應用16S rRNA基因文庫技術(shù)分析3種生物填料上生物膜的細菌群落組成

為研究生物填料上生物膜的細菌群落組成及其在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的應用，選擇3種生物填料構(gòu)建生物濾池，采用細菌16S rRNA基因片段擴增和Illumina高通量測序法，分析了循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中填料上生物膜和對應生物濾池水體中的細菌群落種類組成。結(jié)果表明：3種生物填料均有富集微生物生長的作用，生物填料上生物膜的細菌種類和多樣性大于對應的生物濾池水體；在門分類水平，3個生物濾池水體中的優(yōu)勢菌相同，均為厚壁菌門，3種生物填料上生物膜的優(yōu)勢菌不盡相同，聚乙烯小球生物膜的優(yōu)勢菌為厚壁菌門，陶瓷環(huán)和彈性毛刷生物膜的優(yōu)勢菌為變形菌門；彈性毛刷生物膜的細菌種類最多、多樣性指數(shù)最高，由變形菌門的26個屬細菌組成，聚乙烯小球生物膜的細菌種類組成最少、多樣性指數(shù)最低，由厚壁菌門的23個屬組成，細菌豐度指數(shù)最低。

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)；生物膜；細菌群落；生物濾池

循環(huán)水養(yǎng)殖具有節(jié)水、節(jié)地、環(huán)保等優(yōu)點，是未來水產(chǎn)養(yǎng)殖方式的發(fā)展方向。水處理是循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的核心單元，生物膜法處理養(yǎng)殖水體已經(jīng)在循環(huán)水養(yǎng)殖中有了較多的應用，而生物膜上附著的細菌是降解水體污染物的主要承擔者，在水質(zhì)凈化方面發(fā)揮著重要作用［1-3］。國內(nèi)外許多學者在生物膜的快速掛膜、細菌群落組成、細菌群落多樣性等方面進行了研究，并取得了一定成果［4-8］。

利用16S rDNA克隆文庫法分析細菌群落結(jié)構(gòu)已有較多報道［9-11］，隨著第三代高通量測序技術(shù)的發(fā)展，克隆方法不需要進行細菌的純培養(yǎng)就可以進行高通量測序，利用所得序列信息比較不同樣品中的微生物豐度及多樣性情況［12］。生物膜載體是生物膜法處理養(yǎng)殖尾水的核心部分，在水體凈化過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究中，以生產(chǎn)應用中常見的3種生物填料為對象，通過室內(nèi)模擬構(gòu)建循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，以自然掛膜方式培養(yǎng)生物膜，采用細菌通用引物擴增16S rRNA基因，應用Illumina高通量測序法，對3種填料上生物膜以及對應生物濾池水體的微生物群落種類組成進行了分析，以期為養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中生物膜載體材料的應用和選擇提供參考，為循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中生物濾池的凈化效率及生物膜的作用機理提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

生物填料分別為聚乙烯小球、陶瓷環(huán)、彈性毛刷。羅氏沼蝦Macrobrachium rosenbergii購自湖州市城南農(nóng)貿(mào)市場，體質(zhì)量為 （28.4±0.89）g。

1.2方法

1.2.1養(yǎng)殖系統(tǒng) 試驗在浙江省淡水水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖基地進行。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)由養(yǎng)殖池、沉淀池、生物濾池3部分構(gòu)成，在沉淀池和生物濾池內(nèi)各安裝一個小型水泵構(gòu)成內(nèi)循環(huán)。養(yǎng)殖池、沉淀池、生物濾池分別由有效體積為150、120、100 L 的PVC水族箱構(gòu)成，生物濾池內(nèi)依次放置不同類型的生物填料，養(yǎng)殖池內(nèi)放網(wǎng)片。羅氏沼蝦放養(yǎng)密度為40只/箱。1.2.2 樣品的采集 聚乙烯小球、陶瓷環(huán)、彈性毛刷填料上的生物膜樣本編號分別為 M1、M2、M3，3種生物填料對應的生物濾池水體樣本編號分別為W1、W2、W3。待生物膜成熟后，用無菌方式取100 mL生物濾池水樣和部分生物填料于滅菌玻璃瓶中帶回實驗室，每個樣本采集2次。用滅菌手術(shù)刀將載體上的生物膜刮下，劇烈震蕩以使載體上的生物膜溶解，水樣和生物膜懸浮液經(jīng)滅菌濾膜（孔徑為 0.22 μm）過濾后，將濾膜放入冰箱（-20℃）中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3試驗設計 試驗水溫為 （24±1）℃，將外塘養(yǎng)殖水泵放入生物濾池內(nèi)，初始水質(zhì)指標如下：pH值為7.4，總氮 （TN）為 3.62 mg/L，總磷（TP）為 0.084 mg/L，亞硝酸鹽 （-N）為0.026 mg/L，氨氮 （-N）為0.03 mg/L，溶解氧 （DO）為7.55 mg/L，化學耗氧量 （CO）為2.2 mg/L，生物濾池和養(yǎng)殖池連續(xù)曝氣。將生物填料均勻布置在生物濾池中 （M3用細繩均勻懸掛在生物濾池中），掛膜期間水體緩慢循環(huán)流動，待生物膜成熟后，將水流速度調(diào)整到正常值 （7.5 L/min），每天9：00正常投喂。

1.2.4樣品DNA提取及PCR擴增 將濾膜解凍后剪碎，參照 DNA提取試劑盒 E.Z.N.A.Water DNA Kit（Omega Biotech，美國）方法提取細菌基因組DNA。采用細菌通用引物515F（5′GTGCCAGCM GCCGCGG 3′）和 907R（5′CCGTCAA TTCMTTTRAGTTT 3′）進行擴增 （上海美吉生物公司合成）。

PCR擴增體系 （共20 μL）：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物各0.8 μL（5 μmol/L），F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，DNA模版10 ng，用滅菌超純水補足至20 μL。PCR反應在ABI GeneAmp?9700擴增儀上進行 （美國ABI公司）。PCR反應條件：95℃下預變性3 min；95℃下變性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸45 s，共進行28個循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min。

1.2.5高通量測序分析 PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 （美國AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)（美國Promega公司）檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合，構(gòu)建基因文庫，最后由上海美吉生物公司進行測序。

1.3數(shù)據(jù)處理

為了便于分析，對獲得的序列進行歸類操作，用MOTHUR 1.30.1軟件將97%相似水平下的序列歸為一個操作分類單元 （Operational Taxonomic U-nits，OTU），之后對每個樣本的Shannon多樣性指數(shù)、Chao1豐度指數(shù)、Coverage測序深度指數(shù)進行生物信息統(tǒng)計。

使用 NCBI的 BLAST檢索系統(tǒng) （http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）對得到的序列進行同源性分析，用CLUSTER軟件進行聚類分析，用Heatmap Illustrator 1.0.1軟件制作Heatmap圖。

2　結(jié)果與分析

2.1測序數(shù)據(jù)的合理性

采用細菌引物515F和907R對16S rDNA進行擴增，擴增結(jié)果見圖1。擴增產(chǎn)物為單一條帶，片段大小約400 bp，符合引物設計的長度。Miseq測序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，經(jīng)過質(zhì)控、去雜、拼接、校正，同時去掉質(zhì)量較低序列和嵌合體后得到有效序列，保證了測序數(shù)據(jù)的合理性。

本研究中共獲得174 988條有效序列，在97%的相似水平下，樣品被均一化為 275～660個OTUs。聚類分析結(jié)果表明，每個處理的兩個平行樣本聚集在一起，為同一個分支，距離最近，說明獲得的序列是可重復的，也是可靠的 （圖2）。

圖1　生物膜及水樣中細菌基因組PCR擴增圖Fig.1 PCR amplification profile of bacterial genome on bio-film and in water samples

圖2　基于OTU水平的12個樣本聚類圖Fig.2 Hierarchical clustering result of communities at OTU level in the twelve samples

2.2微生物群落組成分析

圖3為門分類水平的細菌群落組成。在可鑒別的細菌中，生物填料上生物膜的細菌種類大于對應水體中的細菌種類。M2生物膜上的細菌分屬于16個門，M3分屬于15個門，M1分屬于14個門；在生物濾池水樣中，W1的細菌種類最多，有13個門，其次為W3，有12個門，W2最少，有7個門。M1的優(yōu)勢菌為厚壁菌門Firmicutes，占細菌種類總數(shù)的61.62%，M2和M3上的優(yōu)勢菌為變形桿菌門Proteobacteria，分別占細菌總數(shù)的32.30%和34.78%；W1、W2和W3中的優(yōu)勢菌相同，均屬于厚壁菌門 Firmicutes，分別占門分類總數(shù)的52.27%、85.49%、37.14%。

綱分類水平的細菌種類所占百分比見表1。W2和W3中的優(yōu)勢菌為芽孢桿菌綱Bacilli，分別占細菌總數(shù)的86.67%和37.54%，W1的優(yōu)勢菌為鞘脂桿菌綱 Sphingobacteriia，占細菌總數(shù)的22.54%。生物膜上的優(yōu)勢菌各不相同，M1的優(yōu)勢菌為β-變形菌綱β-Proteobacteria，占細菌總數(shù)的64.29%，M2的優(yōu)勢菌為藍細菌綱Cyanobacteria，占細菌總數(shù)17.69%，M3中的優(yōu)勢菌為鞘脂桿菌綱Sphingobacteriia，占細菌總數(shù)的25.04%。

圖3　生物膜上主要細菌分類組成 （門水平）Fig.3 Percentages of the major phyla of bacteria on bio-film in each treatment

表1　生物膜及水體中主要細菌分類組成 （綱水平）Tab.1 Percentages of the major bacterial classes on bio-film and in water samples　%

圖4為3種填料的生物膜及其對應生物濾池水體中的細菌在屬水平所占比例圖。為避免數(shù)值差異過大及負數(shù)的產(chǎn)生，每個OTU所占百分比數(shù)值經(jīng)處理后繪制成Heatmap圖。生物膜及水樣中的細菌共分屬27個可以鑒別的屬，占所有屬序列的79.41%，有20.59%的序列屬于無法鑒別或未培養(yǎng)的細菌。M1中的優(yōu)勢菌為黃桿菌屬Flavobacterium，占細菌總數(shù)的7.85%；M2中的優(yōu)勢菌為硝化螺旋菌屬Nitrospira，占細菌總數(shù)的5.80%；M3中的優(yōu)勢細菌為紅環(huán)菌科的Sulfuritalea，占細菌總數(shù)的2.85%。3個生物濾池優(yōu)勢菌相同，為腸球菌屬Enterococcus，分 別 占 細 菌 總 數(shù) 的17.92%、73.94%、32.22%。

圖4　生物膜及水體中細菌主要屬所占比例圖Fig.4 Percent architecture heatmap of the major bacterial genera on each bio-film and in water samples

2.3細菌群落組成多樣性分析

生物膜及水樣中細菌的豐度指數(shù)及多樣性指數(shù)見表2。本研究中，樣本測序數(shù)在9043～15 227之間，從Chao1豐度指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)分析，生物膜的細菌豐度指數(shù)及多樣性指數(shù)均高于水體樣本。其中，M3的Chao1豐度指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)最高，分別為690.3和5.39，其次為M2，M1的細菌豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)在3種填料中最低。對應的生物濾池水體中，W2的細菌豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)較高，其次為W1，W3最低。各樣本的測序深度指數(shù)Coverage均大于98%，表明各樣本文庫覆蓋率較高，代表了樣本中微生物的真實情況 （表2）。

表2　生物膜和水樣中細菌的豐度指數(shù)及多樣性指數(shù) （α= 0.03）Tab.2 Richness and diversity index of the bacteria on biofilm and in water samples（α=0.03）

3　討論

3.1第三代高通量測序法的優(yōu)點

隨著分子生物學的發(fā)展，第三代高通量測序方法已經(jīng)用于環(huán)境微生物群落組成分析，越來越多的研究人員利用高通量測序平臺，對環(huán)境微生物的群落組成、細菌多樣性等方面進行了深入地研究［13-20］。傳統(tǒng)的微生物檢測方法基于可培養(yǎng)或可鑒別的細菌種類，對于樣本來源復雜、細菌含量較低、未培養(yǎng)等細菌不能有效檢測出。與傳統(tǒng)的分子生物學方法 （PCR-DGGE）相比，第三代高通量測序法能更全面、更客觀地反映環(huán)境樣本的微生物組成，尤其對含量較少的微生物群落，也能完全檢測出［21-23］。對高通量測序而言，測序的數(shù)量和深度直接影響測序結(jié)果，對所得序列能否全面反映樣本的真實情況有很大的影響。稀釋性曲線是從樣本中隨機抽取一定數(shù)量的個體，統(tǒng)計這些個體所代表的物種數(shù)目，并以個體數(shù)與物種數(shù)來構(gòu)建曲線［24］。本研究中，采用對序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線，圖5中各樣本曲線隨著測序深度的加深趨于平坦，說明更多的測序量只會產(chǎn)生少量新的OTU，表明目前的測序數(shù)據(jù)量合理。

圖5　樣本的稀釋性曲線圖 （相似水平為0.97）Fig.5 Rarefaction curve of bio-film and water samples （label 0.97）

3.2生物填料中優(yōu)勢菌的種類及其與水體凈化作用的關(guān)系

本研究結(jié)果表明，生物填料有富集水體細菌的能力，其生物膜上的細菌種類和豐度遠大于對應水體，且水體中的優(yōu)勢菌和生物膜上的優(yōu)勢菌并不相同，如水體中的優(yōu)勢菌為腸球菌屬Enterococcu，而生物膜上的優(yōu)勢菌為黃桿菌屬Flavobacterium、硝化螺旋菌屬Nitrospira等 （圖4）。原因可能是：本試驗中養(yǎng)殖用水為外塘自然水體，含有多種分別具有不同生理功能的細菌，而生物填料為生物膜的培養(yǎng)提供了可附著的棲息條件，水體中一部分細菌會逐漸附著其上，形成生物膜上的優(yōu)勢菌。不同類型生物填料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及其物理性質(zhì)不同，為微生物生長富集創(chuàng)造的環(huán)境條件也不同，生物膜載體對附著的細菌種類具有選擇性，水體中細菌只有一部分能附著于載體上，故水體中的優(yōu)勢菌并不一定能成為生物膜上的優(yōu)勢菌［24］。微生物是生物膜的主要組成部分，在微生物的生化代謝過程中，水體中的氨氮、亞硝酸鹽等營養(yǎng)鹽可以被其分解利用，導致水體中污染物濃度水平發(fā)生變化。當水體中的污染物濃度、溫度、碳氮比、氣水比等因素發(fā)生變化時，也會影響生物膜上的細菌組成，導致水體和生物膜中的優(yōu)勢菌不同［25］。

硝化細菌可以將水體中的亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽，是降解水體亞硝酸鹽的重要途徑，在氮循環(huán)水質(zhì)凈化過程中起重要作用。硝化螺旋菌Nitrospira作為硝化細菌的一個屬，已經(jīng)在不同的污水處理廠和實驗室反應器中被發(fā)現(xiàn)，并被認為是對含氮污染物的去除起重要作用的菌群［26-27］。在陶瓷環(huán)填料的生物膜中，硝化螺旋菌Nitrospira是屬水平可鑒別細菌中的優(yōu)勢菌，占細菌總數(shù)的5.80%，高于其他處理組，這與水質(zhì)檢測結(jié)果2號生物濾池對亞硝酸鹽去除率最高一致 （結(jié)果待報道）。

有研究指出，細菌群落組成中一些不能鑒別或未培養(yǎng)的細菌，可能在污染物去除過程中發(fā)揮重要的作用［28］。本研究中，在屬水平出現(xiàn)了大量不能鑒別或未培養(yǎng)的細菌 （圖4），這些未知細菌的功能有待深入研究。在相同的處理條件下，本研究中的彈性毛刷填料生物膜上的細菌種類最多，多樣性最高，但在微生物掛膜期間，其培養(yǎng)時間較長，如何實現(xiàn)其快速穩(wěn)定掛膜有待進一步研究。

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李倩1、2，胡廷尖1、2，辛建美1，王雨辰1，周志明1
（1.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州313001；2.農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室，浙江湖州313001）

Analysis of bacterial community compositions in three biological filter media by 16S rRNA gene library

LI Qian1，2，HU Ting-jian1，2，XIN Jian-mei1，WANG Yu-chen1，ZHOU Zhi-ming1
（1.Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries，Huzhou 313001，China；2.Key Laboratory of Healthy Freshwater Aquaculture，Ministry of Agriculture，Huzhou 313001，China）

The present study was aimed to analyze the composition of bacteria community and to evaluate the applications of biological filter media in recirculating aquaculture system.Bio-filters were constructed by three types of media and the bacterial community compositions of bio-film as well as water samples were studied using 16S rRNA gene amplification and Illumina high-throughput sequencing platform.The results showed that the three media all enriched the bacterial abundance and diversity，and that there were more bacterial species and higher biodiversity in the three media than those in the water samples.The predominant bacterial phylum was the same Firmicutes in all water samples of the three bio-filters.On the three media，however，there were different predominant bacteria in bio-film，including Firmicutes in polyethylene ball medium and Proteobacteria in submerged ceramics medium and elastic brush medium.In terms of bacterial species and diversity，the maximal value（26 genera）was observed in elastic brush medium.However，23 genera，the minimal species composition，was detected in polyethylene ball medium.

recirculating aquaculture system；bio-film；bacterial community；bio-filter

S959

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.04.007

2095-1388（2016）04-0384-06

2015-11-27

浙江省重點科技創(chuàng)新團隊計劃項目 （2011R50029）；浙江省重大科技專項重點農(nóng)業(yè)項目 （2013C02009）

李倩 （1984—），女，工程師。E-mail：2008feelkaka@sina.com

周志明 （1962—），男，教授級高工。E-mail：zjhz-zzz@163.com