由淑萍，趙　軍，馬　龍，張石蕾，劉　濤

(1. 新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，新疆 烏魯木齊　830011;2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊　830004)

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肉蓯蓉苯乙醇總苷對血小板衍生生長因子誘導的肝星狀細胞增殖的影響及機制

由淑萍1，趙軍2，馬龍1，張石蕾1，劉濤1

(1. 新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，新疆 烏魯木齊830011;2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊830004)

目的探討肉蓯蓉苯乙醇總苷(CPhGs)抑制血小板衍生生長因子-BB(rrPDGF-BB)介導的大鼠肝星狀細胞(HSC)增殖活化作用及對PDGF/ERK1/2信號通路表達的影響。方法培養(yǎng)HSC細胞，體外給予不同濃度(0、3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00和500.00 mg·L-1)的CPhGs測定半數(shù)抑制率(IC50)，選取25、50、75、100 mg·L-1的CPhGs，rrPDGF-BB刺激后，通過四甲基偶氮唑鹽法(MTT)檢測細胞的增殖；采用熒光定量PCR(RT-PCR)檢測ERK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun和Collagen I mRNA的表達；進一步采用Western blot 法檢測CPhGs對PDGF/ERK1/2通路中ERK1/2、P-ERK1/2和Collagen I蛋白的表達。結(jié)果(50～100)mg·L-1的CPhGs可以抑制rrPDGF-BB誘導的HSC的增殖(P<0.05)；(25～100)mg·L-1劑量組的CPhGs均可抑制ERK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun和Collagen Ⅰ mRNA水平的表達，并且明顯抑制ERK1/2、P-ERK1/2和Collagen Ⅰ通路蛋白的表達。結(jié)論CPhGs的抗肝纖維化作用可能與其阻斷PDGF/ERK1/2通路進而阻斷HSC的活化、增殖有關(guān)。

肉蓯蓉苯乙醇總苷; 血小板衍生生長因子; 肝星狀細胞; 肝纖維化;細胞增殖;信號通路;作用機制

肝纖維化是慢性肝病發(fā)展為晚期肝硬化的中間環(huán)節(jié)，由細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成與降解失衡所致，已成為肝病死亡的主要原因[1]。纖維化ECM產(chǎn)生于肌成纖維細胞(myofibroblast，MFB)，MFB主要來源于活化的肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)[2-3]；因此，抑制HSC的激活，減少其增殖、活化是有效阻斷肝纖維化發(fā)生、發(fā)展進程的重要途徑，對預防肝硬化[4]、逆轉(zhuǎn)肝纖維化的病程[5]具有重要的意義。肉蓯蓉(Cistanche)是列當科肉蓯蓉屬，一種在沙漠樹木梭梭根部的寄生植物，中國傳統(tǒng)的名貴中藥材，其主要成分中苯乙醇總苷(phenylethanol glycosides from cistanche tubulosa，CPhGs)[6]系發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種生物活性。前期研究顯示，CPhGs對牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)所致肝纖維化大鼠具有一定的防治作用[7-8]，血小板衍生生長因子(PDGF)-BB已被證實在刺激HSC生長和相關(guān)細胞間信號傳遞方面較為重要，本研究旨在觀察CPhGs在rrPDGF-BB誘導的HSC細胞增殖中的作用及其對ERK信號轉(zhuǎn)導通路的影響。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器肉蓯蓉苯乙醇總苷：管花肉蓯蓉取自新疆吐魯番地區(qū)，物種標本憑證存放于新疆省中藥研究所，CPhGs由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所植物化學室提取純化，純度為70%，以含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)液配成不同濃度的混懸液，經(jīng)0.22 μm濾器過濾后使用；大鼠HSC購自武漢Procell生物科技有限公司；Recombinant rat PDGF-BB購自 Peprotech公司；ERK1/2、α-SMA、β-actin引物委托上海生工生物工程服務有限公司設計，經(jīng)Genbank核實后合成；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo scientific公司；熒光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)試劑盒購自QIAGEN GmbH公司；β-actin單克隆抗體購自武漢Proteintech公司；p44/42 MAPK(ERK1/2) Antibody和Phospho-p44/42 MAPK(ERK1/2) Antibody購自Cell signaling technology公司；Collagen Ⅰ(ab34710)抗體購自Abcam公司；堿性磷酸酶標記的二抗購自于美國Invitrogen公司；RIPA裂解液購自于Thermo Fisher Scientific公司。

1.2HSC的培養(yǎng)和傳代和半數(shù)抑制率(IC50)HSC常規(guī)復蘇后，用含10%的胎牛血清的DMEM(高糖)完全培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)；當細胞呈單層致密狀時，常規(guī)胰蛋白酶消化傳代，24 h換液，72 h再傳代；實驗選用對數(shù)生長期細胞，以5×104·L-1接種于96孔板，24 h后換液，加入不同濃度組(0、3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00和500.00 mg·L-1)的CPhGs，每組4個復孔，作用48 h，MTT法于酶標儀490 nm測定吸光度A值并取均數(shù)，計算IC50。

Tab 1　Composition of RT-PCR primer sequences

1.3MTT法檢測CPhGs對rrPDGF-BB刺激HSC增殖影響實驗分組為空白對照組、rrPDGF-BB刺激組、PDGF-BB+不同終濃度(25、50、75、100 mg·L-1)CPhGs給藥組。另設與試驗平行不加細胞只加DMEM培養(yǎng)液的空白組。rrPDGF-BB的終濃度為10 ng·L-1，每組4個復孔，分別在加藥后24、48、72 h后進行MTT法檢測HSC的增殖抑制作用。抑制率/%=[(A模型組-A空白組)-(A用藥組-A空白組)]/(A模型組-A空白組)×100%。

1.4CPhGs對rrPDGF-BB刺激的HSC ERK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun 和Collagen Ⅰ mRNA表達的影響收集各組細胞，提取細胞總RNA，cDNA合成參照公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成。引物的設計及合成：由上海生工生物有限公司采用引物設計軟件Batch Primer 3設計，經(jīng)Genbank核實后合成。引物序列見Tab 1。

反應條件：94℃變性3 min，變性94℃ 30 s，退火30 s，延伸72℃ 45 s，循環(huán)30次，終末延伸72℃ 10 min，其他步驟按說明書進行操作。以β-actin為內(nèi)參，以目的基因與β-actin的比值表示目的基因mRNA的相對表達量(2-ΔΔCt)。

1.5CPhGs對rrPDGF-BB刺激的HSC p44/42 MAPK(ERK1/2)、Phospho-p44/42 MAPK(P-ERK1/2)和Collagen Ⅰ蛋白表達的影響細胞分組同上。RIPA裂解液裂解細胞，4℃ 12 000×g離心收集上清液，BCA法測定蛋白含量，加4×loading buffer煮沸蛋白，上樣蛋白量30 μg，制備10%的SDS-PAGE凝膠進行電泳。100 V恒壓轉(zhuǎn)膜70～100 min，用10%脫脂奶粉封閉1 h。一抗為兔抗p44/42 MAPK(ERK1/2) antibody和Phospho-p44/42 MAPK(ERK1/2) antibody(1 ∶1 000)及β-actin(1 ∶5 000)單克隆抗體，二抗為堿性磷酸酶標記的抗兔抗體(InvitrogenTM)，顯色劑顯影，GEL DOC XR凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1CPhGs對HSC的IC50由Fig 1可知，隨著CPhGs藥物濃度的增加，HSC的抑制率逐漸增加，CPhGs在500 mg·L-1濃度時，抑制率達到73.4%，采用Probit分析，計算CPhGs藥物的IC50為119.125 mg·L-1。

Fig 1　Effects of different concentrations of CPhGs on proliferative activity of HSC cells in 48 h

2.2不同濃度、不同時間CPhGs對rrPDGF-BB 誘導HSC細胞的增殖抑制作用與正常對照組比較，rrPDGF-BB(10 ng·L-1)組的HSC細胞明顯增加，其中以48 h增殖最為明顯(P<0.01)，提示模型構(gòu)建成功；與rrPDGF-BB組比較，除25 mg·L-1的CPhGs對HSC的抑制作用在24 h及48 h作用不明顯以外，余CPhGs組均能不同程度地抑制rrPDGF-BB誘導的HSC的增殖，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中rrPDGF-BB+CPhGs 100 mg·L-1劑量組的抑制率最高達47.20%；以抑制率表現(xiàn)最佳的CPhGs 100 mg·L-1進行藥物作用時間的考察，CPhGs

Tab 2　Inhibition effects of CPhGs with different doses on rrPDGF-BB induced HSC ±s)

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vsPDGF-BB group

作用于細胞48 h較24 h時抑制率明顯增加，但48 h后抑制率增加逐漸平緩，72 h時抑制率最佳。說明CPhGs發(fā)揮作用的最佳時間為rrPDGF-BB 刺激 HSC細胞48 h，后續(xù)時間，CPhGs的抑制率增加趨于穩(wěn)定，見Tab 2。

2.3CPhGs對rrPDGF-BB刺激的HSC ERK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun 和Collagen Ⅰ mRNA表達的影響RT-PCR檢測ERK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun、Collagen Ⅰ及β-actin基因表達，25～100 mg·L-1濃度的CPhGs均可不同程度地下調(diào)細胞ERK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun、Collagen I的mRNA表達，結(jié)果顯示：與正常對照組比較，在rrPDGF-BB組ERK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun和Collagen Ⅰ mRNA的表達水平(P<0.05)明顯增高；與rrPDGF-BB組比較，CPhGs不同濃度藥物組的ERK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun和Collagen Ⅰ mRNA表達強度均有所下降(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義(Fig 2)。

Fig 2　Effects of CPhGs on expressions of ERK1/2, α-SMA, c-fos, c-jun and Collagen Ⅰ in HSC(RT-PCR assay)

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vsrrPDGF-BB group

2.4CPhGs對rrPDGF-BB刺激的HSC ERK1/2、p-ERK1/2和Collagen Ⅰ蛋白表達的影響如Fig 3所示，rrPDGF-BB刺激的HSC ERK1/2、p-ERK1/2和Collagen Ⅰ蛋白表達較正常組明顯增加，CPhGs(25、50、75、100 mg·L-1)給藥組均可不同程度地抑制rrPDGF-BB誘導的HSC ERK1/2、p-ERK1/2和Collagen Ⅰ蛋白表達，其中以CPhGs100 mg·L-1給藥組作用效果最為明顯。

3　討論

PDGF主要源于血液中的血小板、肝竇內(nèi)皮細胞、HSC、單核細胞、肝庫普弗細胞等[9]。PDGF 包括-AA,-AB,-BB 3種亞型，其中PDGF-BB 主要位于肝臟，促HSC增殖的作用也最強，能促進HSC活化增殖、膠原分泌，是目前已知的促HSC增殖的細胞因子和促有絲分裂原；病理條件下靜止的HSC表型會被激活，在肝纖維化進程中扮演著重要角色，能促使肝內(nèi)的細胞-細胞、細胞-基質(zhì)、基質(zhì)-介質(zhì)間相互作用，在復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng)中，促使細胞大量增殖；合成并分泌以膠原為主的ECM 和細胞因子、表達α-SMA、多種細胞因子及其受體、同時具有收縮功能。因此抑制rrPDGF-BB 對HSC的生物學作用對防治肝纖維化有重要的意義。

ERK1/2可被多種癌基因產(chǎn)物激活后向核內(nèi)傳遞信號，磷酸化和活化核內(nèi)的效應分子，調(diào)節(jié)下游核轉(zhuǎn)錄因子的表達，如c-myc、c-fos、c-jun、cyclin-D1、Bcl-2等，最終啟動與調(diào)節(jié)細胞的生長、發(fā)育、分化、凋亡等多種生理過程相關(guān)的靶基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮促進細胞的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移與惡性轉(zhuǎn)化的功能[10]。c-fos和c-jun在成人正常組織中低表達，而在許多惡性腫瘤及其癌前病變中出現(xiàn)過度表達[11-12]。提示c-fos和c-jun的激活是細胞由正常狀態(tài)向疾病狀態(tài)轉(zhuǎn)化的一個重要的生物學標志[13]。RT-PCR擴增檢測ERK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun、Collagen Ⅰ mRNA研究結(jié)果提示，PDGF/ERK1/2信號通路被激活，CPhGs可能通過阻斷PDGF/ERK信號通路中ERK1/2、c-fos、c-jun、α-SMA、Collagen Ⅰ mRNA表達而起到治療肝纖維化的作用。所以rrPDGF-BB作為一種損傷因素參與到肝纖維化的過程中，防治肝纖維化的重要途徑之一是阻斷rrPDGF-BB對HSC的生物學作用。

Fig 3　Effects of CPhGs on protein expression of ERK1/2,p-ERK1/2 and Collagen Ⅰ in HSC

A:ERK1/2protein level；B:p-ERK1/2protein level；C:Collagen Ⅰ protein level.*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vsrrPDGF-BB group.1:Normal;2:rrPDGF-BB;3:PC 100 mg·L-1;4:PC 75 mg·L-1;5:PC 50 mg·L-1;6:PC 25 mg·L-1

有研究[14-15]發(fā)現(xiàn)HSC中Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達與ERK1/2有關(guān)，抑制HSC ERK1/2的活化或表達后，Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達將被抑制，ERK1/2的表達隨著肝纖維化的進展而明顯增加，且與α-SMA的分布正相關(guān)[16]。因此以CPhGs作為干預藥物，觀察CPhGs對rrPDGF-BB 刺激的HSC增殖活性、Ⅰ型膠原、ERK1/2與α-SMA 表達的影響，可能成為CPhGs治療肝纖維化的作用靶點。本研究結(jié)果顯示，50～100 mg·L-1濃度的CPhGs，對rrPDGF-BB 刺激的HSC增殖活性具有明顯的抑制作用，除25 mg·L-1濃度的CPhGs對rrPDGF-BB 刺激的HSC ERK1/2mRNA的表達無明顯差異外，其余濃度組的CPhGs ERK1/2及α-SMA mRNA的表達均有明顯抑制作用，對rrPDGF-BB 刺激的HSC ERK1/2、p-ERK1/2和Collagen Ⅰ蛋白表達也具有抑制作用，隨CPhGs濃度的增加抑制作用增強。

肉蓯蓉作為一種名貴的中藥材，在推動新疆特色沙漠產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中具有重要地位；本研究對CPhGs藥物的抗肝纖維化作用及機制進行研究，顯示CPhGs能夠阻斷PDGF介導的HSC的活化及增殖作用，同時抑制膠原纖維蛋白的分泌，這可能是通過CPhGs藥物干擾PDGF/ERK信號級聯(lián)系統(tǒng)的相關(guān)信號分子及其磷酸化水平、抑制PDGF誘導的HSC活化和增殖來實現(xiàn)的。

(致謝:本實驗主要在新疆醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院科技樓6樓細胞室及分子實驗室完成，在此特別感謝實驗室的負責老師及研究生同學的支持與幫助！)

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Effects of phenylethanol glycosides from Cistanche tubulosa on proliferation of rat HSC induced by PDGF-BB and its mechanism

YOU Shu-ping1，ZHAO Jun2，MA Long1，ZHANG Shi-lei1，LIU Tao1

(1.CollegeofPublicHealth，XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2.XinjiangUygurAutonomousRegionInstituteofMateriaMedica,Urumqi830004,China)

AimTo investigate the effect of phenylethanol glycosides from Cistanche tubulosa(CPhGs) on the proliferation and activation of rrPDGF-BB induced HSC and their target points for resisting hepatic fibrosis,to elucidate the molecular mechanism in molecular level, and provide basic data for the further development of new drugs.MethodsHSCs were cultivated by CPhGs with different concentrations(0, 3.91, 7.81, 15.63, 31.25, 62.50, 125.00, 250.00, and 500 mg·L-1) and IC50of CPhGs was determined. CPhGs with different concentrations(25，50，75，100 mg·L-1) were selected, and after the cells were stimulated with rrPDGF-BB, cell proliferation was determined by MTT. ERK1/2,α-SMA, c-fos, c-jun and Collagen I mRNA and Erk1/2,P-Erk1/2and Collagen Ⅰ protein expressions were assayed by RT-PCR and Western blot. ResultsCPhGs of (50～100)mg·L-1concentrations groups could effectively inhibit rrPDGF-BB-mediated proliferation(P<0.05) and CPhGs of(25～100)mg·L-1concentrations groups had no significant cytotoxicity(P>0.05). CPhGs of(25～100)mg·L-1concentrations groups could inhibit ERK1/2,α-SMA,c-fos, c-jun and Collagen Ⅰ mRNA levels, and also obviously inhibited Erk1/2,P-Erk1/2and Collagen Ⅰ protein expression on HSC.ConclusionsCPhGs has the protective effect against hepatic fibrosis. The mechanism of this process may involve the interference with PDGF/ERK1/2 signaling pathway and inhibiting the activation and proliferation of HSC.

phenylethanol glycosides from Cistanche tubulosa; platelet derived growth factor; hepatic stellate cells; hepatic fibrosis; cell proliferation;signaling pathway;mechanism

2016-05-31,

2016-06-27

國家自然科學基金項目(No 81260624)

由淑萍(1979-)，女，博士生，副教授，研究方向：食品毒理學，E-mail：youshupin@163.com；

劉濤(1974-)，女，博士，教授，研究方向：新疆特色藥食兼用植物的作用及其機制研究，通訊作者，E-mail：xjmult@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.009

A

1001-1978(2016)09-1231-05

R-332；R284.1；R322.47；R329.24；R575.202.2；R977.6

網(wǎng)絡出版時間：2016-8-23 14:29:00網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.018.html