程瑞雪，鄧 斌，王亞玲，耿雪俠，李 俊，張 旭，彭樹英，鄧道貴，張海軍

（1：淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院資源植物生物學(xué)安徽省重點實驗室，淮北235000）

（2：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥230000）

?

大型溞（Daphnia magna）線粒體基因組的測定與序列分析*

程瑞雪1，鄧 斌1，王亞玲1，耿雪俠1，李 俊2，張 旭1，彭樹英1，鄧道貴1，張海軍1**

（1：淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院資源植物生物學(xué)安徽省重點實驗室，淮北235000）

（2：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥230000）

利用Long-PCR及普通PCR技術(shù)，結(jié)合引物步移法測序，經(jīng)拼接、組裝后獲得中國淮河大型溞（Daphnia magna）線粒體基因組全序列，并對其基因組成、結(jié)構(gòu)特點等進行初步分析.大型溞線粒體基因組全長為14948 bP，A、T、G、C各堿基含量分別為32.37%、34.73%、15.58%、17.31%，表現(xiàn)出明顯的AT偏倚.13個蛋白質(zhì)編碼基因、22個tRNA基因、2個rRNA基因和1個D-looP區(qū)（控制區(qū)）的排列方式與典型的節(jié)肢動物線粒體基因組的排列方式略有不同.除COI基因以CTG、ATP8基因以GTG、ND3基因以ATC以及ND6基因以ATT為起始密碼子以外，其余9個蛋白質(zhì)編碼基因均以ATG作為起始密碼子；9個蛋白質(zhì)編碼基因具有典型的完全終止子TAG或TAA，COI、COII、ND4和ND5等基因采用不完全終止密碼子T.基因組包含9個基因間隔區(qū)，共81 bP，長度1～62 bP；13個基因重疊區(qū)，共77 bP，重疊堿基數(shù)在1～27 bP之間，最大重疊在16S rRNA和tRNAVal基因之間.在預(yù)測的22個tRNA基因的二級結(jié)構(gòu)中，發(fā)現(xiàn)只有tRNASer1基因未能形成完整的二級結(jié)構(gòu)，其他21個基因均可形成典型的三葉草結(jié)構(gòu).16S rRNA和12S rRNA基因長度分別為1373 bP和752 bP，D-looP區(qū)全長289 bP.本研究結(jié)果為探討大型溞在溞屬中的系統(tǒng)學(xué)地位及其與其他種間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系等問題提供了數(shù)據(jù)資源.

大型溞；線粒體基因組；序列分析；tRNA二級結(jié)構(gòu)

?2016 by Journal of Lake Sciences

大型溞（Daphnia magna）屬于節(jié)肢動物門（ArthroPoda）、甲殼綱（Crustacea）、鰓足亞綱（BranchiaPoda）、枝角目（Cladocera）、溞科（DaPhniidae）、溞屬（Daphnia），是微甲殼類浮游動物的重要組成物種［1］，主要生活在淡水中，具有分布廣、生活周期短、繁殖快、易于在實驗室培養(yǎng)且對水環(huán)境中多種有毒化學(xué)物質(zhì)敏感性強［2］等特點，因此被廣泛應(yīng)用于水質(zhì)監(jiān)測和水生生物毒理研究［3-4］，也是生命科學(xué)和環(huán)境科學(xué)等研究領(lǐng)域較為理想的模式生物［5］.目前關(guān)于大型溞的研究仍然是毒理研究和水質(zhì)監(jiān)測占主導(dǎo)［6-10］，關(guān)于溞類的分子進化研究也是一個熱點.

動物線粒體基因組由于具有分子量小、含量多、結(jié)構(gòu)簡單、進化速率快、母系遺傳等特點，常被用于動物界的分類鑒定、物種多樣性和不同等級階元系統(tǒng)發(fā)育的研究［11-14］，它包含豐富的分子標(biāo)記，如單個基因序列、基因重排模型和RNA二級結(jié)構(gòu)等，被廣泛應(yīng)用于種群遺傳學(xué)、物種鑒定、不同分類階元的系統(tǒng)發(fā)育等研究［15-16］.

到目前為止，溞屬浮游動物中只有來自北美的蚤狀溞（D.pulex）線粒體DNA全序列已被測定分析并公布［17］，而對另一種溞屬浮游動物——大型溞在分子生物學(xué)方向的研究尚屬少見，并且溞屬動物依據(jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進行分類的方法有很多不足，出現(xiàn)了同名異種或者同種異名現(xiàn)象［18］.耿雪俠等［19］基于3種溞屬動物線粒體基因組COI基因的測定與分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明來自中國的隆線溞（D.carinata）和大型溞具有較近的親緣關(guān)系，而與北美蚤狀溞親緣關(guān)系相對較遠，因此需要選擇更多的分子標(biāo)記來進一步驗證這個結(jié)果并揭示其真正原因.基于此，本文對大型溞線粒體基因組全序列進行測定和注釋，并對其基因組成和結(jié)構(gòu)特征進行初步分析，以期為溞科的分類學(xué)和系統(tǒng)進化研究提供新的分子生物學(xué)數(shù)據(jù)資料.

1　材料與方法

1.1材料

實驗用的大型溞（Daphnia magna）采自淮河.連續(xù)培養(yǎng)3代以上的單克隆品系用于基因組DNA的提取.

1.2基因組DNA的提取

將經(jīng)饑餓處理的單只大型溞，置于1.5 ml離心管中，大型溞基因組DNA的提取參照文獻［20］，并置于-20℃保存?zhèn)溆?

1.3PCR擴增及序列測定

根據(jù)Genbank中已公布的北美蚤狀溞（Daphnia pulex）的線粒體基因組全序列（Genbank登錄號：AF117817.1）［17］設(shè)計出可覆蓋大型溞線粒體基因組全序列的引物（表1）.擴增片段間均有部分重疊.

表1　擴增大型溞線粒體基因組全序列的引物Tab.1 Primers used for amPlifying the comPlete mitochondrial genome sequence of Daphnia magna

PCR反應(yīng)總體積為25 μl，反應(yīng)體系為：dNTP Mixture（10 mmol/L）1 μl、10×PCR buffer緩沖液（Mg2+Plus）2.5 μl、DMSO 2 μl、DNA模板1 μl、正反向引物（10 μmol/L）各1 μl、LA-Taq DNA聚合酶（5 U/μl）0.25μl，補加16.25 μl ddH2O至25 μl.

PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s、50℃ 30 s、72℃ 2～8 min，30個循環(huán)；最后72℃充分延伸10 min，4℃保存.取5 μl PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照.PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠純化，產(chǎn)物委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序.

1.4序列分析

利用DNAStar軟件中的SeqMan和測序峰圖結(jié)果分析軟件Chromas 1.62將所得序列進行確認、拼接和組裝，最終獲得大型溞線粒體基因組的全序列（Genbank登錄號：KP296147）.與北美蚤狀溞線粒體基因組全序列比對后，運用在線軟件DOGMA（httP：∥dogma.ccbb.utexas.edu/）和MITOS（httP：∥mitos.bioinf.unileiPzig.de）等對大型溞線粒體基因組進行基因定位，并預(yù)測tRNA基因的二級結(jié)構(gòu).采用MEGA 6.02［21］軟件分析基因組各部分的堿基組成、蛋白質(zhì)編碼基因密碼子使用頻率、密碼子相對使用頻率（RSCU）等.

2　結(jié)果

2.1大型溞線粒體基因組組成與基因排列

大型溞線粒體基因組全長14948 bP，包括13個蛋白質(zhì)編碼基因（Protein-coding genes，PCGs）、22個tRNA基因、2個rRNA基因（16S rRNA和12S rRNA）和1個介于tRNAIle基因和tRNAGln基因之間的非編碼區(qū)（D-looP區(qū)）（圖1）.其中，23個基因由J鏈編碼，另外的15個基因由N鏈編碼.大型溞線粒體基因組的基因結(jié)構(gòu)較為緊湊，除控制區(qū)外，基因間非編碼間隔區(qū)僅9處81 bP，間隔長度為1～62 bP不等，最大的基因間隔為62 bP，在12S rRNA和tRNAIle基因之間.同時，部分相鄰基因間存在重疊現(xiàn)象，共計13處77 bP，重疊長度在1～27 bP之間，最長的基因重疊出現(xiàn)在16S rRNA和tRNAVal基因之間，為27 bP（表2）.

大型溞線粒體基因組中含腺嘌呤（A）4839 bP、鳥嘌呤（G）2329 bP、胸腺嘧啶（T）5192 bP、胞嘧啶（C）2588 bP，分別占全長的32.37%、15.58%、34.73%、17.31%，A+T占67.11%，G+C占32.89%，A+T含量明顯高于G+C含量（表3），符合無脊椎動物線粒體DNA序列堿基組成的特點.

圖1　大型溞線粒體基因組組織結(jié)構(gòu)（COI、COII、COIII分別表示細胞色素氧化酶亞基I～III；ATP8 和ATP6分別表示ATP合成酶亞基8和6；ND1～ND6和ND4L分別表示NADH脫氫酶亞基1～6和4L；Cytb表示細胞色素b；12S rRNA和16S rRNA；tRNA基因用氨基酸代碼表示）Fig.1 Circular maP of the mitochondrial genome of Daphnia magna

表2　大型溞線粒體基因組組成*Tab.2 Organization of the D.magna mitogenome

2.2蛋白質(zhì)編碼基因

大型溞線粒體基因組所包含的13個蛋白質(zhì)編碼基因總長度為10582 bP，除COI基因以CTG、ATP8基因以GTG、ND3基因以ATC和ND6基因以ATT為起始密碼子以外，其余9個蛋白質(zhì)編碼基因均以ATG作為起始密碼子.9個蛋白質(zhì)編碼基因具有典型的完全終止子TAG或TAA，COI、COII、ND4和ND5基因則以T作為終止信號.在這13個蛋白質(zhì)編碼基因中，ND1、ND4、ND4L和ND5由N鏈編碼，其余9個基因均由J鏈編碼.蛋白質(zhì)編碼基因沒有內(nèi)含子，相鄰基因之間出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，如ATP6和COIII基因間重疊1 bP，ND4和ND4L基因間重疊1 bP（表2）.Cytb基因在10513位置缺失1個堿基T，在翻譯時，可以通過RNA編輯過程中尿苷酸的添加來形成完整的細胞色素b mRNA序列，進而翻譯成有功能的蛋白質(zhì).

大型溞線粒體基因組不同蛋白質(zhì)編碼基因的堿基組成見表3.13個蛋白質(zhì)編碼基因的平均A+T含量為66.18%，其中，密碼子第1、2、3位點的A+T含量基本一致.大型溞線粒體基因組各個不同區(qū)域的A+T含量均高于G+C含量，除tRNA和rRNA基因外，它們的AT skew均為負值，呈現(xiàn)出一致的A/T堿基使用偏向性（表3）.

運用MEGA 6.02軟件對這13個蛋白質(zhì)編碼基因進行統(tǒng)計分析，得出總共有3526個密碼子（不包含4個不完全的終止密碼子），其中NNU和NNA密碼子的RSCU值均大于等于1，表明其第3位點全部是A或U，該密碼子使用的偏向性與蛋白質(zhì)編碼基因第3位點A+T（66.6%）偏向性有一定的正相關(guān)性.

表3　大型溞線粒體基因組不同區(qū)域的堿基組成*Tab.3 NuclePtide comPosition in different regions of the D.magna mitochondrial

2.3tRNA基因和rRNA基因

利用DOGMA（httP：∥dogma.ccbb.utexas.edu/）和MITOS（httP：∥mitos.bioinf.uni-leiPzig.de/index.Py）等軟件及人工輔助校正得到大型溞線粒體基因組的22個tRNA基因的準(zhǔn)確位置和二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果，基因長度為62～72 bP不等.其中13個由J鏈編碼，其余的由N鏈編碼.除tRNASer1外，其余的tRNA均能形成典型的三葉草結(jié)構(gòu)（圖2）.tRNASer1缺少二氫尿嘧啶臂（DHU stem），在其相應(yīng)位置上只形成1個簡單環(huán).除典型的A·U，G·C配對外，在大型溞的17個tRNA基因中還發(fā)現(xiàn)了25對錯配，其中10對在氨基酸臂上，5對在DHU臂上，4對在反密碼子臂上，6對在TφC臂上，主要是G·U和U·G錯配.

rRNA基因的位置相對固定，在無脊椎動物線粒體中比較保守.大型溞線粒體的16S rRNA基因位于tRNALeu1基因和tRNAVal基因之間，12S rRNA基因位于tRNAVal基因和tRNAIle基因之間（圖1）.16S rRNA和12S rRNA基因長度分別為1373和752 bP.

2.4D-Loop區(qū)

大型溞mtDNA的D-looP區(qū)位于 tRNAIle基因和 tRNAGln基因之間（圖1），全長289 bP，A+T含量為73.70%，高于線粒體基因組其他區(qū)域的A+T含量（表3），因此，也稱A+T豐富區(qū).該區(qū)不編碼蛋白質(zhì)，但對基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制起著調(diào)控作用，所以又稱為控制區(qū).

3　討論

大型溞線粒體基因組全序列長度為14948 bP.通過分析發(fā)現(xiàn)，基因組成與典型節(jié)肢動物線粒體基因組一致，但排列順序略有差別（圖1）.大型溞tRNAIle基因由N鏈編碼，位置在14596～14659 bP處，而北美蚤狀溞的tRNAIle由J鏈編碼，在1～64 bP處.其余各基因的位置與北美蚤狀溞類似.

圖2　大型溞22個tRNA基因二級結(jié)構(gòu)Fig.2 Predicted clover-leaf secondary structures for 22 tRNA genes of D.magna

在溞類線粒體蛋白質(zhì)編碼基因中，至少有3種不同的起始密碼子（ATG、ATT和GTG），在其他動物線粒體DNA中也普遍存在［22-23］.大型溞COI基因以CTG作為起始密碼子，而北美蚤狀溞以ATTA起始.已報道過的COI基因的起始密碼子有三聯(lián)體密碼子、四聯(lián)體密碼子和六聯(lián)體密碼子［24］等.目前，關(guān)于COI基因起始密碼子的多樣性機理尚不明確，仍需做進一步研究來檢測驗證.在大型溞13個蛋白質(zhì)編碼基因中，9個基因以完全終止密碼子（TAA和TAG）作為終止信號，只有COI、COII、ND5和ND4基因使用不完全終止密碼子T.而在北美蚤狀溞中ND2基因也使用不完全終止密碼子T，ATP6和ND3基因則使用另一個不完全終止密碼子TA.不完全終止密碼子可能通過mRNA加工過程中的多聚腺苷酸化形成完全終止密碼子［25-27］.

大型溞的tRNASer1缺少二氫尿嘧啶臂（DHU stem），在歐洲蚤狀溞里也發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象，這在后生動物中普遍存在.其他21個tRNA均形成了典型的三葉草結(jié)構(gòu).17個tRNA基因共有25對G·U或U·G錯配.A+T含量68.79%，遠高于G+C含量.

大型溞16S rRNA和12S rRNA基因長度分別為1373 bP和752 bP，兩者長度與已公布的北美蚤狀溞的16S rRNA（1314 bP）和12S rRNA（753 bP）基因長度相似.16S rRNA和12S rRNA基因的A+T含量分別為71.30%和69.15%，與北美蚤狀溞的16S rRNA（68.19%）和12S rRNA（67.20%）基因的A+T含量基本相似.

大型溞D-looP區(qū)長度為289 bP，A+T含量73.70%，高于線粒體基因組其他區(qū)域.北美蚤狀溞D-looP區(qū)長689 bP，A+T含量67.05%.在脊椎動物和無脊椎動物中，該區(qū)包含復(fù)制起始點.D-looP區(qū)因不受編碼限制，因此含有豐富的變異位點，且該區(qū)長度的差異是導(dǎo)致整個基因組全序列長度多態(tài)性的主要原因.

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CompLete mitochondriaL genome sequence of Daphnia magna（Crustacea：CLadocera）from Huaihe in China

CHENG Ruixue1，DENG Bin1，WANG Ya1ing1，GENG Xuexia1，LI Jun2，ZHANG Xu1，PENG Shuying1，
DENG Daogui1&ZHANG Haijun1**
（1：Anhui Key Laboratory of Plant Resource and Biology，School of Life Science，Huaibei Normal University，Huaibei 235000，P.R.China）
（2：School of Life Science，Anhui Agriculture University，Hefei 230000，P.R.China）

The comPlete sequence of mitochondrial genome of Daphnia magna was determined using long PCR，normal PCR and Primers walking aPProaches.The results showed that the entire mitochondrial genome of Daphnia magna is 14948 bP in size，in which the content of A，T，G，C is 32.37%，34.73%，15.58%，17.31%，resPectively.The mitochondrial genome organization and gene order of Daphnia magna were consistent with that of Arthropod，which contains 13 Protein-coding genes（PCGs），22 tRNA genes，2 ribosomal RNA genes（large and small ribosomal RNAs），and a control region.ExcePt for COI gene using CTG，ATP8with GTG，and ND3with ATC，and ND6with ATT as the initiation codon，and other 9 PCGs of the mtDNA in Daphnia magna started with the tyPical ATG codon.TAG and TAA were used in 9 PCGs as usual termination codons，excePt for COI，COII，ND4and ND5genes with incomPlete termination codon（T）.There are 9 intergenic sPacer sequencer totaling 81 bP（1-62 bP for each sequence）and 13 overlaPPing sequences totaling 77 bP（1-27 bP for each sequence），scattered throughout the genome，resPectively，and the largest overlaP（27 bP）region is located between16S rRNA and tRNAValgenes.The secondary structures of 22 tRNAs were Predicted and it was found that tRNASer1failed to form a comPlete secondary structure，others have tyPicalleaf clover secondary structures.The length of16S rRNA，12S rRNA and D-looP were 1373 bP，752 bP and 289 bP，resPectively. The results of this study Provide some useful molecular data to clarify the systematical status of Daphnia，as well as its Phylogenetic relationshiPs with other sPecies.

Daphnia magna；mitochondrial genome；Phylogenetic analysis；tRNA secondary structure

10.18307/2016.0222

*國家自然科學(xué)基金項目（81272377，31370470）、安徽省自然科學(xué)基金項目（1208085MC45）和資源植物生物學(xué)安徽省重點實驗室開放基金項目（ZYZWSW2014014）聯(lián)合資助.2015-01-23收稿；2015-04-14收修改稿.程瑞雪（1990～），女，碩士研究生；E-mail：chengrx2012@163.com.

**

；E-mail：haijunzhang@163.com.