何　丹，張　旭，陳柳君，胡晨熙，沈　瑩，倪伶俐，吳明江

（溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江溫州　325035）

正交試驗(yàn)優(yōu)選褐藻糖膠的提取工藝

何丹，張旭，陳柳君，胡晨熙，沈瑩，倪伶俐，吳明江

（溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江溫州325035）

采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選羊棲菜褐藻糖膠的提取工藝，以褐藻糖膠的收率為考察指標(biāo)，研究提取溫度、酸濃度和提取時間對其產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明影響收率因素依次為：提取溫度＞酸濃度＞提取時間，優(yōu)選提取工藝為提取溫度為50℃，酸濃度為2 mol/L，提取時間為3 h。并且對樣品進(jìn)行了理化性質(zhì)的分析，包括單糖組成、分子量和紅外圖譜。該方法操作簡便，得到分子量范圍為7 100～133 800 Da的褐藻糖膠，收率最高為8.9%，單糖組成穩(wěn)定，硫酸根含量高。

正交試驗(yàn)；羊棲菜；褐藻糖膠；提取工藝

羊棲菜Sargassum fusiforme是歷史悠久、分布廣泛、產(chǎn)量高的大型海藻；它具有較高的食用價值和藥用價值［1］。褐藻糖膠是一種含有硫酸根的水溶性多聚糖，具有廣譜的生物活性，如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、病原體抑制劑、抗腫瘤、抗炎、抗血栓等，引起許多學(xué)者的深入研究［2-3］。已報道對于褐藻糖膠的提取方法有很多，包括水提法、酸提法、酶解法、超聲波提取法等［4］，但是其中方法相對簡便、成本較低的是水提法和酸提法，然而水提法得率較低，產(chǎn)物雜質(zhì)多，增加了分離純化步驟難度；酸提法會對褐藻糖膠的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。已有文獻(xiàn)報道羊棲菜褐藻糖膠的提取率為3.78%，巖藻糖為5.69%，總糖含量33.92%，硫酸根15.86%，忽略了樣品理化性質(zhì)的鑒定［12］。為了提高褐藻糖膠得率，保留硫酸根等活性基團(tuán)，本實(shí)驗(yàn)通過提取溫度、酸濃度和提取時間設(shè)計正交試驗(yàn)優(yōu)選鹽酸法提取羊棲菜褐藻糖膠的條件，并且同時對所有樣品的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，包括單糖組成、分子量、硫酸根含量和樣品的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)為褐藻糖膠的進(jìn)一步分離純化、活性研究奠定基礎(chǔ)，也為相關(guān)羊棲菜高端產(chǎn)品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

羊棲菜：浙江省洞頭縣羊棲菜養(yǎng)殖地提供。

D-葡萄糖醛酸，sigma；右旋糖酐標(biāo)樣，D-甘露糖，D-木糖，中國藥品生物制品鑒定所；L-鼠李糖，D-半乳糖醛酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D-葡萄糖，TCI；D-半乳糖，L-阿拉伯糖，Dr.Ehrenstorfer GmbH；L-巖藻糖，F(xiàn)lukaBioChemika等。

1.2儀器

1525高效液相色譜儀，Waters科技有限公司；TENSOR27紅外光譜儀，Bruker光譜儀器公司；Milli-Q超純水儀，MILLIPORE公司；ODS-2HYPERSIL色譜柱，Thermo Scienfic；TSK gel G-3000PWXL-CP色譜柱，日本TOSOH公司；SCANVAC真空低溫冷凍干燥機(jī)，Labogene ApS等。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1羊棲菜褐藻糖膠的提取工藝

選取干燥的羊棲菜粉碎成粉，按照羊棲菜藻粉（m）：95%乙醇（v）=1：5的料液比回流脫脂，得到脫脂藻粉。按照脫脂藻粉（m）：鹽酸（v）=1：30的料液比，得到羊棲菜粗多糖溶液，用氫氧化鈉中和，濃縮，加入適量4 mol/L氯化鈣沉淀褐藻膠，離心，上清液經(jīng)3 000 Da透析袋透析，濃縮，按照濃縮液（v）：95%乙醇（v）=1：4的比例加入乙醇，攪拌混勻，4℃放置12 h，離心，收集沉淀并復(fù)溶于蒸餾水中，低溫減壓干燥，得到羊棲菜褐藻糖膠，因素-水平表見表1所示。

表1　正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1　Factor and levels for orthogonal array design

1.3.2單糖組成分析

應(yīng)用PMP衍生化及高效液相色譜法測定其組成和含量［5］。樣品加入2 mol/L三氟乙酸120℃水解1 h。標(biāo)準(zhǔn)對照品（其中包括葡萄糖、半乳糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸）水解樣品經(jīng)PMP衍生化后進(jìn)行HPLC分析，利用Thermo Hypersil ODS-2色譜柱（4.6×250mm）和Waters HPLC系統(tǒng)（1525泵，2487雙波長紫外可見檢測器，717自動進(jìn)樣器）進(jìn)行測定，流動相PBS：乙腈=83：17，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，檢測波長為254 nm。

1.3.3分子量測定

應(yīng)用高效凝膠滲透色譜法測定其分子量［6］。標(biāo)準(zhǔn)對照品為右旋糖苷（其中分子量分別是180、7 100、21 400、41 100、133 800、2 000 000 Da）。利用TSK gel G-3000PWXL-CP色譜柱 （7.8×300mm）和Waters HPLC系統(tǒng)（1525泵，2414示差折光檢測器，717自動進(jìn)樣器）進(jìn)行測定，流動相為0.1 mol/L硫酸鈉溶液，流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.4紅外光譜分析

應(yīng)用FT-IR法分析多糖的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)［7］。取少量干燥樣品，加入適量KBr粉末在紅外干燥箱中充分研磨，壓片，在4000～500cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描。

1.3.5總糖含量測定

應(yīng)用苯酚硫酸法測定總糖含量［8］。以L-Fuc為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，多糖樣品溶液濃度為0.1 g/L進(jìn)行測定。

1.3.6硫酸根含量測定

應(yīng)用離子色譜法進(jìn)行硫酸根含量測定［9］。用1 mol/L鹽酸100℃水解3 h，氫氧化鈉中和后，選用Shodex IC-52 4E柱（4.0×250mm），以4.5 mmol/L碳酸鈉和0.8 mmol/L碳酸氫鈉為流動相，流速為0.8 mL/min。

2　結(jié)果分析

2.1正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表2中正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果可知，極差的結(jié)果為RX＞RY＞RZ，影響羊棲菜褐藻糖膠提取率的影響大小為提取溫度（X）＞酸濃度（Y）＞提取時間（Z），由此得出最佳提取工藝為X2Y3Z3，即提取溫度為50℃，酸濃度為2 mol/L，提取時間為3 h。由表3結(jié)果表明：提取溫度，酸濃度，提取時間對以鹽酸為介質(zhì)的褐藻糖膠提取收率無顯著影響。

表2　正交試驗(yàn)設(shè)計表及結(jié)果Tab.2　Design and result of orthogonal test

表3　方差分析表Tab.3　Analysis of variance table

2.2總糖含量和硫酸根含量結(jié)果分析

由表4結(jié)果可知：9組樣品的總糖含量相近（除I樣品偏低），但A-F樣品硫酸根含量相近，G-I樣品硫酸根含量低，說明硫酸根在25℃和50℃的提取溫度下未受影響，然而在100℃的條件下硫酸根含量大幅度降低，說明在高溫下，硫酸根會被大量水解，提取硫酸化多糖時溫度不能過高。

表4　樣品的總糖含量和硫酸根含量Tab.4 Total sugar content and sulfate content of the sample

2.3單糖結(jié)果分析

對樣品單糖分析的結(jié)果見表5，以標(biāo)準(zhǔn)品為參照，根據(jù)保留時間判定樣品中都是由L-Fuc、D-Glc、DGal、GulA、D-Man、ManA、Rha、GlcA這8種單糖組成，GulA和ManA是根據(jù)已報道的文獻(xiàn)判定［10］。其中AF樣品中單糖比例相接近，主要由L-Fuc、D-Glc和D-Gal組成，屬于典型的褐藻糖膠，而G和H樣品主要由GulA和ManA組成；I樣品主要由GulA、ManA、L-Fuc組成。A～F組單糖比例相接近，G-I樣品與A-F樣品比較，L-Fuc、D-Gal等中性糖比例相差很大，由于100℃時溫度過高，中性糖被大量水解，但組成單糖種類不變。

2.4分子量分析結(jié)果

如圖1相對分子質(zhì)量分布色譜圖所示，9個組合中，A-F樣品的相對分子量在7 100～138 800 Da范圍內(nèi)，G-I樣品的相對分子量在180～7 100 Da范圍內(nèi)。從圖中可知A-F這6個樣品，分子量在25℃和50℃中影響不大，然而在100℃時，色譜峰整體向右移，大分子多糖被大量水解，從G-I樣品圖中可知，在100℃時，色譜峰面積隨著酸濃度增加而變小，逐漸水解為小分子量多糖。

表5　樣品的單糖組成Tab.5　The monosaccharide composition of the sample

圖1　樣品的分子量Fig.1 The molecular weight of the sample

2.5紅外分析結(jié)果

將得到9個組合的樣品進(jìn)行紅外圖譜掃描，結(jié)果如圖2所示，圖譜中在3 410～3 440cm-1處都有強(qiáng)的-OH鍵的伸縮振動，該處為多糖類物質(zhì)的特征吸收；在2 920～2 930cm-1和2 852cm-1處有C-H的伸縮振動；在1 600～1 630cm-1附近有羰基非對稱伸縮振動、酰胺基N-H變角振動；在1 430cm-1附近的吸收為糖類中CH變角振動；在1 030～1 050cm-1處為吡喃環(huán)中C-O-C伸縮振動；在1 250cm-1處有硫酸根的S=O的對稱伸縮振動，樣品A、B、E在830cm-1處吸收較弱，其中E樣品為C-O-S的伸縮振動（軸向配位）而樣品C、D、F在830cm-1處吸收較強(qiáng)，這一處是α-糖苷鍵的特征吸收，也是C-O-S的振動位置，碳架構(gòu)型可能是α-吡喃糖；樣品G、H、I在880cm-1附近有較弱吸收峰，該處是β-糖苷鍵的特征吸收，碳架構(gòu)型可能是β-D-吡喃糖；樣品G、H都在815cm-1附近有較弱的吸收為C-O-S的伸縮振動（赤道配位），是在580～620cm-1處有顯著的O-S-O非對稱變形吸收。證實(shí)A-I樣品中A-F樣品都含有大量的硫酸根，而G～I(xiàn)樣品有較少的硫酸根。

圖2　樣品的紅外光譜分析Fig.2　The infrared spectrum analysis of the sample

3　結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，以鹽酸為介質(zhì)提取羊棲菜褐藻糖膠的工藝中，影響收率因素依次為：提取溫度＞酸濃度＞提取時間。綜合上述結(jié)果表明優(yōu)選提取工藝為提取溫度為50℃，酸濃度為2 mol/L，提取時間為3 h。根據(jù)已報道的提取率比較［11-12］，本文篩選的提取工藝得到的褐藻糖膠提取率較高；提取的褐藻糖膠硫酸根含量高，已有文獻(xiàn)報道硫酸根含量高的多糖活性較好［13-14］。此方法提取的褐藻糖膠主要由L-Fuc，D-Glc和D-Gal組成，分子量在7 100～138 800 Da范圍內(nèi)的雜多糖，進(jìn)一步推測我們得到褐藻糖膠的生物活性較好；該方法操作簡便，成本較低，是一種比較理想的提取方法。

［1］過菲，許時嬰.羊棲菜粗多糖的提取研究［J］.食品工業(yè)，2002（3）：11-13.

［2］FITTON J H，STRINGER D N，KARPINIEC S S.Therapies from Fucoidan：An Update［J］.Marine drugs，2015，13（9）：5 920-5 946.

［3］KLETTNER A.Fucoidan as a Potential Therapeutic for Major Blinding Diseases-A Hypothesis［J］.Marine drugs，2016，14（2）：1-13.

［4］丁浩淼，謝作亮，謝琰，等.羊棲菜活性多糖的提取與生物活性研究進(jìn)展［J］.藥物生物技術(shù)，2015，22（4）：369-372.

［5］馬定遠(yuǎn)，陳君，李萍，等.柱前衍生化高效液相色譜法分析多糖中的單糖組成［J］.分析化學(xué)，2002，30（6）：702-705.

［6］徐曉霞，李炎，劉華，等.高效凝膠色譜法測定多花黃精多糖分子量與分子量分布［J］.四川生理科學(xué)雜志，2008（3）：102-103.

［7］徐燕，朱科學(xué)，錢海峰，等.桃膠多糖的提取分離及組成性質(zhì)研究［J］.食品工業(yè)科技，2008，29（1）：66-71.

［8］郭雷，呂明生，王淑軍，等.苯酚-硫酸法測定櫻桃酒中總糖［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31（6）：130-132.

［9］張麗萍，王月秋，姜世成，等.離子色譜法測定高山紅景天多糖硫酸酯中硫酸根含量的研究［J］.分子科學(xué)學(xué)報，2000，16（3）：161-164.

［10］王金霞，趙峽，于廣利，等.柱前衍生高效液相色譜法分析海洋褐藻多糖藥物的糖醛酸組成［J］.分析化學(xué)，2009，37（5）：648-652.

［11］張銳，曾冬云，龔興國，等.羊棲菜多糖的提取工藝研究［J］.中國食品學(xué)報，2006，6（3）：14-18.

［12］張喆邇，劉雪蓮，許劍鋒，等.羊棲菜硫酸多糖的提取工藝與最佳提取條件［J］.食品工業(yè)科技，2008（11）：192-194.

［13］WANG J，GE B，DU C，et al.Sulfated modification promotes the immunomodulatory bioactivities of Lyciumbarbarum polysaccharides in vitro［J］.International journal of clinical and experimental medicine，2015，8（11）：20 380-20 390.

［14］ESTEVES A I，NICOLAI M，HUMANES M，et al.Sulfated polysaccharides in marine sponges：extraction methods and anti-HIV activity［J］.Marine drugs，2011，9（1）：139-153.

Orthogonal Array Design Method of Optimization of Fucoidan Extraction Process

HE Dan，ZHANG Xu，CHEN Liu-jun，et al
（College of Life and Environmental Science，Wenzhou University，Wenzhou325035，China）

The effect of extraction temperature，time and concentration of acid on the yield of fucoidan from Sargassum fusiform was investigated using orthogonal experiment design.The result showed the influence by the parameters decreased in the order of：extraction temperature＞concentration of acid＞extraction time.The optimum conditions of extraction were determined as follows：extraction temperature 50℃，acid concentration 2 mol/L，extraction time 3 hours.And the sample has carried on the analysis of the physical and chemical properties，including the monosaccharide composition，molecular weight，infrared spectrum.This process was convenient and high in yield（8.9%）.The product had the typical characteristics of fucoidan with the molecular weight range from 7 100 Da to 133 800 Da，stable monosaccharide composition and high sulfate content.

orthogonal array design；Sargassum fusiforme；fucoidan；extraction

R284

A

1008-830X（2016）02-0122-05

2015-12-10

國家自然科學(xué)基金（31470430；31200266）

何丹（1990-），女，黑龍江齊齊哈爾人，碩士研究生，研究方向：糖生物學(xué).

吳明江，男，教授，研究方向：糖生物學(xué).Tel：0577-86689078；E-mail：wmj@wzu.edu.cn