潘瑤+陳和強

摘要：為了分析藏豬促紅細胞生成素（EPO）的表達與低氧適應(yīng)的關(guān)系，對高海拔藏豬（ZZ）和大約克夏豬（YZ），低海拔藏豬（ZB）和大約克夏豬（YH）的腎臟組織EPO蛋白的表達量進行了檢測分析。結(jié)果表明，當(dāng)大約克夏豬處在高海拔應(yīng)急狀態(tài)下時，EPO的表達量高于藏豬；長期生活在高原的大約克夏豬EPO 的表達量較藏豬低，但高于低海拔大約克夏豬。說明藏豬適應(yīng)高原低氧環(huán)境的主要因素為EPO的穩(wěn)定表達，高原大約克夏豬腎臟組織內(nèi)EPO的高表達，是其對高原低氧環(huán)境適應(yīng)的生理調(diào)節(jié)過程。

關(guān)鍵詞：藏豬；促紅細胞生成素（EPO）；低氧適應(yīng)

中圖分類號：S828 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2016）06-0008-02

藏豬生活的地域主要為青藏高原2 500～4 300 m海拔的半農(nóng)半林半牧區(qū)以及農(nóng)區(qū)，屬于獨特的高原型地方豬種，高原低氧適應(yīng)能力非常強[1]。本研究主要分析了藏豬促紅細胞生成素（EPO）的表達與低氧適應(yīng)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗對象 本試驗所用高海拔藏豬（ZZ）和高海拔大約克夏豬（YZ），均來自西藏，低海拔藏豬（ZB）和低海拔大約克夏豬（YH），分別來自北京和安徽，均選擇6頭，6個月大，無任何疾病，體重沒有明顯差別，相互之間沒有親緣關(guān)系。選取試驗豬的腎臟組織，利用液氮對其迅速進行冷凍，保存于-80 ℃溫度下，以備蛋白提取。

1.1.2 儀器與試劑 水平脫色搖床、凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、UV2000紫外可見分光光度計、高通量組織研磨儀、高速冷凍離心機等。

無水乙醇、一抗及二抗稀釋液、過硫酸銨、二硫蘇糖醇、DBA辣根過氧化物酶顯色試劑盒、預(yù)染彩虹蛋白Marker、硫脲、丙烯酰胺儲液、尿素、蛋白酶抑制劑—苯甲基磺酰氟PMSF、磷酸、封閉液等。

1.2 方法

1.2.1 蛋白提取 在圓底EP管中放入微量液氮凍結(jié)組織，將含有蛋白酶抑制劑的尿素裂解液選取適量加入其中，利用勻漿器進行勻漿處理，15 500 r/min離心50 min，選取上清液作為總蛋白。定量蛋白選擇Bradrord檢測法完成。

1.2.2 電泳 依照固定配方進行不連續(xù)PAGE制備，1板8.3 cm（W）×7.3 cm（L）。在3～15 μL上樣緩沖液中加入等量樣品，在PCR儀上進行6 min的變形處理，溫度為99 ℃，馬上放到冰浴中進行冷卻。在12 mA的電流下進行1.5～2.0 h的穩(wěn)流電泳。

1.2.3 Western blotting 先選擇甲醇將0.45 μm孔徑的PVDF膜激活，接著在轉(zhuǎn)移緩沖液中將凝膠、濾紙以及PVDF膜浸透，根據(jù)說明組裝海綿墊→濾紙→凝膠→PVDF膜→濾紙→海綿墊，在電流為300 mA的恒流下進行1.5 h的轉(zhuǎn)移。選擇TBS對轉(zhuǎn)后的PVDF膜進行30 s的漂洗，在4 ℃的封閉液中過夜。按1∶250以及1∶1 000利用一抗稀釋液對目的蛋白EPO以及內(nèi)參蛋白tubulin抗體進行稀釋，在室溫下進行2 h的孵育。進行3次PBST洗膜，均為5 min，將沒有結(jié)合的一抗洗去。用二抗稀釋液對二抗進行稀釋，在室溫下將膜放置其中進行1.5 h的孵育，進行5次PBST洗膜，每次均為5 min，將沒有結(jié)合的二抗洗去[2]。應(yīng)用DAB法進行顯色處理，在蒸餾水中使顯色終止，晾干顯影后的PVDF利用掃描儀進行掃描，備電子版使用。

1.3 統(tǒng)計方法

選擇SPSS19.0對研究統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳結(jié)果

結(jié)果顯示在20～170 ku存在非常豐富的蛋白，整個電泳期間蛋白保存完好，條帶清晰。

2.2 EPO蛋白在兩種豬腎臟組織的表達

檢測結(jié)果表明，EPO表達量顯示了海拔高低及個體間的差異。進一步分析代表性的3組結(jié)果，A組中ZZ、ZB、YZ、YH的EPO表達量分別為（0.083±0.008）、（0.072±0.006）、（0.111±0.011）、（0.047±0.007），ZZ與ZB、YZ、YH間均差異明顯（P<0.05），EPO表達量排序為YZ>ZZ>ZB>YH；B組EPO表達量，ZZ與ZB間無明顯差異（P>0.05），ZZ與YZ、YH間差異明顯（P<0.05），EPO表達量排序為ZZ>ZB>YZ>YH；C組EPO表達量，ZZ與YZ間，YZ與ZB、YH間差異明顯（P<0.05），大小順序為ZB>ZZ>YZ>YH。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)海拔不同的藏豬和大約克夏豬腎臟組織EPO蛋白存在差異，對EPO與低氧適應(yīng)的關(guān)系進行了簡單探討。試驗結(jié)果表明，長期的低氧環(huán)境使得藏豬EPO實現(xiàn)穩(wěn)定表達，當(dāng)大約克夏豬處在高海拔應(yīng)急狀態(tài)下時，EPO的表達量高于藏豬；長期生活在高原的大約克夏豬EPO 的表達量較藏豬低，但高于低海拔大約克夏豬。說明藏豬適應(yīng)高原低氧環(huán)境的主要因素為EPO的穩(wěn)定表達，高原大約克夏豬腎臟組織內(nèi)EPO的高表達，是其對高原低氧環(huán)境適應(yīng)的生理調(diào)節(jié)過程。藏豬是高原型獨有的豬種，是研究低氧適應(yīng)機制的有力代表，并且能夠延伸至整個哺乳動物界在高原低氧環(huán)境中的適應(yīng)性機制。

參考文獻：

[1] 孔小艷，茍 瀟，馬 騰，等.藏豬低氧適應(yīng)的血液生理指標研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，29（2）：297-300.

[2] 徐業(yè)芬，王 震，牛家強，等.西藏林芝地區(qū)藏豬心電圖分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016（4）：143-146.