劉征輝，徐石勇，趙琳琳，魏靜娜，郭永澤，白鋼

(1.天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，天津 300381；2.南開大學(xué) 藥學(xué)院，天津 300071；3.天津海世達(dá)檢測(cè)技術(shù)有限公司，天津 300381；4.天津市現(xiàn)代中藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心，天津 300381)

金銀花中抗炎活性成分獐牙菜苷和獐牙菜苦苷定量方法的研究△

劉征輝1，2，徐石勇3,4，趙琳琳3,4，魏靜娜3,4，郭永澤1*，白鋼2

(1.天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，天津 300381；2.南開大學(xué) 藥學(xué)院，天津 300071；3.天津海世達(dá)檢測(cè)技術(shù)有限公司，天津 300381；4.天津市現(xiàn)代中藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心，天津 300381)

目的：研究建立金銀花中抗炎活性成分獐芽菜苷、獐牙菜苦苷同時(shí)定量的方法。方法：通過超高效液相色譜法對(duì)獐芽菜苷、獐牙菜苦苷進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果：結(jié)果表明獐芽菜苷進(jìn)樣量在6.85～548.00 ng、獐牙菜苦苷進(jìn)樣量在64.50～1 032.00 ng與峰面積呈良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為Y=495 534 7X-213 11(r=0.999 4)；Y=1 596 561X-24 132(r=0.999 9)。結(jié)論：所建立的定量方法快速簡(jiǎn)單，方法可靠，可作為金銀花中抗炎活性成分的質(zhì)量控制方法。

金銀花；抗炎活性成分；超高效液相色譜法；獐芽菜苷；獐牙菜苦苷

金銀花為忍冬科忍冬屬多年生半常綠木本植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱的功效，自古以來被譽(yù)為清熱解毒的良藥。“金銀花”一名出自《本草綱目》，由于忍冬花初開為白色，后轉(zhuǎn)為黃色，因此得名金銀花。它性甘寒氣芳香，甘寒清熱而不傷胃，芳香透達(dá)又可祛邪?！敖疸y花”一名為后世延用至今。在中國的歷代醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中，均發(fā)現(xiàn)有金銀花及其藥效的記載。

《中華人民共和國藥典》2010版收載的金銀花功能為：清熱解毒，疏散風(fēng)熱。用于癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱血毒痢，風(fēng)熱感冒，溫病發(fā)熱。忍冬藤功能為：清熱解毒，疏風(fēng)通絡(luò)。用于溫病發(fā)熱，熱毒血痢，癰腫瘡瘍，風(fēng)濕熱痹，關(guān)節(jié)紅腫熱痛[1]。

實(shí)驗(yàn)室前期利用293t細(xì)胞及NF-κB雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)做抗炎活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明金銀花的抗炎活性差異較大，選選擇活性最好的指標(biāo)做活性抗炎單體的篩選。通過UPLC-Qtof結(jié)合NF-κB雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，將金銀花中各個(gè)峰接出(每30秒接一個(gè))，做活性篩選實(shí)驗(yàn)。結(jié)果篩出4個(gè)活性單體，并對(duì)這4個(gè)峰進(jìn)行解譜鑒定，確定分別為綠原酸、木犀草苷、獐芽菜苷和獐牙菜苦苷，將這4個(gè)抗炎指標(biāo)成分作為金銀花多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)的物質(zhì)基礎(chǔ)。而綠原酸和木犀草苷已有藥典方法進(jìn)行檢測(cè)，目前只需要開發(fā)獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的定量檢測(cè)方法即可，本論文也著重從獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的定量方法作為抗炎活性研究的主要內(nèi)容。

1 金銀花研究進(jìn)展

1.1 金銀花的產(chǎn)地及品種

金銀花原產(chǎn)于我國大陸，大部分省份均有分布，主要產(chǎn)地有山東、河北、河南等。金銀花具有耐寒、耐鹽堿、耐干旱等特點(diǎn)，是多年生深根藥用植物，對(duì)自然環(huán)境適應(yīng)性很強(qiáng)。在旱沙堿土地上移栽成活率高，萌發(fā)力強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速。

市場(chǎng)上金銀花種植的品種比較多，主要有巨花一號(hào)、大毛花、樹形四季花、九豐一號(hào)、豫封一號(hào)、金花三號(hào)等等。金銀花的采摘和加工比較繁瑣，是金銀花的生產(chǎn)力不高的主要原因。

近年來，金銀花開發(fā)利用有了突破性進(jìn)展，在香料、化妝品、保健食品、保健飲料等領(lǐng)域逐漸被應(yīng)用。除此之外，在南方沿海各大城市居民及日本、韓國、臺(tái)灣、東南亞等國家和地區(qū)都有用金銀花做藥膳的飲食習(xí)慣。

1.2 金銀花的炮制加工方法

在河北巨鹿、河南封丘、山東平邑3個(gè)金銀花主產(chǎn)區(qū)的加工方法有曬干、陰干、土烤、烘干、殺青烘干等，不同的加工炮制方法對(duì)金銀花質(zhì)量影響較大。傳統(tǒng)的炮制方法是土烤房，但效率不高、質(zhì)量難以控制；現(xiàn)代方法使用在較低溫度下的烘干機(jī)，循環(huán)空氣達(dá)到強(qiáng)除濕的目的，能保證金銀花顏色鮮艷，花型穩(wěn)定，其有效成分損失少，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)現(xiàn)代加工方法如烘干或者殺青的金銀花多呈鮮綠色，有機(jī)酸損失較少。

1.3 金銀花化學(xué)成分研究

現(xiàn)代文獻(xiàn)記載，金銀花主要含有機(jī)酸類、三萜類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、醇類及多種微量元素等[2-5]。其中除了綠原酸和木犀草苷作為金銀花主要的抗炎指標(biāo)成分外，環(huán)烯醚萜類中獐牙菜苷和獐牙菜苦苷也具有良好的抗炎效果[6-9]。以下研究?jī)?nèi)容將對(duì)金銀花中環(huán)烯醚萜類成分獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的定量方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

圖1 環(huán)烯醚萜類化合物結(jié)構(gòu)圖

2 實(shí)驗(yàn)材料

2.1 儀器設(shè)備

Waters ACQUITY UPLC H-Class Core system超高效液相色譜儀，Empower3色譜工作站，配置自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器、四元梯度泵。

2.2 主要試劑

標(biāo)準(zhǔn)品綠原酸(批號(hào)：110753-200413)，木樨草苷(批號(hào)：111720-200905)，均購自中國食品藥品檢定研究院。對(duì)照品獐牙菜苷(20mg，Z-009-131225，HPLC≥98%)、獐牙菜苦苷(20mg，Z-002-130427，HPLC≥98%)均購自成都瑞芬思有限公司。液相用水為Millipore超純水；乙腈(Fisher，色譜純)；磷酸、乙醇為分析純。

2.3 樣本來源

通過對(duì)金銀花和山銀花產(chǎn)區(qū)及藥材市場(chǎng)進(jìn)行調(diào)研，獲得具有一定代表性的樣本101份，各樣本的獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的含量信息見列表。列表如下：

表1 樣本信息列表

表1(續(xù))

表1(續(xù))

3 獐牙菜苷、獐牙菜苦苷定量方法的研究

3.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品獐牙菜苷和獐牙菜苦苷適量，用25%甲醇水溶液配制成單個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液，獐牙菜苷濃度為0.274 mg·mL-1，獐牙菜苦苷0.258 mg·mL-1。

3.2 供試品溶液的制備

精密稱取過80目篩的金銀花粉末約0.1 g于50 mL錐形瓶中，精密加入25%甲醇水溶液10 mL，稱定重量，超聲30 min(250W，35 kHz，40℃)，放冷，補(bǔ)足減失的重量。搖勻，過0.45 μm濾膜，即得。

3.3 色譜條件

Waters H-Class超高效液相色譜儀，Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1×100 mm)；流動(dòng)相：乙腈(A)，0.1%甲酸水溶液(B)，如表2.5進(jìn)行梯度洗脫，柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm；進(jìn)樣量5 μL。對(duì)照品、供試品見圖2和3。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫列表

圖2 獐牙菜苷和獐牙菜苦苷對(duì)照品UPLC圖譜

圖3 金銀花樣品UPLC圖譜

3.4 線性關(guān)系的考察

分別吸取獐牙菜苷對(duì)照品儲(chǔ)備液0.05，0.25，1.00，2.00，4.00 mL，用25%甲醇水溶液定容至10 mL，配制成一系列不同濃度的溶液；同理，獐牙菜苦苷儲(chǔ)備液吸取0.50，1.00，2.00，4.00，8.00 mL，定容至10 mL。分別進(jìn)樣5 μL。以對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣量μg為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y做曲線，得回歸方程如表3。

表3 獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.5 穩(wěn)定性考察

取50號(hào)樣品1份，按照3.2的制備方法制備供試品溶液，分別在0、3、6、9、12、15 h，測(cè)定樣品中獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的峰面積，計(jì)算RSD分別為1.24%、0.97%。說明15 h內(nèi)穩(wěn)定性可以達(dá)到要求。

3.6 加樣回收率試驗(yàn)

取50號(hào)樣品6份，精密稱取約0.05 g，分別加入其中含獐牙菜苷(0.274 mg·mL-1)0.2 mL和獐牙菜苦苷(0.258 mg·mL-1)的溶液2.0 mL，稱定重量，再按照3.2的方法制得回收率用樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定峰面積并計(jì)算，結(jié)果平均回收率分別為97.61%、102.36%，RSD依次為1.94%、2.37%。

3.7 樣品測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液10 μL，按3.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄獐牙菜苷和獐牙菜苦苷峰面積，并用外標(biāo)法計(jì)算其含量，RSD<3%。

4 討論

提取溶劑的優(yōu)選考察：以50號(hào)樣品為例，考察不同溶劑的提取效率。結(jié)果表明：當(dāng)提取溶劑為25%甲醇水溶液時(shí)提取效率最高，獐牙菜苦苷和獐牙菜苷基本被提取完全，故將25%甲醇水溶液作為最終的提取溶劑。

檢測(cè)結(jié)果顯示，獐芽菜苦苷含量最高的為金銀花品種大毛花，來源于河北省巨鹿縣，炮制方法為陰干，顏色為黃褐色，含量達(dá)到6.995%。另外，該5個(gè)種間獐芽菜苦苷含量均差異不顯著，基本順序?yàn)榻疸y花>灰氈毛忍冬>華南忍冬>紅腺忍冬>黃褐毛忍冬。

通過統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可以看到，獐芽菜苷含量最高的為金銀花大毛花樣本，來源于河北省巨鹿縣市場(chǎng)，炮制方法為曬干，顏色為白色，獐芽菜苷含量達(dá)到0.585%。另外，該5個(gè)品種獐芽菜苷含量差異顯著，基本順序?yàn)榻疸y花>紅腺忍冬>華南忍冬>黃褐毛忍冬>灰氈毛忍冬。

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QuantitativeDeterminationofSwerosideandSwertiamarininLoniceraeFlos

LIU Zhenghui1，2，XUShiyong3，4，ZHAOLinlin3，4，WEIJingna3，4，GUOYongze1*，BAIGang2

(1.TianjinAgriculturalQualityStandardsandTestingTechnologyResearchInstitute，Tianjin300081，China；2.CollegeofPharmacy，NankaiUniversity，Tianjin300071，China；3.TianjinHigh-standardQualityTestingLab.，Tianjin300081，China；4.TianjinCenterforQualityTestingofTraditionalChineseMedicine，Tianjin300081，China)

Objective：To establish a quantitative determination method for sweroside and swertiamarin in Lonicerae Flos.Methods：UPLC was applied for the study.Results：The injection amount of sweroside(6.85-548.00 ng)and swertiamarin(64.50-1032.00 ng)had a good linear relationship with the peak area and standard curve regression equations were calculated as is forY=495 534 7X-213 11(r=0.999 4)andY=1 596 561X-241 32(r=0.999 9)，respectively.Conclusion：The established quantitative method is rapid，simple and reliable，can be used for the determination of sweroside and swertiamarin in Lonicerae Flos.

Lonicerae Flos；UPLC；sweroside；swertiamarin

2015-05-29)

十二五國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAI07B07)

*

郭永澤，研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品、食品及中藥檢測(cè)；Tel：(022)27950185，E-mail：guoyz1971@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.015