胡居吾，付建平，韓曉丹，徐國良，王慧賓，熊偉

（江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 330096）

酶催化多功能性研究進(jìn)展

胡居吾，付建平*，韓曉丹，徐國良，王慧賓，熊偉

（江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 330096）

酶催化反應(yīng)具有高選擇性、條件溫和和可再生等優(yōu)點(diǎn)，是一種綠色環(huán)保的有機(jī)合成方法。近年來人們發(fā)現(xiàn)酶具有催化非天然底物發(fā)生天然反應(yīng)或非天然反應(yīng)的能力。這種獨(dú)特的能力被定義為酶催化多功能性，近年來備受人們的關(guān)注，為有機(jī)合成開辟了新的途徑。因此研究酶催化多功能性具有重要意義。本文敘述了酶的多功能性在催化aldol縮合，M annich反應(yīng)，M ichael加成反應(yīng)以及多米諾反應(yīng)中的應(yīng)用，展望了酶催化多功能性的研究趨勢(shì)。

酶催化多功能性；合成；反應(yīng)

酶一直以來被認(rèn)為是一種高效、專一，對(duì)一定反應(yīng)具有高度識(shí)別性的生物催化劑，且已被應(yīng)用到有機(jī)化合物的合成中[1]。然而，近年來，越來越多的酶被發(fā)現(xiàn)可以催化除天然反應(yīng)以外的一種甚至多種反應(yīng)類型，這種特性被稱為催化多功能性（Catalytic Promiscuity）。根據(jù)Hult和Berglund的報(bào)道[2]可以把酶催化多功能性分為3種類型。第一種，底物多樣性，即一種酶可以催化非天然底物進(jìn)行天然反應(yīng)；第二種，反應(yīng)條件多樣性，即酶可以在不同于天然反應(yīng)條件的催化環(huán)境中表現(xiàn)出催化活性，例如一些酶已經(jīng)被證明可以在有機(jī)溶劑、各種pH和溫度條件下催化有機(jī)反應(yīng)。第三種，催化反應(yīng)多樣性，通過同一個(gè)活性位點(diǎn)或者不同活性部位亦或引入新的活性位點(diǎn)催化各種反應(yīng)類型，這些反應(yīng)在鍵的斷裂、形成和機(jī)理上都與酶催化天然底物的反應(yīng)不同[3]。一般說的酶催化的多功能性指的都是第三種類型，酶催化非天然底物的反應(yīng)，這些反應(yīng)中鍵的斷裂、形成和機(jī)理都與酶催化天然底物反應(yīng)不一樣。當(dāng)然，催化多樣性都不可避免地會(huì)涉及到引發(fā)反應(yīng)的條件、各種非天然底物和分子機(jī)理[4]。雖然酶催化多功能性這一概念相對(duì)來說比較新，但是這種多樣性卻是普遍存在于酶中。酶學(xué)的這塊新領(lǐng)域還有幾個(gè)重要的原理和實(shí)踐應(yīng)用。例如，酶催化多功能性是研究學(xué)進(jìn)化的一個(gè)很好的出發(fā)點(diǎn)，已經(jīng)在進(jìn)化之間的相關(guān)性方面得到了應(yīng)用[5]。研究催化多樣性的機(jī)理和結(jié)構(gòu)為開發(fā)已知酶新的催化功能提供了重要的切入點(diǎn)。這些具有催化多功能性的酶為有機(jī)合成提供了諸多新型催化劑。

1 酶催化反應(yīng)媒介

長期以來，人們一直認(rèn)為生物功能大分子如蛋白質(zhì)、核酸等只能在水溶液中行使各自的生物功能，水溶液是這些大分子存在及其相互作用的天然介質(zhì)。然而，工業(yè)上的許多反應(yīng)都是在有機(jī)溶劑中進(jìn)行的，很多化合物在水中不溶，水還會(huì)導(dǎo)致副反應(yīng)的發(fā)生和腐蝕對(duì)水敏感的反應(yīng)試劑等，以上這些原因大大限制了酶的工業(yè)用途。原則上，把酶的反應(yīng)介質(zhì)換成有機(jī)溶劑可以解決以上大部分問題。1984年，Zaks 和Klibanov首次報(bào)道了脂肪酶在有機(jī)溶劑中具有極高的熱穩(wěn)定性和較高的催化活性，這使酶在有機(jī)介質(zhì)中催化作用的研究取得了突破性進(jìn)展[6]。2001年，Klibanov更是系統(tǒng)地報(bào)道了酶在有機(jī)溶劑中的催化活性提高了，因?yàn)槊冈谟袡C(jī)介質(zhì)中穩(wěn)定性更高，還具有“分子記憶”（Molecular Memory）功能，而且有機(jī)溶劑對(duì)酶的空間和立體選擇都有很大影響，有的時(shí)候甚至跟在水相中反應(yīng)的結(jié)果相反。當(dāng)然這不是說水在酶催化反應(yīng)中的作用完全不重要，1995年，Giacomo Carrea報(bào)道了來自假絲酵母菌的脂肪酶催化動(dòng)力學(xué)拆分，在有機(jī)溶劑中加入一定量的水，拆分效果達(dá)到最好[7]。加入一定量的水增加了酶的“柔性”，在最佳含水量時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)剛性（Kinetic Rigidity）和熱力學(xué)穩(wěn)定性（Thermodynamic Stability）之間達(dá)到最佳平衡點(diǎn)，酶才表現(xiàn)出最大活力（見圖1）。

圖1 “鋼性”與“柔性”的動(dòng)態(tài)平衡

有了以上的研究結(jié)果作為理論基礎(chǔ)，就能利用酶來催化一些基本的反應(yīng)類型，為構(gòu)建C-C鍵的方法學(xué)開拓新的領(lǐng)域。事實(shí)上，近年來酶多功能性催化的aldol反應(yīng)、Mannich反應(yīng)、Micheal加成反應(yīng)及多米諾反應(yīng)都有了很大進(jìn)展。本文重點(diǎn)介紹了這幾類反應(yīng)的研究進(jìn)展。

2 酶多功能性催化的aldol反應(yīng)

Aldol反應(yīng)是構(gòu)建C-C鍵的反應(yīng)之一，并被廣泛應(yīng)用在許多復(fù)雜天然或非天然有機(jī)化合物的合成中[8， 9]。Aldol反應(yīng)被發(fā)現(xiàn)以來，人們一直都在對(duì)其進(jìn)行研究，尋找更好更有效的催化劑來不斷改善它。最早用酶來催化aldol反應(yīng)的人是Wong及其合作者，他們首次報(bào)道了用脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶來催化aldol反應(yīng)，他們的靈感出自醛縮酶的天然屬性（見圖2）[10]。2002年Berglund等首次報(bào)道了醛縮酶以外的酶催化aldol反應(yīng)，他們利用生物工程改變脂肪酶B（來自假絲酵母菌）(Candida Antarctica lipase B，CAL-B)活性位點(diǎn)的氨基酸，結(jié)果得到了對(duì)aldol反應(yīng)有催化作用的變異酶（見圖3）[11]。2000年，List等和Barbas等分別報(bào)道了L-脯氨酸催化的不對(duì)稱aldol反應(yīng)，開辟了小分子催化有機(jī)反應(yīng)的新領(lǐng)域，這種催化劑的設(shè)計(jì)思路來自于模擬生物酶的催化特點(diǎn)（見圖4）[12]。這項(xiàng)研究成果大大激勵(lì)了生物有機(jī)化學(xué)家們對(duì)酶催化aldol反應(yīng)的興趣。2008年，余孝其課題組報(bào)道了豬胰脂肪酶催化的丙酮和苯甲醛的直接不對(duì)稱aldol反應(yīng)，并取得了最高43.6%的ee值（見圖5）[13]。當(dāng)然，這個(gè)結(jié)果還可以有很大的提高空間。何延紅課題組致力于這方面的研究，連續(xù)報(bào)道了木瓜凝乳蛋白酶催化的直接不對(duì)稱aldol反應(yīng)，獲得了很好的反應(yīng)結(jié)果（＞99%收率，＞99%的ee值）[14]。

圖2 首例酶催化的aldol反應(yīng)

圖3 脂肪酶B（來自假絲酵母菌）催化的己醛自身aldol反應(yīng)

圖4 L-脯氨酸催化的不對(duì)稱aldol反應(yīng)

圖5 首例酶催化的直接不對(duì)稱aldol反應(yīng)

圖6 核酸酶催化的直接不對(duì)稱aldol反應(yīng)

3 酶多功能性催化的Mannich反應(yīng)

Mannich反應(yīng)是有機(jī)合成中形成C-C鍵和引入含氮化合物最常用最經(jīng)濟(jì)的方法之一，在各種藥物和天然產(chǎn)物的合成中都有重要用途[15，16]。較理想的反應(yīng)過程是三組分一鍋法進(jìn)行。然而，事實(shí)是，大部分的反應(yīng)方法是兩組份分步進(jìn)行的，比如先生成親電的亞胺或者親核的烯醇和烯胺[17]。這些方法就降低了反應(yīng)的原子經(jīng)濟(jì)性并且還增加了實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜性。因此，Mannich反應(yīng)一鍋法作為符合綠色化學(xué)要求的實(shí)驗(yàn)策略，越來越受到人們的重視。用酶催化直接的Mannich反應(yīng)更是最近幾年才發(fā)展起來的新領(lǐng)域。2009年，余孝其和王娜等報(bào)道了脂肪酶催化的直接Mannich反應(yīng)，來源于米黑毛霉菌和假絲酵母菌的脂肪酶催化活性較高，分別得到了72%和48%的產(chǎn)率，作者還發(fā)現(xiàn)反應(yīng)體系中的含水量對(duì)酶的活性影響很大（見圖7）[18]。2010年，他們又報(bào)道了來自皺褶念珠菌脂肪酶催化的直接Mannich反應(yīng)，拓展了酶的多功能性和底物范圍[19]。同年，章鵬飛課題組也報(bào)道了豬胰蛋白酶催化的直接Mannich反應(yīng)，同樣取得了很好的結(jié)果（見圖8）[20]。

圖7 脂肪酶催化的直接Mannich反應(yīng)

圖8 豬胰蛋白酶催化的直接Mannich反應(yīng)

4 酶多功能性催化的Michael反應(yīng)

4.1 C-C鍵的形成

Berglund和同事報(bào)道了第一個(gè)脂肪酶催化的1, 3-二羰基化合物和α, β-不飽和羰基化合物Michael反應(yīng)的例子。他們將來自假絲酵母菌的脂肪酶B活性位點(diǎn)一個(gè)氨基酸取代掉，經(jīng)過人工改造過的酶對(duì)Michael反應(yīng)的催化能力比天然的酶要強(qiáng)的多（見圖9）[21]。2009年，又報(bào)道了同樣的變異酶催化丙烯酸甲酯與乙酰丙酮之間發(fā)生的Michael反應(yīng)[22]。林賢福發(fā)現(xiàn)Zn2+依賴的酰基轉(zhuǎn)移酶能催化1，3-二羰基化合物和甲基乙烯基酮的Michael反應(yīng)[23，24]。Griengl和同事研究了有手型合成潛力的Michael反應(yīng)（見圖10）[25]。直到前不久，何延紅課題組報(bào)道的固定化脂肪酶（Immobilized Lipase from Thermomyces Lanuginosu，Lipozyme TLIM）催化不對(duì)稱Michael反應(yīng)，才真正實(shí)現(xiàn)了酶催化Michael反應(yīng)的不對(duì)稱合成（見圖11）[26，27]。

圖9 CAL-B變體催化的1,3-二羰基化合物和α,β-不飽和羰基化合物Michae反應(yīng)

圖10 具有手型合成潛力的Michael反應(yīng)

圖11 固定化脂肪酶催化不對(duì)稱Michael反應(yīng)

4.2 C-N鍵的形成

2003年底，林賢福和同事首次報(bào)道了蛋白酶催化的氮雜Michael反應(yīng)，他們分別用咪唑衍生物和嘧啶衍生物做親核試劑進(jìn)攻α, β-烯類化合物得到一系列的加成產(chǎn)物（見圖12）[28]。Gotor和同事報(bào)道了CAL-B催化仲氨和丙烯氰的Michael加成反應(yīng)（見圖13）[29]。最近，Escalante和Castillo探究了溶劑對(duì)CAL-B催化的苯胺和巴豆酸甲酯發(fā)生Michael反應(yīng)和氨解反應(yīng)的影響，他們發(fā)現(xiàn)Michael加成更易在疏水性溶劑中進(jìn)行，然而極性溶劑對(duì)酰胺的生成更有利（見圖14）[30]。

圖12 水解酶催化的咪唑，嘧啶，嘌呤參與的Michael反應(yīng)

圖13 脂肪酶催化的仲氨和丙烯氰之間的Michael反應(yīng)

圖14 CAL-B催化的苯胺和巴豆酸甲酯發(fā)生Michael反應(yīng)

4.3 C-O，C-N鍵的形成

Kitazume等很早就把苯硫酚用作Michael加成的親核試劑。他們報(bào)道了豬肝酯酶催化的苯硫酚與2-（三氟甲基）丙烯酸在水中的Michael加成反應(yīng)[31]。在另外一篇報(bào)道中，他們用修飾過的酶催化三氟甲基取代的丙烯酸酯與苯硫酚的Michael反應(yīng)，得到了有較好光學(xué)純的產(chǎn)物（見圖15）[32]。

圖15 苯硫酚與三氟取代α, β-不飽和化合物的Michael加成反應(yīng)

由于氧原子相對(duì)差的親核性，C-O鍵的形成較難，因此關(guān)于酶催化形成C-O鍵的Michael加成反應(yīng)極少被報(bào)道。Whitman報(bào)道了細(xì)菌異構(gòu)酶催化的3-E-氯和3-E-溴丙烯酸酯水合作用，生成的鹵化醇不穩(wěn)定，會(huì)分解為2-羰基丙酸鹽，繼續(xù)脫羧為乙醛（見圖16）[33]。

圖16 細(xì)菌異構(gòu)酶催化的3-E-鹵丙烯酸酯水合作用

5 酶多功能性催化的多米諾反應(yīng)

現(xiàn)代有機(jī)合成對(duì)化學(xué)工作者的要求不再只是拿到目標(biāo)分子, 還要求化學(xué)家更加注重反應(yīng)的效率和原子經(jīng)濟(jì)性。高效、高選擇性、環(huán)境友好的綠色化學(xué),已成為現(xiàn)代有機(jī)化學(xué)發(fā)展的趨勢(shì)。關(guān)于酶催化的多米諾反應(yīng)（也可稱為串聯(lián)反應(yīng)）的報(bào)道也越來越多。早先的報(bào)道都是多種酶的串聯(lián)反應(yīng)，分別被應(yīng)用于糖類衍生物[34]、頭孢菌素[35]和核黃素等天然產(chǎn)物的合成[36]。但是，在這樣的體系中每種酶要求的反應(yīng)條件往往不一樣，甚至有些酶對(duì)前一步反應(yīng)有抑制作用[37]。單一酶催化的串聯(lián)反應(yīng)就能克服這些缺點(diǎn)。2004年，林賢福課題組報(bào)道了堿性蛋白酶（Alkaline Protease from Bacillus subtilis）催化的包含一個(gè)葡萄糖支鏈氮取代咪唑衍生物一鍋法合成的例子，酶在吡啶的環(huán)境中成功催化了酰基化/Michael加成兩步反應(yīng)，得到了具有抗癌活性的產(chǎn)物（見圖17）[38]。近一兩年，關(guān)于單一酶催化的串聯(lián)反應(yīng)的報(bào)道更加密集。2011年，章鵬飛課題組就分別報(bào)道了豬胰脂肪酶(Lipase from Porcine pancreas，PPL)催化的螺氧化吲哚衍生物的合成[39]和四氫苯并吡喃衍生物的合成（見圖18和圖19）[40]。同年，林賢福等報(bào)道了CAL-B催化的著名Hantzsch反應(yīng)，獲得了一系列的1, 4-二氫吡啶衍生物[41]。何延紅課題組亦探究了堿性蛋白酶（Alkaline Protease from Bacillus licheniformis，BLAP）催化的香豆素衍生物的合成，控制反應(yīng)條件能實(shí)現(xiàn)Knoevenagel/分子內(nèi)酯交換串聯(lián)反應(yīng)與Knoevenagel/半酮化串聯(lián)反應(yīng)之間的轉(zhuǎn)化（見圖20）[42]。以上的例子都清晰地給出了一個(gè)啟示，未來酶多功能性催化反應(yīng)的趨勢(shì)就是酶催化多米諾反應(yīng)。

圖17 堿性蛋白酶催化的氮取代咪唑衍生物的合成

圖18 豬胰脂肪酶催化的Spirooxindole衍生物的一鍋法合成

圖19 豬胰脂肪酶催化的四氫可的索衍生物的一鍋法合成

圖20 堿性蛋白酶BLAP催化的香豆素衍生物的合成

6 結(jié)語

綜上所述，酶促反應(yīng)具有方法學(xué)上的重要意義，為有機(jī)合成提供了一種新型、有效且經(jīng)濟(jì)環(huán)保的途徑。未來酶多功能性催化研究的主要方向應(yīng)是酶催化多米諾反應(yīng)以及不對(duì)稱合成。

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Research Progress in Enzymatic Promiscuity

Hu Ju-wu, Fu Jian-ping*, Han Xiao-dan, Xu Guo-liang, Wang Hui-bin, Xiong Wei
(Institute of Applied Chemistry, Jiangxi Academy of Sciences, Jiangxi Nanchang 330029)

Enzymatic method is efficient and green tool for modern organic synthesis due to its high selectivity, mild conditions and potential use of inexpensive regenerable resources. It is very significative to profile the novel unnatural activities of existing enzymes systematically since it might lead to improvements in existing catalytic methods and provide novel synthesis pathways which are currently not available. This ability is defined as enzymatic promiscuity and has attracted much attention and expanded rapidly in recent years. Some elegant works of enzymatic promiscuity including aldol condensation, Mannich reaction, Michael additions, Markovnikov additions and Henry reactions have been reported in the last decades, and the future research direction is suggested in the paper.

Enzymatic promiscuity; Synthesis; Reaction

Q814

A

2096-0387（2016）01-0059-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)31260400）；江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)20141BBF60044）。

胡居吾（1977-），男，在讀博士，副研究員，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。

付建平（1987-），男，碩士研究生，助理研究員，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。