盧桂英 程水連 何建國(guó) 宋艷春

（湖南省益陽市產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，湖南 益陽 413000）

HPLC法快速測(cè)定竹涼席中的羅丹明B

盧桂英 程水連 何建國(guó) 宋艷春

（湖南省益陽市產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，湖南 益陽 413000）

建立了快速測(cè)定竹涼席中染色劑羅丹明B的含量的方法。以甲醇水溶液超聲提取，用高效液相色譜法（熒光檢測(cè)器）測(cè)定，峰面積外標(biāo)法定量，在優(yōu)化條件下，羅丹明B的質(zhì)量濃度在0.5～100.0ng/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9999，檢出限為3.0ng/L，加標(biāo)回收率為87.0%～100.2%，得到羅丹明B的質(zhì)量濃度和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.24%和0.05%。該方法樣品處理簡(jiǎn)單、快速，適用于竹涼席中羅丹明B的日常檢測(cè)。

羅丹明B；高效液相色譜法；熒光檢測(cè)器；竹涼席

羅丹明B，又稱玫瑰紅B，或堿性玫瑰精，俗稱花粉紅，是一種具有鮮桃紅色的人工合成染料。羅丹明B在溶液中有強(qiáng)烈的熒光，用作實(shí)驗(yàn)室中細(xì)胞熒光染色劑及有色玻璃、特色煙花爆竹等行業(yè)。本研究建立了一種準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)竹涼席中的羅丹明B含量的方法，該方法樣品前處理簡(jiǎn)單、羅丹明B的色譜峰形好、定量結(jié)果具有很好的重現(xiàn)性、精密度，該方法有著重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1.試驗(yàn)部分

1.1儀器和試劑

WH-400超聲清洗器（濟(jì)寧萬和超聲電子設(shè)備有限公司）；LC-MS2020液相色譜儀，帶熒光檢測(cè)器，（日本島津公司）；LP502A型分析天平，感量0.0001g，（常熟市百靈天平儀器有限公司）；中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)篩100目；0.45μm有機(jī)微孔濾膜；超純水器（艾柯公司）。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：精密稱取羅丹明B0.0500g置于100mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并準(zhǔn)確定容至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度為0.5mg/mL的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：用流動(dòng)相將上述標(biāo)準(zhǔn)液稀釋為0.5ng/mL，1.0ng/mL，5.0ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，的工作液。此工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2樣品的制備

取烘干至恒重的竹涼席塊切小，放入中草藥粉碎機(jī)中粉碎，過60目的分子篩，取混合均勻的樣品2g，放入100mL的容量瓶中，加色譜純甲醇至刻度，超聲提取30min，靜置5min后，取上清液過0.45μm有機(jī)微孔濾膜后，用液相色譜儀測(cè)定。

1.2.3色譜分析條件

色譜柱：C18，柱長(zhǎng)150mm，內(nèi)徑4.6mm，粒度5μm；柱溫：35℃。

進(jìn)樣量：10μL；流速：1.0mL/min；流動(dòng)相：甲醇和水（比例為60：40）。

熒光條件：激發(fā)波長(zhǎng)（Ex）550nm，發(fā)射波長(zhǎng)（Em）580nm。

2.結(jié)果與討論

2.1檢測(cè)器及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

因羅丹明B的甲醇溶液有強(qiáng)烈的熒光，相比紫外檢測(cè)器，熒光檢測(cè)器的靈敏度更高，而熒光檢測(cè)器相比于質(zhì)譜檢測(cè)器，價(jià)格更優(yōu)惠，實(shí)驗(yàn)室使用更普及些，因此選用熒光檢測(cè)器作為高效液相的檢測(cè)器測(cè)定羅丹明B；通過對(duì)羅丹明B的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行光譜掃描可知，羅丹明B在550nm處吸收峰最大，因此將選定為550nm為激發(fā)波長(zhǎng)（Ex），580nm為發(fā)射波長(zhǎng)（Em）。

2.2樣品提取條件的選擇

羅丹明B是酸堿兩性化合物，易溶于水、甲醇、乙腈等。其中甲醇溶液呈現(xiàn)玫瑰紅色，有強(qiáng)烈的熒光，故選用純的甲醇提出。因羅丹明B是易溶的物質(zhì)，而且超聲提取是最簡(jiǎn)單快捷的提取方法，所需要時(shí)間短，溶劑量少而且提取完全，因此采用超聲提取法。超聲提取后，樣品溶液直接進(jìn)液相色譜分析，待測(cè)組分的損失少，回收率也很高。

表1　精密度試驗(yàn)結(jié)果

表2　回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3色譜條件的選擇

根據(jù)羅丹明B的性質(zhì)采用反相液相色譜法，C18，（150mm×4.6mm，5μm）色譜柱進(jìn)行分離，該色譜柱由于粒徑小，比表面積大，柱效顯著提高，色譜分析比較理想。流動(dòng)相選擇：分別嘗試了不同比例的甲醇-水溶液進(jìn)行洗脫，并嘗試了梯度洗脫方式，發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲醇與水的比例為60∶40，進(jìn)行等度洗脫時(shí)，峰形很好，如圖1和圖2所示，圖1為羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)色譜圖，出峰時(shí)間為13.157min。圖2為樣品的色譜圖，出峰時(shí)間為13.170min。因此選擇了甲醇-水為60∶40的體系作為流動(dòng)相，等度洗脫方式。

2.4線性方程及檢出限

用羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶進(jìn)行稀釋，配置以下濃度的羅丹明B工作液：0.5ng/mL，1.0ng/mL，5.0ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，6個(gè)水平的工作液。對(duì)每個(gè)工作濃度液分別平行測(cè)定3次，以羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以各個(gè)濃度水平的色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性擬合。結(jié)果表明，羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度在0.5～100ng/mL范圍內(nèi)與相應(yīng)色譜峰峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=47540X+6123（r=0.9999）。

同等色譜條件下進(jìn)行空白試驗(yàn)，對(duì)空白樣平行測(cè)定10次，計(jì)算相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，以空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍值除以線性方程的斜率，得方法的檢出限為3.0ng/g.

2.5精密度試驗(yàn)

對(duì)20.0ng/mL的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行8次平行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果列于表1.并計(jì)算8次結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，得到羅丹明B的質(zhì)量濃度和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.24%和0.05%，表明該方法精密度良好。

2.6回收試驗(yàn)

采用沒有用羅丹明B染色的竹涼席中添加羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行回收試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取相同的空白涼席試樣5份，分別加入5.0ng/mL，10.0ng/mL，20.0ng/mL， 30.0ng/mL，50.0ng/mL5個(gè)不同水平的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行與樣品相同的提取處理和測(cè)定，回收試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，在添加質(zhì)量濃度為5.0～50.0ng/mL時(shí)羅丹明B的回收率為87.0%～100.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.81%～1.21%之間。

結(jié)語

研究通過高效液相色譜法測(cè)定染色竹涼席中的羅丹明B含量的結(jié)果表明，該方法：前處理簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、可操作性強(qiáng)，能滿足于竹涼席中非法添加染色劑羅丹明B冒充碳化竹涼席的日常檢測(cè)。

［1］陳國(guó)珍，黃賢智，鄭朱梓，等.熒光分析法（第二版）［M］.北京：北京科學(xué)出版社，1990：69.

［2］盧士英，鄒明強(qiáng).食品中常見的非食用色素的危害與檢測(cè)［J］.中國(guó)儀器儀表，2009（8）：45-50.

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