溫 騰，曹亞澄，張 珮儀，張金波*（ 南京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院，南京 20023；2 江蘇省物質(zhì)循環(huán)與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 20023；3 江蘇省地理信息資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 20023）

微擴(kuò)散法測(cè)定銨態(tài)氮、硝態(tài)氮的15N穩(wěn)定同位素研究綜述①

溫 騰1，2，3，曹亞澄1，張 珮儀1，張金波1，2，3*
（1 南京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院，南京 210023；2 江蘇省物質(zhì)循環(huán)與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023；3 江蘇省地理信息資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023）

微擴(kuò)散法是測(cè)定氮轉(zhuǎn)化過程中銨態(tài)氮、硝態(tài)氮的15N穩(wěn)定同位素的重要方法。自20世紀(jì)50年代Conway提出微擴(kuò)散法的基本原理后，隨著分析技術(shù)的迅速發(fā)展，微擴(kuò)散法與質(zhì)譜儀測(cè)定技術(shù)相結(jié)合，被廣泛應(yīng)用在環(huán)境、生態(tài)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中土壤、水體等樣品的測(cè)定。雖然微擴(kuò)散法與傳統(tǒng)蒸餾法相比優(yōu)點(diǎn)明顯，但其測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性、精密性仍受氮回收量、同位素分餾、外源性和內(nèi)源性的雜質(zhì)氮污染等因素的影響。如何優(yōu)化擴(kuò)散體系，提高測(cè)定的準(zhǔn)確度是當(dāng)前微擴(kuò)散法應(yīng)用的關(guān)注重點(diǎn)。本文綜述了影響微擴(kuò)散法的多種因素，并總結(jié)了優(yōu)化微擴(kuò)散體系的方法，以期推動(dòng)微擴(kuò)散法在我國(guó)氮素轉(zhuǎn)化研究中的應(yīng)用。

微擴(kuò)散；銨態(tài)氮；硝態(tài)氮；15N

穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)是當(dāng)前環(huán)境、生態(tài)和農(nóng)業(yè)各領(lǐng)域研究中的一項(xiàng)重要技術(shù)。15N穩(wěn)定同位素作為一種示蹤劑，已被廣泛應(yīng)用于陸地和水生態(tài)系統(tǒng)的氮轉(zhuǎn)化研究［1-2］。無機(jī)態(tài)氮作為氮轉(zhuǎn)化過程的重要形態(tài)，其15N豐度的測(cè)定（特別是NH4+和NO3-）尤其重要［3］。目前通用的無機(jī)氮測(cè)定方法是杜馬法（Dumas）：首先從固體或液體樣品中提取出NH4+和NO3-后，在與元素分析儀聯(lián)用的質(zhì)譜儀（EA-IRMS）上經(jīng)過一系列燃燒、氧化和還原過程，將其轉(zhuǎn)化為 N2，最后純化后的 N2經(jīng)質(zhì)譜測(cè)定其15N豐度［4］。如何有效、快速、定量地從樣品中提取NH4+和NO3-是杜馬法的關(guān)鍵步驟。傳統(tǒng)常用的方法是蒸餾法（Kjeldahl distillation），但該法需專門的設(shè)備和熟練的操作人員，操作過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)樣品的氮量要求較高，而且蒸餾過程中易發(fā)生樣品間的交叉污染［5］。近年來，一種通過微擴(kuò)散（micro-diffusion）的方法提取樣品中的NH4+和NO3-被國(guó)外學(xué)者廣泛采用。與蒸餾法相比，該法操作明顯簡(jiǎn)化，樣品制備步驟簡(jiǎn)單，樣品間不易交叉污染，對(duì)氮量要求較低，不但適用于自然豐度的樣品測(cè)試，也適合測(cè)定高15N豐度的示蹤樣品［5-7］，還能避免高溫蒸餾過程中引起的有機(jī)氮分解和同位素分餾。在國(guó)外，微擴(kuò)散法已逐漸替代了傳統(tǒng)的蒸餾法，但在國(guó)內(nèi)該法在15N穩(wěn)定同位素樣品測(cè)定上的應(yīng)用仍很有限。本文將著重圍繞微擴(kuò)散法的基本原理、影響微擴(kuò)散法測(cè)定結(jié)果的主要因素、優(yōu)化微擴(kuò)散法的方法及其在15N穩(wěn)定同位素示蹤和氮轉(zhuǎn)化研究中的應(yīng)用前景幾方面分別介紹。

1 微擴(kuò)散法的基本原理

早在1939年，Conway和Cooke［8-9］就提出了應(yīng)用微擴(kuò)散的方法可定量測(cè)定血液、尿液等樣品中的有機(jī)氮含量，并在1957年進(jìn)一步總結(jié)闡述了微擴(kuò)散法的原理、主要步驟和注意事項(xiàng)。隨后，Brooks等［5］及MacKnown和Van Sanford［10］首次將微擴(kuò)散法應(yīng)用在土壤樣品的15N穩(wěn)定同位素測(cè)定上。在1990—2010年期間，學(xué)者們對(duì)該方法做了一系列的改進(jìn)，不但進(jìn)一步簡(jiǎn)化其操作步驟、縮短操作時(shí)間，而且提高了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，同時(shí)拓寬了該方法的使用范圍，提出了適合不同類型樣品（高豐度或自然豐度樣品，土壤、植株或海水樣品，甚至富含有機(jī)氮的樣品）的微擴(kuò)散方法體系［11-14］。

微擴(kuò)散法是在一個(gè)較小體積的密閉反應(yīng)容器內(nèi)（通常為200 ～ 600 ml），加入一定量的樣品（10 ～ 400 ml）后，通過添加MgO、NaOH等堿性試劑，調(diào)節(jié)樣品溶液的pH為弱堿性，使NH4+轉(zhuǎn)化為NH3，并在其揮發(fā)釋放過程中，被含弱酸性吸收液（硼酸、稀硫酸、KHSO4等）的玻璃纖維或?yàn)V紙（5 ～ 20 mm）所吸收的過程［4-5， 9， 14］。整個(gè)擴(kuò)散過程所需的時(shí)間視具體樣品和擴(kuò)散條件而定，可從若干小時(shí)到10天不等。擴(kuò)散可在常溫下（20 ～ 25℃）靜置進(jìn)行，也可通過加熱或震蕩的方法加速擴(kuò)散過程。對(duì)于NH4+，可在樣品中直接加入MgO等堿性試劑；對(duì)于NO3-，則需要加入戴氏合金（Devarda's alloy）將其還原為NH4+，再進(jìn)行擴(kuò)散。擴(kuò)散完成后，將濾紙片小心取出，在無氨的環(huán)境中干燥后，放入錫杯中包好，通過EA-IRMS測(cè)定濾紙的15N穩(wěn)定同位素比值，即為樣品的15N穩(wěn)定同位素比值。

2 微擴(kuò)散法的主要影響因素

與傳統(tǒng)的蒸餾法相比，微擴(kuò)散法優(yōu)點(diǎn)明顯，但要實(shí)現(xiàn)對(duì)不同類型 （土壤、水體等）、濃度、豐度的樣品中15N穩(wěn)定同位素比值的準(zhǔn)確測(cè)定，需在幾個(gè)方面進(jìn)一步探討和改進(jìn)：①如何提高樣品中的氮回收率，減少擴(kuò)散過程中的同位素分餾？②如何降低擴(kuò)散過程中雜質(zhì)氮的污染，并選擇合適的方法校正？③如何優(yōu)化擴(kuò)散體系，縮短擴(kuò)散所需時(shí)間？

2.1 氮回收量和同位素分餾

在微擴(kuò)散過程中，NH4+在堿性溶液中釋放出NH3，較輕的14N往往會(huì)先于15N揮發(fā)出來，因此在樣品中的氮量無法完全回收的情況下，其產(chǎn)生的同位素分餾效應(yīng)會(huì)造成測(cè)定值低于實(shí)際值。早期有研究指出樣品中的氮量應(yīng)盡量完全回收，以減少同位素分餾造成的誤差［15］。事實(shí)上，要實(shí)現(xiàn)氮量的 100% 回收非常困難。微擴(kuò)散過程是在密閉容器中進(jìn)行，加入堿性試劑后的放熱效應(yīng)，會(huì)在瓶壁和瓶蓋處出現(xiàn)冷凝小水珠，這些小水珠會(huì)和濾紙片競(jìng)爭(zhēng)吸收NH3，降低氮的回收量［7］。那么，氮量回收不完全引起的同位素分餾是否一定對(duì)測(cè)定結(jié)果有顯著影響呢？Jensen［16］發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品中的氮的回收量會(huì)顯著升高，但樣品的15N 豐度并無明顯變化；Stark和Hart［14］在比較懸掛法和擴(kuò)散包法時(shí)發(fā)現(xiàn)，同樣培養(yǎng)條件下懸掛法的氮回收量顯著低于擴(kuò)散包法，但校正后兩種方法得到的15N atom% 值無明顯差異；Sigman等［17］在用擴(kuò)散法測(cè)定海水中硝酸鹽的δ15N值時(shí)也發(fā)現(xiàn)，氮量回收不完全引起同位素分餾的誤差可忽略不計(jì)。擴(kuò)散過程中的同位素分餾，并不一定是氮回收量不完全所致，擴(kuò)散距離長(zhǎng)短、擴(kuò)散速度快慢等因素，也會(huì)產(chǎn)生同位素分餾。因此，在僅需測(cè)定樣品15N豐度的情況下，100% 的氮回收量并非必要。當(dāng)然，過低的氮回收量引起的同位素分餾產(chǎn)生的誤差的確不可小覷，Holmes等［21］運(yùn)用擴(kuò)散法測(cè)定大體積、低氮量的海水樣品中NH4+的δ15N值時(shí)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短、樣品體積變化都會(huì)顯著影響 δ15N值，加長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間或減少樣品體積，都可以提高樣品中的氮回收量，減小測(cè)定值和理論值的差距，因此低氮量的樣品在擴(kuò)散過程中應(yīng)盡量提高其氮回收量，減少同位素分餾效應(yīng)。此外，測(cè)定樣品中總無機(jī)氮的豐度時(shí)，如果樣品中NH4+和NO3-的15N豐度相差較大，由于在擴(kuò)散體系中NH4+是先于NO3-釋放出來，這種情況下氮量回收不完全是會(huì)引起嚴(yán)重的測(cè)定誤差［18］。

對(duì)微擴(kuò)散法的實(shí)際操作略加改進(jìn)，可以有效提高樣品中的氮回收量。由于在一定范圍內(nèi)氮回收量和擴(kuò)散時(shí)間呈正比，延長(zhǎng)擴(kuò)散培養(yǎng)時(shí)間可有效提高氮回收率［7， 14， 16］。選擇對(duì)NH3吸收能力較強(qiáng)的酸性試劑，或增加濾紙上的酸的用量或濃度，也可以有效提高氮回收率。常見的吸收劑有稀硫酸、KHSO4和硼酸，同等體積下（10 μl），2.5 mol/L的KHSO4能吸附350 μg N，而5 mol/L的H2SO4最多可吸附1 400 μg N［5］。使用水或鹽溶液提取植株、土壤等固體樣品的無機(jī)氮時(shí)，含K+的鹽溶液較水溶液更能增加氮回收量，這是因?yàn)樗嵋簳?huì)在濾紙上積累過多水分，水珠的回滴會(huì)損失部分氮［16］。減少 NH3的泄漏也可提高氮回收量，由于 NH4+釋放為 NH3的過程極為迅速，加入MgO等堿性試劑后應(yīng)迅速蓋緊瓶蓋以減少氮的損失；戴氏合金將 NO3-還原為 NH4+的過程產(chǎn)生的 H2會(huì)增加瓶?jī)?nèi)氣壓造成部分 NH3泄漏損失，使得 NO3-的氮回收量往往低于NH4+［7］。目前常見的微擴(kuò)散體系有懸掛法和擴(kuò)散包法，擴(kuò)散包法因加液量大、密封良好、震蕩并倒置培養(yǎng)，可減少漏氣、其他吸收源競(jìng)爭(zhēng)、水分過飽和等造成的氮損失，因此氮回收量高于懸掛法［14］。對(duì)于低氮濃度的樣品，除延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間、加大體積量、使用擴(kuò)散包法等，也可以通過人為增加樣品中的含氮量，來提高氮的回收率［11］。

2.2 雜質(zhì)氮的干擾和校正方法的選擇

除了氮的回收量和同位素分餾效應(yīng)外，外源或內(nèi)源性的雜質(zhì)氮干擾也會(huì)影響微擴(kuò)散法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。外源性的雜質(zhì)氮主要來自于擴(kuò)散過程使用的試劑（KCl、水、戴氏合金、MgO等）、擴(kuò)散器具（濾紙、瓶子等）和大氣環(huán)境中的微量 NH3；內(nèi)源性的雜質(zhì)氮主要是樣品中的可溶性有機(jī)氮（DON）［5-6， 14， 17， 19］。因此，在操作上減少或避免雜質(zhì)氮的干擾，并采用合適的方法校正測(cè)定結(jié)果，有助于提高微擴(kuò)散法的準(zhǔn)確度和精密度。

根據(jù)確定的原材料配比和冷料斗標(biāo)定曲線，確定產(chǎn)量為260T/h時(shí)的冷料斗分表表值，進(jìn)料8～10min，放掉熱料倉(cāng)前3min的料后再取各熱料倉(cāng)的料500～800kg，進(jìn)行級(jí)配篩分、除塵、密度等方面的檢測(cè)和生產(chǎn)配比室內(nèi)調(diào)試工作。

微擴(kuò)散法使用水或 KCl等溶液提取樣品中的無機(jī)氮，添加MgO等堿性試劑調(diào)節(jié)樣品的 pH，對(duì)于NO還需加入戴氏合金將其轉(zhuǎn)化為 NH。但諸多研究表明，KCl、戴氏合金和MgO中都存在不同含量的雜質(zhì)氮。Jensen［16］在50 ml 2 mol/L的KCl溶液中檢出8 μg的氮，張英利等［20］在多個(gè)批次不同品牌的KCl試劑中檢出1.7 ～ 49.1 mg/kg的氮，這些氮多以NH或NO的形態(tài)存在，對(duì)擴(kuò)散法的測(cè)定結(jié)果有直接影響；戴氏合金也含有一定量的雜質(zhì)氮，Stark和Hart［14］在不同廠家不同批次的0.4 g合金中檢出3 ～24 μg N，Sigman等［17］發(fā)現(xiàn)雖然不同品牌不同批次合金的含氮量差異大，但其δ15N值較穩(wěn)定，對(duì)兩個(gè)品牌合金的多次測(cè)定結(jié)果為-7.5‰ ～-6‰；此外，配制溶液的蒸餾水，加入的MgO粉末也可能含有微量的氮。因此，為減少試劑中雜質(zhì)氮的干擾，應(yīng)盡量使用優(yōu)級(jí)純的試劑和不含氮的蒸餾水（如：超純水），對(duì)于KCl、合金和MgO等試劑的用量應(yīng)根據(jù)樣品的具體情況進(jìn)行優(yōu)化，并盡量使用同一廠家同一批次，研磨過篩成較細(xì)的粉末（過 300目篩）以保證其均一性，對(duì)于KCl和MgO可通過高溫灼燒（450 ～ 600℃）減少雜質(zhì)氮，但戴氏合金若高溫加熱反而降低其還原性［17， 21］。

微擴(kuò)散法使用酸化的濾紙吸收樣品中釋放的NH3，玻璃纖維濾紙（glass-fiber filter）和纖維素濾紙（cellulose filter）是常用的兩類濾紙，但玻纖濾紙因燃燒后易在氧化管中熔化累積，已漸漸被纖維素濾紙取代［18］。為減少雜質(zhì)氮的干擾，濾紙一般是無灰級(jí)的定量濾紙，但仍有微量的NH和NO殘留，兩張直徑7 mm的Whatman no. 2 纖維素濾紙上可檢出約0.16 μg N。通過石英水水洗后高溫烘干的方法，可除去濾紙上的雜質(zhì)氮［7， 14］。

與蒸餾法相比，為減少樣品間的交叉污染，微擴(kuò)散法通常使用一次性的容器。如果不能使用一次性容器，則需徹底清洗以防止器皿上殘留氮對(duì)樣品的污染。通常玻璃類的器皿，建議使用0.2 mol/L H2SO4浸泡過夜后，自來水反復(fù)沖洗、蒸餾水潤(rùn)洗后烘干；塑料類和不銹鋼類器皿建議使用 0.05 mol/L 新鮮配制的KOH浸泡過夜后，水洗烘干；為混勻擴(kuò)散體系而加入的玻璃珠也需事先經(jīng)過酸洗；取用濾紙的鑷子，每次夾取前需依次浸入0.1 mol/L H2SO4和超純水并干燥后方可使用［6， 19］。微擴(kuò)散的操作應(yīng)在無水乙醇擦拭過的干凈鋁箔紙上進(jìn)行，并使用潔凈的一次性手套。

大氣環(huán)境中也含有極微量的NH3，可能干擾樣品的測(cè)定。因此，整個(gè)微擴(kuò)散操作過程應(yīng)盡量在無NH3的環(huán)境下進(jìn)行。在濾紙上滴加酸性溶液后，應(yīng)減少其暴露在大氣中的時(shí)間，盡快轉(zhuǎn)入擴(kuò)散培養(yǎng)瓶中［4］。已吸收了樣品所釋放的NH3的濾紙片，應(yīng)在無NH3的環(huán)境下干燥（盛有濃硫酸的真空干燥器或冷凍干燥）后再包樣。

內(nèi)源性雜質(zhì)氮的主要來源是樣品中的可溶性有機(jī)氮（如：葡萄糖胺、氨基酸等）。在高 pH、較高溫度下進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)散培養(yǎng)，樣品中可溶性有機(jī)氮會(huì)降解為 NH3，直接干擾測(cè)定［17］。Mulvaney和 Khan［22］在不同擴(kuò)散培養(yǎng)時(shí)間對(duì)有機(jī)氮含量較高的土壤取樣發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品的15N豐度先升高，漸趨向平穩(wěn)后又逐漸下降，推測(cè)是樣品中的可溶性有機(jī)氮降解為NH3稀釋了樣品的實(shí)際豐度。Holmes等［21］發(fā)現(xiàn)擴(kuò)散培養(yǎng)溫度過高（≥50℃）會(huì)促進(jìn)樣品中的DON分解，Sigman等［17］還發(fā)現(xiàn)加入過多的MgO或戴氏合金，也會(huì)促進(jìn)DON分解。因此，對(duì)于有機(jī)氮含量較高的樣品，應(yīng)優(yōu)化擴(kuò)散體系，MgO、戴氏合金用量適度，并盡量在室溫下培養(yǎng)，樣品體積也不宜過多以縮短完成擴(kuò)散所需的時(shí)間，還可增加提取液中的鹽濃度（如：4 mol/L KCl）或增加酸的用量或濃度來加速擴(kuò)散［17， 22］。此外，樣品中的DON可通過離子交換樹脂去除；對(duì)于僅測(cè)定 NO的樣品，可通過加入茚三酮將氨基氮轉(zhuǎn)化為NH3，也可加入一定量MgO后，在 65℃下預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間以除去樣品中的有機(jī)氮［17］。

要準(zhǔn)確測(cè)定樣品中15N的豐度，除了在操作上盡量減少外源、內(nèi)源雜質(zhì)氮的干擾外，可通過設(shè)置空白對(duì)照，并選用合適的方法校正測(cè)定結(jié)果?？瞻讓?duì)照一般為不添加樣品的提取液，在相同條件下擴(kuò)散培養(yǎng)，估測(cè)體系中的雜質(zhì)氮量。一般選用公式（1）進(jìn)行校正［14， 23］：

式中：Mstd是標(biāo)準(zhǔn)樣品的已知含氮量；Estd是通過將標(biāo)準(zhǔn)樣品直接滴加在酸化濾紙上，測(cè)定得到的15N豐度，即非擴(kuò)散條件下標(biāo)樣的15N豐度；Em是擴(kuò)散條件下標(biāo)樣的15N豐度；Eb是空白對(duì)照的15N值（假定為0.366 3 atom%）。再將計(jì)算得到的空白氮量Mb代入公式（3），就得到校正后的樣品15N豐度值Es。

式中：Es為校正后的樣品的 N值；Ms為未擴(kuò)散培養(yǎng)前樣品的含氮量。Stark和Hart［14］建議，原有的校正方法更適合氮量基本 100% 回收的擴(kuò)散體系，而在氮量回收不完全的擴(kuò)散體系中，使用第二種校正方法更為合適。此外，由于樣品中氮的濃度和豐度可能存在較大的差異，Lory和Russelle［7］建議可配置一系列不同濃度、豐度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線來校正樣品的測(cè)定值，可進(jìn)一步提高準(zhǔn)確度。

2.3 微擴(kuò)散體系的優(yōu)化

與蒸餾法相比，微擴(kuò)散法簡(jiǎn)化了操作流程，也無需特定設(shè)備，但微擴(kuò)散法周期較長(zhǎng)，往往要在常溫下培養(yǎng)5 ～ 10天，長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)可能引起樣品中可溶性有機(jī)氮分解，因此如何加快擴(kuò)散過程、縮短擴(kuò)散所需時(shí)間，一直是備受關(guān)注的問題。一般來說，影響擴(kuò)散速度快慢的主要因素是樣品體積和擴(kuò)散容器的大小形狀，其次培養(yǎng)溫度、pH、溶液中的離子強(qiáng)度（如：K+、Na+、CO、OH-）和操作上的改進(jìn)也會(huì)影響擴(kuò)散速度［7， 9］。

早在1957年，Conway［9］就指出樣品的表面積和體積的比值是決定擴(kuò)散速度快慢的關(guān)鍵。也就是說，同樣體積的樣品置于大容積的培養(yǎng)瓶中擴(kuò)散速度最快；相同體積的培養(yǎng)瓶，直徑大的瓶子擴(kuò)散速度快；相同培養(yǎng)瓶中小體積樣品擴(kuò)散快。低氮濃度的樣品（如：海水樣品）往往需大體積量才能滿足測(cè)定需要，由于大體積的樣品需較長(zhǎng)時(shí)間完成擴(kuò)散，除使用更大體積的培養(yǎng)瓶提高擴(kuò)散速度，還可以預(yù)濃縮提高樣品中氮的濃度，但濃縮倍數(shù)不宜過高，因樣品pH可能隨濃縮而降低，反而不利于擴(kuò)散過程。Sigman等［17］建議海水樣品的濃縮體積應(yīng)為初始體積的 15% ～25%。

升高培養(yǎng)溫度、提高樣品溶液的pH或溶液中的離子強(qiáng)度也會(huì)加快擴(kuò)散進(jìn)程。Khan等［6］通過加熱（45 ～50℃）的方法實(shí)現(xiàn)在1.5 ～ 5 h內(nèi)對(duì)10 ～ 20 ml 含4 mg N土壤提取液的完全擴(kuò)散回收，在5 ～ 8.5 h內(nèi)對(duì)50 ～100 ml 含2 mg N 土壤提取液的擴(kuò)散回收，擴(kuò)散時(shí)間從至少1 天以上縮短為 1 ～ 8 h。但他同時(shí)也指出，培養(yǎng)溫度不宜過高，超過 50℃后雖然擴(kuò)散速度較之前有所提高，但氮回收率下降，超過 55℃后不但氮回收率繼續(xù)減少，擴(kuò)散速度反而下降，這是因?yàn)楦邷禺a(chǎn)生的大量冷凝水可能競(jìng)爭(zhēng)并降低酸吸收 NH3的能力。Sigman等［17］進(jìn)一步指出，過高溫度下樣品內(nèi)的可溶性有機(jī)氮易降解，會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。不同樣品的最適培養(yǎng)溫度差異大，Mulvaney等［19］發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度超過 30℃，土壤樣品的可溶性有機(jī)氮易分解，因此應(yīng)根據(jù)所測(cè)樣品的自身特點(diǎn)篩選最適培養(yǎng)溫度。微擴(kuò)散法需要加入堿性介質(zhì)（如：MgO、NaOH、Na2CO3）調(diào)節(jié)樣品溶液的pH，較高的pH不但可促進(jìn)NH3的釋放擴(kuò)散，還可促進(jìn)NO轉(zhuǎn)化為NH4+［7， 17］。MgO因其堿性溫和最為常用，NaOH的堿性雖強(qiáng)于MgO，但易降解有機(jī)氮，Na2CO3一般用于調(diào)節(jié) pH較低的樣品溶液。加大堿性物質(zhì)的用量可有效提高樣品溶液pH，但有研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)水體樣品的pH至9.7，土壤樣品提取液的pH至10.5后，再升高pH，NO3-轉(zhuǎn)化速度和 NH3擴(kuò)散速度都沒有明顯變化［17］。而且，加入過多的堿性物質(zhì)可能帶入較多雜質(zhì)氮，反而影響測(cè)定結(jié)果。通過添加KCl、K2SO4等鹽溶液也能提高樣品溶液的離子強(qiáng)度，這些鹽離子可通過水合作用結(jié)合水分子，降低其活性，推動(dòng)（4）式向右進(jìn)行，促進(jìn)NH3的釋放［9］。常用幾種鹽溶液的擴(kuò)散速度大致為：水＜1 mol/L KCl= 0.5 mol/L K2SO4＜ 2 mol/L KCl ＜ 4 mol/L KCl［19］。雖然提高樣品溶液的鹽濃度可加快擴(kuò)散，但過高的鹽濃度也會(huì)促進(jìn)可溶性有機(jī)氮降解，而且KCl等試劑中也含有不可忽視的雜質(zhì)氮量。一些其他鹽溶液（如：K2CO3和K2B2O4）雖能促進(jìn)NH3的釋放，也會(huì)增加可溶性有機(jī)氮的干擾，使用前需反復(fù)評(píng)估［25］。

此外，與靜置培養(yǎng)相比，適度的搖床震蕩或攪拌能促進(jìn)擴(kuò)散進(jìn)程，還可以減少壁上的冷凝水附著，增加氮回收量。Lachouani等［26］采用37℃ 下?lián)u培（100 r/min），將擴(kuò)散所需時(shí)間從5天縮短為3天。但若采用懸掛濾紙法擴(kuò)散培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)注意搖床速度不宜過高，否則濺起的樣品溶液易污染濾紙片。由于MgO和戴氏合金幾乎不溶于水，在擴(kuò)散體系中加入玻璃珠，可輔助混勻試劑促進(jìn)擴(kuò)散進(jìn)程。還可在擴(kuò)散體系中放入兩片濾紙片，增加吸收面積，來促進(jìn)擴(kuò)散、增加氮回收率［18］。

綜上所述，不難看出溫度、pH的升高，KCl、戴氏合金等試劑用量的增加是可以加快擴(kuò)散反應(yīng)進(jìn)程，但也可能帶來外源或內(nèi)源性的雜質(zhì)氮干擾。因此，優(yōu)化擴(kuò)散體系不只單純加快速度縮短時(shí)間，而是綜合考慮擴(kuò)散速度、試劑用量、雜質(zhì)氮干擾三方面因素，并根據(jù)樣品的特點(diǎn)選擇最適合的擴(kuò)散培養(yǎng)條件。值得指出的是，目前MgO和戴氏合金的用量通常為0.2 ～0.4 g，對(duì)于大部分樣品，這個(gè)添加量是過量的，由于MgO和戴氏合金中含有一定量的雜質(zhì)氮，可根據(jù)樣品類型酌情減少用量；不同溫度條件下二者的添加量也有區(qū)別，溫度高所需的用量相對(duì)少［17］；但對(duì)于一些有機(jī)氮含量高且成分復(fù)雜的樣品，如：污水、排泄物等，由于樣品中可能存在某些還原性有機(jī)物或金屬螯合物，添加量可能不足，Mulvaney和Khan［22］就發(fā)現(xiàn)需在25℃ 下加入1.5 g戴氏合金，或在45 ～ 50℃下加入0.9 g合金，才能完成對(duì)4 mg 無機(jī)氮的擴(kuò)散回收。

3 微擴(kuò)散法的應(yīng)用前景

在國(guó)外，目前微擴(kuò)散法已基本取代蒸餾法，廣泛用來提取土壤、水等樣品中的NH和NO并測(cè)定其δ15N值或15N豐度。但在國(guó)內(nèi)，微擴(kuò)散法在無機(jī)氮15N穩(wěn)定同位素上的應(yīng)用并不多見，且主要集中在水體樣品的測(cè)定上。肖化云和劉叢強(qiáng)［27］結(jié)合離子交換色層法-微擴(kuò)散法對(duì)地下水的NO的δ15N值分析測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在50℃ 時(shí)擴(kuò)散10天，氮回收率達(dá)95% 以上，且不會(huì)引起氮同位素分餾；胡婧和劉衛(wèi)國(guó)［28］運(yùn)用微擴(kuò)散法測(cè)定了水體中的NH的δ15N值，發(fā)現(xiàn)1.50 mg/L的氯化銨溶液 400 ml，在室溫下擴(kuò)散 14 天，氮回收率＞95% 且不產(chǎn)生氮同位素分餾；并進(jìn)一步將其用于研究水體中無機(jī)氮的污染來源［29-31］；孫建飛等［32］將微擴(kuò)散法應(yīng)用于土壤15N示蹤試驗(yàn)中NH和NO的測(cè)定，提出適用于豐度和含氮量變化較大的示蹤樣品的微擴(kuò)散體系；Zhang等［24］將微擴(kuò)散法與其他方法相結(jié)合，提出了適用更小體積（5 ～ 10 ml）、更低NH濃度（15 ～ 60 μmol/L）樣品的15N測(cè)定方法?？紤]到蒸餾法存在的局限性，推廣微擴(kuò)散法的應(yīng)用，不但可簡(jiǎn)化操作，節(jié)約人、物力，更可提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度。

近年來在無機(jī)氮的15N穩(wěn)定同位素測(cè)定上，各種更靈敏的新方法不斷被報(bào)道，例如：通過一系列化學(xué)反應(yīng)將無機(jī)氮（NH、NO、NO）轉(zhuǎn)化為 N2O，測(cè)定其15N豐度的化學(xué)轉(zhuǎn)化法［3， 33］；利用不含N2O還原酶的反硝化菌將NO轉(zhuǎn)化為N2O的反硝化法［34-35］；運(yùn)用鉻和疊氮鈉將自然豐度樣品中的NO轉(zhuǎn)化為N2O的化學(xué)法［36-37］等等。這些方法基本通過將無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為 N2O氣體，在與微量預(yù)濃縮裝置聯(lián)用的質(zhì)譜儀上測(cè)定 N2O中的氮、氧同位素比值。雖然這些方法的靈敏度顯著優(yōu)于微擴(kuò)散法，但樣品的預(yù)處理往往較為繁瑣，涉及微生物的培養(yǎng)和大量試劑的配制，有些反應(yīng)還會(huì)生成劇毒的中間產(chǎn)物（如：HN3），而且樣品在質(zhì)譜儀上的測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)（≥30 min），測(cè)定過程需不斷添加液氮，成本較高；而微擴(kuò)散法操作簡(jiǎn)單、安全，樣品是在聯(lián)用元素分析儀的質(zhì)譜儀（EA-IRMS）上測(cè)定，所需測(cè)定時(shí)間短（≤10 min），測(cè)試成本較低，適合大批量樣品測(cè)定。此外，微擴(kuò)散法可與化學(xué)法或反硝化法相結(jié)合，發(fā)展出適合不同類型樣品的更高靈敏度的測(cè)定方法：Zhang等［24］針對(duì)酸性森林土壤的KCl提取液中存在某些還原物質(zhì)，難以用化學(xué)法（BrO-和NH2OH）將NH還原為N2O的問題，將土壤中的NH首先用微擴(kuò)散法釋放出來，再用化學(xué)法將濾紙片上的NH3轉(zhuǎn)化為 N2O，測(cè)試靈敏度達(dá) μmol/L級(jí)別；Lachouani等［26］用微擴(kuò)散法將微量（≥12.4 μmol/L）的NH從土壤中提取出來，再通過反硝化細(xì)菌或化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法將其轉(zhuǎn)化為N2O。由此可見，微擴(kuò)散法作為一種已發(fā)展多年、較為成熟的無機(jī)氮的提取方法，不但適合于示蹤培養(yǎng)試驗(yàn)中大批量樣品的15N豐度測(cè)定，也可與新的方法結(jié)合，發(fā)展出適用自然豐度樣品的更為靈敏的δ15N值的測(cè)試方法，仍是一種極具應(yīng)用潛力的方法。

4 結(jié)論

在銨態(tài)氮、硝態(tài)氮的15N穩(wěn)定同位素測(cè)定上，微擴(kuò)散法已逐漸替代傳統(tǒng)蒸餾法，但其擴(kuò)散過程受氮回收量、雜質(zhì)氮等因素影響。100% 的氮回收率并非必要，但提高氮回收量可減少氮同位素分餾，采用擴(kuò)散包法、適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間、優(yōu)化樣品體積，選擇合適的酸吸收劑和鹽溶液可有效提高氮回收量。外源性（擴(kuò)散試劑、器具和大氣環(huán)境）和內(nèi)源性（樣品的DON）的雜質(zhì)氮會(huì)影響微擴(kuò)散法的結(jié)果準(zhǔn)確性，外源雜質(zhì)氮可通過使用優(yōu)級(jí)純?cè)噭?、?yōu)化其用量、高溫加熱等方法，減少試劑中的雜質(zhì)氮，并充分清潔各種器具以減少氮?dú)埩艉徒徊嫖廴?；?nèi)源雜質(zhì)氮主要是樣品中DON的降解，可通過對(duì)培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、MgO和戴氏合金用量的綜合優(yōu)化，或通過預(yù)處理去除DON，來減少干擾。此外，選擇合適的校正方法也有助于減少雜質(zhì)氮對(duì)測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。最后，擴(kuò)散體系的優(yōu)化不只是加快擴(kuò)散速度、縮短培養(yǎng)時(shí)間，而應(yīng)綜合考慮擴(kuò)散速度、試劑用量、雜質(zhì)氮干擾三方面，根據(jù)樣品的特點(diǎn)選擇最合適的擴(kuò)散培養(yǎng)條件?？偠灾U(kuò)散法較蒸餾法優(yōu)點(diǎn)明顯、前景廣闊，可廣泛應(yīng)用于無機(jī)氮15N穩(wěn)定同位素的測(cè)定，若與其他新方法相結(jié)合，還會(huì)極大地提高測(cè)定方法的靈敏度和準(zhǔn)確度。

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On Progress in Use of Micro-diffusion Method in δ15N-NHand δ15N-NOMeasurements

WEN Teng1，2，3， CAO Yacheng1， ZHANG Peiyi1， ZHANG Jinbo1，2，3*
（1 School of Geography Science， Nanjing Normal University， Nanjing 210023， China； 2 Jiangsu Provincial Key Laboratory of Materials Cycling and Pollution Control， Nanjing 210023， China； 3 Jiangsu Center for Collaborative Innovation in Geographical Information Resource Development and Application， Nanjing 210023， China）

Since Conway first outlined fundamental principles of micro-diffusion technique in 1957， it was then adapted to prepare samples for15N isotope measurements. Currently it has been widely developed for nitrogen isotope measurements on ammonium （NH4+） and nitrate （NO3-） in solid and aqueous samples. Compared with traditional distillation method， micro-diffusion technique is advocated because it eliminates cross contamination and requires less operator skill and time. However， the accuracy and sensitivity of this technique is still limited by some factors， including N recovery， isotopic fractionation and blank size. Another main limitation of micro-diffusion is that the results can't be obtained immediately because diffusion is typically performed for at least one to several days. Thus， how to improve the sensitivity and accuracy of this technique and accelerate the diffusion process have become key research focuses. In this paper， aiming to promote using micro-diffusion technique in research of soil nitrogen transformation， the primary principles and factors impacting this technique were briefly summarized and introduced.

Micro-diffusion； Ammonium； Nitrate；15N

S151.9；S154

10.13758/j.cnki.tr.2016.04.002

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41501254）、江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（15KJB210002）和江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目（164320H116）資助。

（zhangjinbo@njnu.edu.cn）

溫騰（1980—），女，福建莆田人，博士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事穩(wěn)定同位素技術(shù)與土壤氮轉(zhuǎn)化研究。E-mail： wenteng@njnu.edu.cn