩濃度，根據(jù)初篩結(jié)果設(shè)定5個(gè)梯度濃度進(jìn)行復(fù)篩，每種設(shè)定3個(gè)平行復(fù)孔。37 ℃培養(yǎng)48 h后，每孔加四甲偶氮唑鹽(MTT)溶液20 μL。繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μL的DMSO溶液，使結(jié)晶物充分融解。在酶標(biāo)儀(BioTek ELx800)490 nm讀取各孔吸光度值并記錄結(jié)果，計(jì)算揮發(fā)油的最大半數(shù)抑制濃度(IC50)值[6]。

3 結(jié)果

3.1 揮發(fā)油成分分析

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)方法制取革葉山姜揮發(fā)油，得到具有特殊香味淡黃色透明油狀物1.7 g，提取率為1.7%。按上述的GC-MS條件對(duì)革葉山姜葉的揮發(fā)油進(jìn)行分析，GC分離出39個(gè)組分，根據(jù)面積歸一化法從總離子流圖(見(jiàn)圖1)中計(jì)算各組分百分含量，通過(guò)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)Nist08檢索，鑒定了31個(gè)化學(xué)成分，結(jié)果見(jiàn)表1。相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的成分為芳樟醇(34.91%)、橙花叔醇(18.23%)和桉葉油醇(14.48%)、合金歡醇(5.62%)等。

圖1 革葉山姜葉揮發(fā)油總離子流圖

表1 革葉山姜葉揮發(fā)油成分分析

3.2 揮發(fā)油抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性

采用MTT比色法對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性的研究，結(jié)果見(jiàn)表2。其對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞抑制活性相對(duì)較好，IC50值為14.01 μg·mL-1，而對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞具有中等強(qiáng)度的抑制活性，IC50值為25.69 μg·mL-1。

表2 革葉山姜葉揮發(fā)油抑制腫瘤細(xì)胞增生活性

4 討論

對(duì)革葉山姜揮發(fā)油成分經(jīng)過(guò)GC-MS鑒定分析出了31個(gè)化合物，占總含量的94.81%，主要成分為醇類、烯烴類等化合物。革葉山姜葉揮發(fā)油中含有多種活性成分，如α-石竹烯可強(qiáng)烈誘導(dǎo)小鼠肝和小腸中的解毒酶谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶活性而對(duì)化學(xué)致癌起抑制作用[7]，陳偉強(qiáng)課題組研究表明α-蒎烯對(duì)肝癌BEL-7402細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用[8]。

抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活性測(cè)試結(jié)果表明，革葉山姜葉揮發(fā)油對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞和人肺腺癌A549細(xì)胞有抑制活性。這為進(jìn)一步研究革葉山姜的藥用價(jià)值提供了理論依據(jù)。

[1] 中國(guó)科學(xué)院《中國(guó)植物志》編輯委員會(huì).中國(guó)植物志：第16卷[M].北京：科學(xué)出版社，2005：67.

[2] 秦華珍，王曉倩，柳俊輝，等.姜科山姜屬中藥藥理作用的研究進(jìn)展[J].廣西中醫(yī)藥雜志，2010，33(5)：1-3.

[3] 亓淑芬，姚慶強(qiáng).山姜屬植物化學(xué)成分及藥理活性的研究進(jìn)展[J].齊魯藥事，2009，28(5)：284-287.

[4] 劉磊，秦華珍，王曉倩，等.10味山姜屬藥物揮發(fā)油成分的氣相-質(zhì)譜聯(lián)用分析[J].廣西植物，2012，32(4)：561-566.

[5] 溫悅.揮發(fā)油提取方法研究概況[J].中國(guó)藥業(yè)，2010，19(12)：84-85.

[6] 蘇秀莉，盧衛(wèi)紅，張浩，等.MTT法檢測(cè)香葉木苷對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制的影響[J].中醫(yī)藥信息，2012，29(6)：101-104.

[7] 宋煌旺，宋鑫明，韓長(zhǎng)日，等.喙果皂帽花揮發(fā)油GC-MS分析及活性研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(16)：132-136.

[8] CHEN W Q，XU B，MAO J W，et al.Inhibitory effects ofα-pinene on hepatoma carcinoma cell proliferation[J].Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，2014，15(7)：3293-3297.

GC-MSAnalysisandBioactivityofEssentialOilfromLeavesofAlpiniacoriacea

KAI Liang1，2，CAIYue1，F(xiàn)UYanhui1，SONGXiaoping1，CHENGuangying1，2，HANChangri1，2*

(1.KeyLaboratoryofTropicalMedicinalPlantChemistryofMinistryofEducation；HainanNormalUniversity，Haikou571158，China；2.CollegeofChemistryandChemicalEngineering，HainanNormalUniversity，Haikou571158，China)

Objective：To study the chemical constituents and bioactivity of essential oil from the leaves ofAlpiniacoriacea.Methods：The essential oil was extracted by water vapor distillation and analyzed by GC-MS.The inhibitory activity of essential oil on Hela and A549 cell proliferation was assayed using the MTT.Results：GC-MS result showed that there were 39 peaks and 31 compounds were identified，which weighed 94.81% of the essential oil.The major components were linalool(34.91%)，nerolidol(18.23%)and eucalyptol(14.48%).Antitumor activity results showed that has a certain inhibitory activity，including on lung adenocarcinoma A549 cells better inhibitory activity，its IC50value of 14.01 μg·mL-1.Conclusion：The experiment forA.coriaceaprovides reliable scientific basis for further research.

Alpiniacoriacea；essential oil；GC-MS；inhibitory activity

2016-03-21)

國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)(ISTCP)(2014DFA40850)；國(guó)家自然科學(xué)基金(81360478，21362009，81160391)

*

韓長(zhǎng)日，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：天然藥物化學(xué)；Tel：(0898)65889422，E-mail：hchr116@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.009