林嘉成　馮思欣++班俊峰++陳燕忠++謝清春++刁艷玲　呂竹芬

[摘要]目的篩選黃芪粗提多糖除蛋白的最優(yōu)工藝條件。方法通過(guò)一系列因素的考察，以蛋白脫除率和多糖保留率為指標(biāo)，考察離子交換樹(shù)脂對(duì)黃芪粗多糖除蛋白的最優(yōu)工藝，并采用吸附等溫線對(duì)蛋白的脫除效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果經(jīng)篩選，D152陽(yáng)離子交換樹(shù)脂具有較好的蛋白脫除效率，且對(duì)多糖含量影響較小，其蛋白脫除率和多糖保留率分別為68.5%和97.3%，D152樹(shù)脂對(duì)蛋白質(zhì)的吸附呈單分子層吸附，其最大吸附量g_o為16.50mg/g。結(jié)論D152陽(yáng)離子交換樹(shù)脂適用于黃芪粗多糖的除蛋白，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]離子交換樹(shù)脂法；黃芪多糖；除蛋白

[中圖分類號(hào)]R286.0

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]2095-0616（2016）03-64-04

來(lái)源于植物提取液中的多糖，為醛糖或酮糖經(jīng)脫水形成苷鍵后以線性或分枝鏈接而成的鏈狀聚合物。近年研究發(fā)現(xiàn)，多糖除為機(jī)體儲(chǔ)存能量提供物質(zhì)外，還具有多種生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，提取純化過(guò)程影響多糖的生理功能。多糖提取液中的蛋白質(zhì)為水溶性雜質(zhì)，常以游離態(tài)或與多糖形成糖蛋白復(fù)合物等形態(tài)存在，因此，高效去除蛋白質(zhì)保留多糖活性，是目前多糖純化技術(shù)的難點(diǎn)。

文獻(xiàn)報(bào)道多糖提取液脫蛋白的方法主要有化學(xué)法、物理法和生物法，其中化學(xué)法除蛋白效率較高，但其操作需嚴(yán)格控制反應(yīng)條件、步驟繁瑣造成多糖損失嚴(yán)重，反應(yīng)過(guò)程中有機(jī)物的添加易引入新雜質(zhì)和重金屬污染；生物法雖能更好解決化學(xué)法除蛋白中易損傷糖蛋白的問(wèn)題，但其酶催化水解蛋白的專屬性較強(qiáng)，常發(fā)生蛋白脫除效果不好的現(xiàn)象。反復(fù)凍融、離子樹(shù)脂交換、徑向流動(dòng)色譜等物理方法以其條件溫和不改變化合物性質(zhì)、成本低、可循環(huán)利用、安全且操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)逐漸成為純化研究的熱點(diǎn)。

黃芪多糖是黃芪發(fā)揮抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病毒、防治糖尿病、抗氧化和改善腦缺血等生物活性的主要有效成分。在前期研究基礎(chǔ)上，筆者發(fā)現(xiàn)蛋白是影響黃芪多糖純度和生物學(xué)功能的主要雜質(zhì)，本研究采用離子交換樹(shù)脂法對(duì)黃芪多糖提取液中蛋白質(zhì)的脫除工藝進(jìn)行研究，以期為提高多糖品質(zhì)提供依據(jù)。

1.材料與方法

1.1材料與儀器

材料：黃芪（廣州致信藥業(yè)有限公司，批號(hào)2903070），牛血清白蛋白（上海伯奧生物科技有限公司，批號(hào)040112），無(wú)水葡萄糖（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20090618），考馬斯亮蘭G-250（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號(hào)120220），重蒸苯酚（廣州試劑有限公司，自制），D152大孔弱酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（天津興南允能高分子技術(shù)有限公司），D001大孔強(qiáng)酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、D113大孔弱酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、D900弱酸陰離子交換樹(shù)脂、717強(qiáng)堿陰離子交換樹(shù)脂和732強(qiáng)酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）。

儀器：BS224S型電子天平，CP225D型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。UVll01型紫外一可見(jiàn)分光光度儀[天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司]，KQ-300DA型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），AutoScience SWB-2000型恒溫水浴搖床（天津奧特賽恩斯儀器有限公司），JulaboTw-20水浴鍋（優(yōu)萊博技術(shù)有限公司），RE52-05型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），LXJ-ⅡB型低速大容量多管離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1黃芪多糖提取液的制備稱取一定量經(jīng)脫脂的黃芪藥材，以水為提取溶劑，料液比為1：15，于90℃水浴，溫浸提取3h，過(guò)濾，濾渣按上述重復(fù)操作，共提取3次；合并提取液，減壓濃縮后，加入3倍量乙醇，靜置12h，濾過(guò)得到粗多糖，用乙醇洗滌至無(wú)色，以水按一定比例稀釋制得不同濃度的黃芪多糖液。

1.2.2多糖保留率的測(cè)定采用苯酚一硫酸法，以無(wú)水葡萄糖為對(duì)照品，按保留率=C_{前/C后=×100%（式中C前、C后分別為樹(shù)脂吸附前后樣品多糖含量）測(cè)定黃芪粗多糖中的保留率。}

1.2.3蛋白脫除率的測(cè)定蛋白質(zhì)采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，按脫除率（%）=（C_{前-C后）×100C前（式中C前、C后分別為脫色前和脫色后蛋白質(zhì)的濃度）測(cè)定蛋白的脫除率。}

1.2.4離子交換樹(shù)脂的篩選選擇不同交換基團(tuán)的6種樹(shù)脂，考察其對(duì)多糖和蛋白質(zhì)吸附量和吸附率。參照文獻(xiàn)所述方法對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理，分別稱取樹(shù)脂D152，D113，D001，D900，732，717各2.5g于lOOmL具塞錐形瓶中，分別加入黃芪多糖液50mL，置于恒溫水浴搖床中，25℃，100r/min振蕩12h，使之吸附完全，測(cè)定多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率。

1.2.5吸附時(shí)間對(duì)蛋白脫除率的影響稱取預(yù)處理后的樹(shù)脂2.5g于lOOmL具塞錐形瓶，加入黃芪多糖液50mL，按靜態(tài)吸附試驗(yàn)方法，恒溫振蕩數(shù)小時(shí)，分別于0，10，20，40，60，90，120，180，240，300，360min取樣，過(guò)濾并收集濾液，并測(cè)定多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率。

1.2.6pH值對(duì)蛋白脫除率的影響稱取預(yù)處理后的樹(shù)脂2.5g于100mL具塞錐形瓶，分別加入不同pH值的黃芪多糖液50mL，按靜態(tài)吸附試驗(yàn)方法，恒溫振蕩3h，過(guò)濾并收集濾液，并測(cè)定多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率。

1.2.7多糖液濃度對(duì)蛋白脫除率的影響稱取預(yù)處理后的樹(shù)脂2.5g于100mL錐形瓶，分別加入不同.濃度（4.38，9.38，13.42，18.67，22.84，28.53mg/mL）的黃芪多糖液50mL，按靜態(tài)吸附試驗(yàn)方法，恒溫振蕩3h，過(guò)濾并收集濾液，并測(cè)定多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次并平行取樣，數(shù)據(jù)分析均采用SPSSl7.0進(jìn)行處理。

2.結(jié)果

2.1離子樹(shù)脂的篩選結(jié)果

2.1.1樹(shù)脂種類的篩選結(jié)果如圖1所示，6種樹(shù)脂的蛋白脫除率由高到低依次為732，D152，D113，D001，D900，717，其中陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的脫蛋白能力優(yōu)于陰離子交換樹(shù)脂，提示黃芪多糖提取液中的蛋白質(zhì)可能以帶正電荷居多。732樹(shù)脂對(duì)黃芪多糖提取液表現(xiàn)出最佳蛋白脫除率但多糖損失率也最為嚴(yán)重。而其中D152樹(shù)脂脫蛋白綜合性能最好，蛋白脫除率和多糖保留率分別為64.94%、97.33%，故選用D152陽(yáng)離子樹(shù)脂進(jìn)行研究。

2.1.2吸附時(shí)間對(duì)D1 52樹(shù)脂吸附效果的影響 由圖2所示，隨著吸附時(shí)間的增加，樹(shù)脂對(duì)蛋白質(zhì)的吸附量逐漸增加，前120min樹(shù)脂對(duì)蛋白質(zhì)的吸附量隨時(shí)間增加得較快，120min后吸附量增加緩慢，達(dá)到180min后，蛋白的吸附增加量基本趨于平緩，故選擇180min為樹(shù)脂的吸附終點(diǎn)。

2.1.3 pH對(duì)D1 52樹(shù)脂吸附效果的影響 如圖3所示，在實(shí)驗(yàn)pH值范圍內(nèi)，隨著黃芪多糖液pH的增加，多糖保留率均比較高且無(wú)明顯變化，而蛋白脫除率整體呈下降趨勢(shì)，其中在酸性條件下變化趨于平緩，在堿性條件下降趨勢(shì)明顯。D152樹(shù)脂是弱酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，蛋白質(zhì)為兩性分子，在低于其等電點(diǎn)pH條件下呈陽(yáng)離子狀態(tài)，更容易被吸附，符合實(shí)驗(yàn)結(jié)果。黃芪多糖液pH約為7.3，為了減少工藝步驟，故選擇直接使用黃芪多糖液進(jìn)行脫蛋白，即不需要調(diào)節(jié)pH值。

2.1.4黃芪多糖溶液濃度對(duì)D1 52樹(shù)脂吸附效果的影響 如圖4所示，隨著黃芪多糖液濃度的增加，樹(shù)脂對(duì)蛋白質(zhì)的吸附量逐漸減少，濃度達(dá)到18.67mg/mL之后有明顯的下降趨勢(shì)；多糖保留率隨著多糖液濃度的增加，變化不大。表明多糖液濃度對(duì)其影響不大，多糖液濃度的增加有利于后續(xù)工藝的操作，最終選擇9.38mg/mL為多糖液除蛋白濃度。

2.2離子交換樹(shù)脂的吸附等溫曲線

在黃芪多糖提取液中，蛋白呈離子狀態(tài)，大孔離子交換樹(shù)脂對(duì)蛋白的脫除是離子交換與吸附過(guò)程，且主要是以吸附為主的過(guò)程。根據(jù)下式可以計(jì)算出樹(shù)脂平衡吸附量q（mg/g樹(shù)脂）：g=V₀（c₀-c）/G，式中：V₀為黃芪溶液體積mL；c₀為黃芪多糖液的初始蛋白濃度，mg/mL；c為黃芪多糖液中蛋白的平衡濃度，mg/mL；G為樹(shù)脂重，g。以平衡吸附量為縱坐標(biāo)，平衡濃度為橫坐標(biāo)，繪制出吸附等溫線，如圖5所示。

分別采用Langmuir和Freundlich吸附等溫式對(duì)吸附等溫線數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果見(jiàn)表1，由相關(guān)系數(shù)可以看出，Langmuir方程較Freundlich等溫方程更優(yōu)于描述D152樹(shù)脂對(duì)多糖溶液中蛋白質(zhì)的吸附規(guī)律。根據(jù)Langmuir曲線模型可推測(cè)D152樹(shù)脂對(duì)蛋白質(zhì)的吸附呈單分子層吸附，其最大吸附量q₀為16.50mg/g。根據(jù)Freundlich擬合方程，由n>1可知D152樹(shù)脂對(duì)蛋白質(zhì)的吸附為優(yōu)惠吸附，說(shuō)明D152樹(shù)脂對(duì)蛋白質(zhì)的吸附容易進(jìn)行。

2.3黃芪多糖液的除蛋白工藝驗(yàn)證

離子交換樹(shù)脂法脫除黃芪多糖中蛋白質(zhì)的最優(yōu)工藝為：采用D152大孔弱酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，樹(shù)脂處理濃度為9.38 mg/mL，處理量為50mL/g樹(shù)脂，在室溫下吸附3h，蛋白脫除率和多糖保留率分別為68.5%和97.3%。

3.討論

離子交換樹(shù)脂具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、使用分離簡(jiǎn)單、分離速度快和再生簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，本研究對(duì)其脫除黃芪多糖提取液中蛋白質(zhì)，保留多糖的工藝進(jìn)行考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，D152型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂可有效保留提取液中的多糖，但其脫蛋白作用并不完全有效?？梢?jiàn)單一使用物理方法難以獲得組分單一的植物多糖，將兩種或多種化學(xué)或生物方法有機(jī)結(jié)合，充分利用每種純化方法的優(yōu)勢(shì)，可能對(duì)多糖的完全純化更為有效。本研究確定的樹(shù)脂吸附最佳參數(shù)，可最大程度保存多糖生物活性，為黃芪多糖在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。