姚敬明，孟　帆，王娟萍，吳　忻，劉文俊，樊振華，米瑞娟，薛翼鵬，李紅麗

（山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032）

黃芪多糖對豬瘟疫苗體液免疫和細(xì)胞免疫的影響

姚敬明，孟帆?，王娟萍，吳忻，劉文俊，樊振華，米瑞娟，薛翼鵬，李紅麗

（山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032）

為查明黃芪多糖對豬瘟疫苗體液免疫IgG抗體與豬白細(xì)胞介素-4（IL-4）、豬干擾素-γ（IFN-γ）、豬腫瘤壞死因子α（TNF-α）三種細(xì)胞免疫因子的影響，選用黃芪多糖注射液直接稀釋高效豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）的方法進(jìn)行了免疫試驗。證實了黃芪多糖直接稀釋豬瘟活疫苗不但可以提高豬瘟疫苗IgG抗體水平，還可以提高豬干擾素-γ（IFN-γ）、豬腫瘤壞死因子α（TNF-α）濃度，降低豬白細(xì)胞介素-4（IL-4）濃度，證明在使用豬瘟疫苗免疫防控中添加黃芪多糖可增強(qiáng)豬群免疫力，為控制豬瘟流行提供了依據(jù)。

黃芪多糖；豬瘟疫苗；細(xì)胞免疫；體液免疫

豬瘟（Classical Swine Fever，CSF），是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種以高熱、出血為主要特征的烈性傳染病，近幾年出現(xiàn)了仔豬先天感染、免疫失敗、母豬持續(xù)性感染等現(xiàn)象，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，如何有效預(yù)防和控制豬瘟已成為迫在眉睫的問題，一直以來，在豬瘟防控中，接種疫苗起著至關(guān)重要的作用，目前和以后很長一段時間里，以疫苗免疫為主仍然會是我國豬瘟防控采取的主要策略。王娟萍等2011年對山西省規(guī)?；N豬場進(jìn)行了豬瘟免疫情況調(diào)研，發(fā)現(xiàn)豬瘟免疫抗體在山西規(guī)?；N豬場不理想，而且最差的是保育豬抗體水平。Van Oirschot用中國豬瘟兔化弱毒株免疫豬后，在第一周進(jìn)行攻毒，發(fā)現(xiàn)免疫豬完全可以抵抗強(qiáng)毒的攻擊，因此可以證明在抗豬瘟免疫應(yīng)答的早期階段，

細(xì)胞介導(dǎo)免疫具有重要的作用。為了查清仔豬接種豬瘟疫苗后產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫力的消長情況及相關(guān)性，課題組采用黃芪多糖直接稀釋高效豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）免疫接種斷奶仔豬，定期檢測血清中的IgG抗體和豬白細(xì)胞介素-4 （IL-4）、豬干擾素 -γ（IFN-γ）、豬腫瘤壞死因子α （TNF-α）三種細(xì)胞因子，進(jìn)行統(tǒng)計分析，為有效控制豬瘟流行提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗藥品

試驗用豬瘟疫苗，選用市售河南某公司生產(chǎn)的高效豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）和配套稀釋液，黃芪多糖注射液由北京某公司生產(chǎn)，豬瘟ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）抗體檢測試劑盒由法國Biochek公司生產(chǎn)，北京天之泰生物科技有限公司提供。豬白細(xì)胞介素-4（IL-4）、豬干擾素-γ（IFN-γ）、豬腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫分析檢測試劑盒由北京永輝生物科技有限公司提供。

1.2試驗設(shè)計

選擇出生日期相近的28日齡斷奶仔豬101頭，隨機(jī)分成2組，飼養(yǎng)同一條件下。試驗1組：用高效豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）100頭份+100mL黃芪多糖注射液，30日齡仔豬首免肌肉注射1.1mL/頭；60日齡二免肌肉注射1.5mL/頭，共免疫50頭。試驗2組：用高效豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）100頭份+ 100mL配套稀釋液，30日齡首免肌肉注射1.1mL/頭；60日齡二免肌肉注射1.2mL/頭，共免疫51頭。

1.3樣品采集

分別在仔豬免疫前28日齡和首免后40、50、60、70、80、90、120日齡前腔靜脈采血3～5mL，分離血清，用于測定豬瘟免疫抗體IgG值和細(xì)胞因子IL-4，IFN-γ，TNF-α濃度。

1.4豬瘟病毒ELISA抗體檢測試劑盒的檢測方法與判定標(biāo)準(zhǔn)

抗體檢測按照ELISA檢測試劑盒操作步驟進(jìn)行。試驗成立的條件：陰性對照孔平均OD405nm＜0.35，（陽性對照孔平均OD405nm-陰性對照孔平均OD405nm）＞0.15。判定標(biāo)準(zhǔn)：S/P≤0.499，判定為豬瘟抗體陰性；S/P≥0.500，判定為豬瘟抗體陽性。

1.5IL-4，IFN-γ和TNF-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒的檢測方法與判定標(biāo)準(zhǔn)

取上述血清，嚴(yán)格按照豬白細(xì)胞介素-4（IL-4）、豬干擾素-γ（IFN-γ）和豬腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫分析檢測試劑盒說明書操作，常規(guī)加底物顯色，于酶標(biāo)儀上測定各孔OD450nm值，根據(jù)各自標(biāo)準(zhǔn)品OD450nm值繪制各自標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品中IFN-γ，IL-4和TNF-α的濃度。

1.6 統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)采用SPSS18統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　試驗結(jié)果

2.1豬瘟抗體水平檢測結(jié)果

由表1可知，母豬免疫前、仔豬免疫前及首免后10d豬瘟抗體S/P平均值試驗組和對照組差異均不明顯。與對照組相比，試驗組仔豬豬瘟抗體S/P平均值首免后20d提高33.96%，差異不顯著（P＞0.05）；首免后30d提高87.04%，差異不顯著（P＞0.05）；整個一免試驗期提高39.51%。且試驗組抗體產(chǎn)生快，可以維持更長時間。二免后10d試驗組仔豬豬瘟抗體S/P平均值提高7.69%，差異不顯著（P＞0.05）；二免后20d提高16.67%，差異不顯著（P＞0.05）；二免后30d提高6.92%差異不顯著（P＞0.05）；二免后40d提高15.69%，差異不顯著（P＞0.05）；整個二免試驗期提高11.87%。

表1　豬瘟免疫抗體S/P平均值檢測結(jié)果

圖1　不同免疫程序免疫抗體S/P平均值

2.2豬瘟免疫抗體陽性率檢測結(jié)果

由表2可以看出，母豬和仔豬免疫前各組豬瘟抗體陽性率差異不顯著。與仔豬免疫前相比，首免后10d豬瘟抗體陽性率試驗組下降32.5%，對照組下降36.67%；首免后20d豬瘟抗體陽性率試驗組和對照組仍維持低水平；首免后30d豬瘟抗體陽性率試驗組已恢復(fù)至免疫前水平，對照組仍維持較低水平。二免后10d豬瘟抗體陽性率試驗組和對照組均已恢復(fù)至免疫前水平，二免后20d和30d豬瘟抗體陽性率試驗組達(dá)到100%，比對照組均高12.50%，二免后40d豬瘟抗體陽性率試驗組和對照組差異較小，比對照組高9.72%。

2.3免疫前后不同時間各組血清中IL-4含量的變化

由表3可知，免疫30日齡斷奶仔豬后，仔豬在40日齡、50日齡、60日齡、70日齡、80日齡時，IL-4含量均為對照組高于試驗組；90日齡時，IL-4含量為對照組低于試驗組；整個試驗期，試驗組和對照組之間IL-4含量差異均不顯著（P＞0.05）。

表2　豬瘟免疫抗體陽性率檢測結(jié)果%

圖2　不同免疫程序免疫抗體陽性率

表3　免疫前后不同時間各組血清中IL-4含量檢測結(jié)果ng/L

圖3　免疫前后不同時間各組血清中IL-4含量檢測結(jié)果（ng/L）

2.4免疫前后不同時間各組血清中IFN-γ含量的變化

表4可知，免疫30日齡斷奶仔豬后，40日齡時，試驗組IFN-γ含量低于對照組，差異不顯著（P＞0.05）；50日齡時，對照組IFN-γ含量顯著低于試驗組（P＜0.05）；60日齡時，試驗組和對照組之間IFN-γ含量差異不顯著（P＞0.05），但試驗組IFN-γ含量高于對照組；70日齡時，試驗組IFN-γ含量顯著高于對照組（P＜0.05）；80日齡、90日齡時，對照組IFN-γ含量低于試驗組，差異不顯著（P＞0.05）。

表4　免疫前后不同時間各組血清中IFN-γ含量檢測結(jié)果ng/L

圖4　免疫前后不同時間各組血清中IFN-γ含量檢測結(jié)果（ng/L）

2.5疫前后不同時間各組血清中TNF-α含量的變化由表5可知，免疫30日齡斷奶仔豬后，不同時間實驗組和對照組之間TNF-α含量差異均不顯著（P＞0.05）。40日齡時，TNF-α含量：試驗組＜對照組。50日齡、60日齡、70日齡時，TNF-α含量均為：對照組＜試驗組。80日齡時，TNF-α含量：試驗組＜對照組。90日齡時，TNF-α含量：對照組＜試驗組。

表5　免疫前后不同時間各組血清中TNF-α含量檢測結(jié)果ng/L

圖5　免疫前后不同時間各組血清中TNF-α含量檢測結(jié)果（ng/L）

3　小結(jié)與分析

黃芪多糖是黃芪中最重要的天然有效成分，作為一種綠色安全環(huán)保的免疫增強(qiáng)劑已經(jīng)在獸用臨床中被廣泛應(yīng)用，具有提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和巨噬細(xì)胞活性、誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用；具有輔助增強(qiáng)多種疫苗免疫的效果。

抗體水平是反映體液免疫的指標(biāo)，用黃芪多糖注射液直接稀釋高效豬瘟活疫苗的試驗組，比用配套稀釋液稀釋高效豬瘟活疫苗對照組，統(tǒng)計分析整個試驗期，試驗組與對照組IgG抗體S/P平均值和豬瘟IgG抗體陽性率S/P平均值差異均不顯著（P＞0.05），表明二者在提高體液免疫方面的作用是相近的，但在每個檢測階段，豬瘟免疫抗體S/P平均值和豬瘟抗體陽性率都有一定的提高，說明黃芪多糖對豬瘟疫苗的體液免疫是有增強(qiáng)作用的。沈美玲等研究也發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能增加機(jī)體的抗體生成細(xì)胞數(shù)，在體外可增強(qiáng)小鼠脾臟細(xì)胞對LPS的應(yīng)答反應(yīng)，而在體內(nèi)黃芪多糖卻抑制了脾臟細(xì)胞對LPS的應(yīng)答反應(yīng)，這可能由于給藥后脾臟中對LPS不敏感的增生細(xì)胞所致，由此認(rèn)為黃芪多糖有刺激B細(xì)胞功能的作用。Kujimura K報道，黃芪可提高大鼠抗體含量，具有提高體液免疫的功能，程志斌等研究報道，黃芪多糖能促使小鼠脾臟內(nèi)漿細(xì)胞增生，促進(jìn)抗體合成，從而增強(qiáng)機(jī)體體液免疫。這些都與本實驗的研究結(jié)果是一致的。

淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的含量是反映細(xì)胞免疫的指標(biāo)之一。IL-4主要由活化的Th2細(xì)胞產(chǎn)生，有維持Th2細(xì)胞增殖的作用，可提高機(jī)體對抗原的體液免疫應(yīng)答能力。本試驗果顯示，除90日齡外黃芪多糖注射液組在免疫后的各個時間點的IL-4含量均低于疫苗專用稀釋液組，說明黃芪多糖注射液可降低豬血清IL-4含量，對IL-4的分泌有明顯抑制作用，有增強(qiáng)細(xì)胞免疫的作用。

γ-干擾素（IFN-γ）是由Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞等合成和分泌的一種低分子量的可溶性糖蛋白，IFN-γ屬于Thl型細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)向Thl型轉(zhuǎn)化而抑制Th2型免疫反應(yīng)，對細(xì)胞免疫有上調(diào)作用而對體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生下調(diào)作用。本試驗結(jié)果顯示黃芪多糖注射液組在豬50，60，70，80，90日齡的IFN-γ含量均高于疫苗專用稀釋液組，且在豬50，70日齡都顯著高于疫苗專用稀釋液組，說明黃芪多糖注射液可促進(jìn)IFN-γ的分泌，有增強(qiáng)細(xì)胞免疫的作用。

腫瘤壞死因子（TNF）是特異性免疫應(yīng)答與急性炎癥反應(yīng)之間的一種重要介質(zhì)，是介導(dǎo)和調(diào)節(jié)天然免疫的細(xì)胞因子。本試驗結(jié)果顯示，黃芪多糖注射液組的TNF-a含量在豬50，60，70，90日齡都高于疫苗專用稀釋液組，說明黃芪多糖注射液可促進(jìn)TNF-a的分泌。解慧梅等將不同濃度的黃芪多糖作用于體外培養(yǎng)的大鼠腸粘膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞，用ELISA法測定TNF-a水平的變化，結(jié)果表明大鼠腸粘膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞在黃芪多糖的作用下，細(xì)胞分泌的TNF-a增多。邱河輝等研究證明APS對IL-2、IFN-γ和TNF-α的mRNA表達(dá)有顯著增強(qiáng)作用，APS能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞TH1型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)來整體調(diào)節(jié)促進(jìn)細(xì)胞免疫，說明黃芪多糖注射液有增強(qiáng)細(xì)胞免疫的作用。

從以上的研究可以看出黃芪多糖的確對豬瘟疫苗免疫效果有明顯的增強(qiáng)作用，可有效的增強(qiáng)豬瘟疫苗細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，提高豬瘟疫苗IgG抗體水平，增加豬干擾素-γ（IFN-γ）、豬腫瘤壞死因子α（TNF-α），降低豬白細(xì)胞介素-4（IL-4）的分泌，對疫苗有輔助增效的作用。這與朱錢龍等的研究相一致。而朱輝等研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖注射液雖然不能完全取代豬瘟疫苗專用稀釋液，但在某些方面優(yōu)于豬瘟疫苗專用稀釋液，說明黃芪多糖可以作為豬瘟疫苗佐劑和改良現(xiàn)有疫苗專用稀釋液。這些都說明豬瘟免疫配合使用黃芪多糖，可以改善豬機(jī)體免疫機(jī)能，減少免疫抑制的發(fā)生，防止野毒感染，降低發(fā)病率。

另外，在生產(chǎn)中，不檢測，不重視細(xì)胞免疫的情況，單純以抗體水平高低判定豬群免疫好壞，不科學(xué)不全面。本試驗為豬瘟防控提供依據(jù)，在今后檢測中應(yīng)重視細(xì)胞因子檢測。

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10.3969/J.ISSN.1671-6027.2016.09.009

山西省科技攻關(guān)項目（20120311022-4）；山西省回國留學(xué)人員科研資助項目（2013-144）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重點項目（2013ZD10）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院攻關(guān)項目（2012YGG32）

姚敬明（1957～），山西省太谷縣人，學(xué)士，研究員，主要從事豬雞疫病免疫防控技術(shù)研究

孟帆（1980～），山西太原人，碩士，助理研究員，主要從事豬病分子生物學(xué)檢測診斷技術(shù)研究工作