劉晨，呂峰，曹秋萍

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350002）

美拉德反應(yīng)改性提高滸苔蛋白酶解液品質(zhì)研究*

劉晨，呂峰*，曹秋萍

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350002）

以滸苔蛋白酶解液為反應(yīng)液，基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以滸苔蛋白酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（MRPs）的還原力及其感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，通過(guò)L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化滸苔蛋白酶解液美拉德反應(yīng)關(guān)鍵工藝參數(shù)。結(jié)果表明，適合于滸苔蛋白酶解液美拉德反應(yīng)的還原糖為木糖，當(dāng)以反應(yīng)溫度為110 ℃，反應(yīng)時(shí)間為115 min，反應(yīng)液pH為6.0，木糖添加量6.0%(w/v)為優(yōu)化條件組合進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，所得滸苔蛋白酶解液MRPs的還原力從0.788提高至2.523，比滸苔蛋白酶解原液提高了3.0倍。感官評(píng)價(jià)值為87.91分，滸苔蛋白酶解液MRPs的色澤呈誘人的黃棕色，香味愉悅，帶有淡淡的海鮮味。

美拉德反應(yīng)；修飾；改善；抗氧化性能；感官品質(zhì)

美拉德反應(yīng)是一種廣泛存在于食品加工中的非酶褐變，是羰基化合物與氨基化合物之間發(fā)生的復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)，又稱(chēng)為羰氨反應(yīng)。美拉德反應(yīng)能產(chǎn)生大量的具有特殊氣味和顏色的產(chǎn)物，以改變食品的色澤和香氣，故被廣泛應(yīng)用于食品、香精、香料的生產(chǎn)中，特別是在香精、香料生產(chǎn)領(lǐng)域已經(jīng)取得非常好的應(yīng)用，達(dá)到了調(diào)配技術(shù)無(wú)法比擬的效果；此外，由于美拉德反應(yīng)體系復(fù)雜，除了會(huì)產(chǎn)生類(lèi)黑精外，還會(huì)產(chǎn)生還原性的醛、酮類(lèi)物質(zhì)以及含有氮、硫的雜環(huán)化合物，研究表明，這類(lèi)物質(zhì)具有一定的抗氧化[1、2]、抗過(guò)敏、抗菌性能[3-4]，其中某些物質(zhì)的抗氧化強(qiáng)度甚至可以媲美食品中常用的抗氧化劑[5]。

許多食物體系中的天然的氨基酸、肽類(lèi)物質(zhì)或其蛋白酶解液經(jīng)美拉德反應(yīng)修飾后不但能提高該其抗氧化功能，還能賦予其特殊的香味，因此，在開(kāi)發(fā)、制備具有抗氧化性食品的研究中，通過(guò)美拉德反應(yīng)改性或修飾用以提高或改善食材或食品的抗氧化活性與感官品質(zhì)已經(jīng)引起業(yè)內(nèi)人士的關(guān)注和青睞。

滸苔是一種大型綠藻，俗稱(chēng)苔條、青海苔等，為綠藻門(mén)石莼目石莼科滸苔屬的藻類(lèi)植物，其自然繁殖能力強(qiáng)，資源豐富，僅福建沿海每年產(chǎn)量（鮮重）可達(dá)10萬(wàn)t以上[6]，具有很大的開(kāi)發(fā)潛力。營(yíng)養(yǎng)成分分析發(fā)現(xiàn)，滸苔是一種高蛋白、高膳食纖維、低脂肪、富含維生素和礦物質(zhì)低污染的海洋食物資源，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，其蛋白質(zhì)含量約為10.91%-29.9%，且其氨基酸種類(lèi)齊全，常作為一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)資源[7、8]，被廣泛地應(yīng)用食品加工。

研究在采用定向酶解技術(shù)制備具有抗氧化性能的滸苔蛋白酶解液基礎(chǔ)上，以其為試材，探究美拉德反應(yīng)改性對(duì)滸苔抗氧化性能和感官品質(zhì)的影響；并以滸苔蛋白酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（MRPs）的還原力以及感官品質(zhì)為指標(biāo)，基于確定其美拉德反應(yīng)體系適宜還原糖，通過(guò)L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化滸苔蛋白酶解液美拉德反應(yīng)的關(guān)鍵工藝參數(shù)，以期提高和改善滸苔原料的抗氧化性能和感官品質(zhì)，提高其經(jīng)濟(jì)附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 原輔材料

滸苔干粉：過(guò)80目篩，福建海興保健食品有限公司提供。

98%D-木糖（食品級(jí)），購(gòu)于阿拉丁試劑(上海)有限公司；葡萄糖（食品級(jí)），購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；75%果葡糖漿（食品級(jí)），購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 滸苔酶解液制備

控制水解料液比為1∶30，堿性蛋白酶使用量為600 U . g-1，調(diào)節(jié)酶解液pH為8.0，在50 ℃下水浴提取90 min，沸水水浴10 min滅酶，控制其蛋白水解溫度在50 ℃左右，冷卻備用。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、檸檬酸、碳酸氫鈉，均為分析純。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司；Starter 3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：奧豪斯儀器（上海）有限公司；CP114型電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；LS-B50L高壓蒸汽滅菌鍋：上海醫(yī)用核子儀器廠；實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)用純水機(jī)：程度康寧實(shí)驗(yàn)專(zhuān)用純水設(shè)備廠；UV-1800PC型紫外可見(jiàn)分管光度計(jì)：上海美譜達(dá)有限公司；DL-5-B型低速大容量多管離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 試驗(yàn)內(nèi)容與方法

1.2.1 滸苔蛋白酶解液美拉德反應(yīng)工藝流程

滸苔蛋白酶解液→添加還原糖→攪拌溶解→調(diào)節(jié)pH值→美拉德反應(yīng)→冷卻→測(cè)定反應(yīng)液的O2→清除率和還原力，評(píng)價(jià)其感官品質(zhì)

1.2.2 滸苔蛋白酶解液美拉德反應(yīng)適宜糖的確定

準(zhǔn)確吸取一定體積的滸苔蛋白酶解液8組于錐形瓶中，其中一組不添加任何糖的為空白對(duì)照組，其余按其質(zhì)量體積比的6%分別加入葡萄糖、果葡糖漿、木糖、葡（葡萄糖）∶木（1∶1）、木（木糖）∶果（果糖）（1∶1）、葡∶果（1∶1）、木∶果∶葡（1∶1∶1），混勻并使其溶解，調(diào)節(jié)各組反應(yīng)液pH為5.5，并置于110 ℃高壓鍋中反應(yīng)60min后，取出放入冰水中冷卻至室溫，測(cè)定反應(yīng)體系MPRs的還原力和感官評(píng)價(jià)，確定適合于滸苔蛋白酶解液美拉德反應(yīng)的還原糖。

1.2.3 滸苔蛋白酶解液美拉德反應(yīng)工藝參數(shù)的優(yōu)化

單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，反應(yīng)溫度、木糖濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)液pH是滸苔蛋白酶解液進(jìn)行美拉德反應(yīng)的主要影響因素，采用L9(34)四因素三水平正交試驗(yàn)方案，以其MPRs的感官評(píng)分和還原力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化滸苔蛋白酶解液美拉德反應(yīng)的關(guān)鍵工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)1。

1.3 指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.3.1 還原力測(cè)定

參考張澤生的方法[9]，并略作修改。

取1.0 mL處理過(guò)滸苔酶解液于試管內(nèi)，加入2.5 mL 0.2 mol . L-1磷酸緩沖鹽溶液（pH=6.6）和2.5mL 1%的鐵氰化鉀混合均勻，與50 ℃水浴20 min，取出用流動(dòng)水快速冷卻后，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸，3000 rpm離心10 min后，于700 nm處測(cè)定其吸光值，每個(gè)樣品做3次平行試驗(yàn)，取平均值。

1.3.2 感官評(píng)價(jià)方法

挑選接受過(guò)感官評(píng)定學(xué)習(xí)與訓(xùn)練的同學(xué)10名（男女比例1∶1）組成感官評(píng)定小組對(duì)滸苔蛋白酶解液美拉德反應(yīng)體系進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，總分值為100分，其中氣味占50分、滋味30分、色澤20分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

表2 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

采用DPSv7.05軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各數(shù)據(jù)間的多重比較采用鄧肯新復(fù)極差法，色差測(cè)定各單因素均值間的顯著性檢測(cè)采用LSD多重比較標(biāo)記字母法，顯著性臨界值：p＜0.01為極顯著差異，0.01＜p＜0.05為顯著差異，p＞0.05差異不顯著，對(duì)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析與方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 滸苔蛋白酶解液美拉德反應(yīng)適宜還原糖確定

從圖1可以看出，木糖與滸苔蛋白酶解液的美拉德反應(yīng)體系的還原力極顯著（p＜0.01）高于其他試驗(yàn)組，其值為1.918±0.012，是空白組滸苔蛋白酶解原液還原力(0.788±0.31)的2.43倍。

產(chǎn)生這一結(jié)果原因可能是五碳糖褐變速率的是六碳糖的10倍，單糖反應(yīng)速度比雙糖的快[10]。木糖是五碳糖，相對(duì)與六碳糖和雙糖來(lái)說(shuō)，其碳鏈較短，碳架空間位阻效應(yīng)小，故其參與美拉德反應(yīng)的活性大[11]，Wang Wen-qiong等[12]采用乳清分離蛋白與6種糖（木糖、果糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖）發(fā)生美拉德反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)乳清分離蛋白與木糖反應(yīng)體系的抗氧化活性最高，這與試驗(yàn)結(jié)果較為一致。

由表3可知，當(dāng)木糖單獨(dú)與滸苔蛋白酶解液進(jìn)行美拉德反應(yīng)時(shí)，與該反應(yīng)體系MPRs的顏色呈黃棕色，香味濃郁，明顯改善了滸苔本身的腥、澀味，其他試驗(yàn)組反應(yīng)體系MPRs的顏色均有所變淺，香味寡淡，滸苔本身的腥、澀味仍然不同程度存在。因此，綜上考慮，試驗(yàn)認(rèn)為木糖是與滸苔蛋白酶解液進(jìn)行美拉德反應(yīng)的適宜糖品種。

2.2 滸苔蛋白酶解液美拉德反應(yīng)工藝參數(shù)的優(yōu)化

對(duì)表4 L9(34)正交試驗(yàn)的結(jié)果，采用排隊(duì)評(píng)分法[13]先分別對(duì)滸苔蛋白酶解液MPRs的感官評(píng)價(jià)與還原力2指標(biāo)的優(yōu)劣，排序給出評(píng)分值，具體分析如下：對(duì)于還原力指標(biāo)，第7組試驗(yàn)樣品的指標(biāo)值最高，為2.513，排第1名，得10分，第1組試驗(yàn)樣品的指標(biāo)值最低，為2.133，排在最后，得1分；而其它組試驗(yàn)樣品該指標(biāo)值Xi的得分，視其與該指標(biāo)優(yōu)秀值的差異按比例打分，具體計(jì)算步驟如公式如（1）所示：

同理，對(duì)于感官評(píng)價(jià)，第6組試驗(yàn)樣品的分?jǐn)?shù)最高，為87.52，排第1名，得10分；第9號(hào)試驗(yàn)樣品的分?jǐn)?shù)最低，為53.91，排在最后，得1分，而其它組試驗(yàn)樣品的感官評(píng)價(jià)得分參考公式（1），將二指標(biāo)的排序評(píng)分值加和作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)再進(jìn)行最后的優(yōu)化，結(jié)果如表5、表6和表7所示。

從表6中的極差分析可以看出，各因素對(duì)滸苔蛋白酶解液MPRs的綜合排序分值的影響顯著性為A＞D＞B＞C，即反應(yīng)溫度＞反應(yīng)液＞木糖添加量＞反應(yīng)時(shí)間。最佳工藝方案是A2B2C3D2。

表3 糖的品種對(duì)滸苔蛋白酶解液美拉德反應(yīng)體系感官品質(zhì)的影響

表4 L9(34)正交試驗(yàn)方案與結(jié)果

表5 排隊(duì)評(píng)分法結(jié)果

2.2.1 驗(yàn)證性試驗(yàn)

由于A2B2C3D2在正交表中未體現(xiàn)，為了確定試驗(yàn)的客觀性，故以A2B2C3D2為條件，即以反應(yīng)溫度110 ℃，木糖濃度6.0%（w/v），反應(yīng)時(shí)間115 min，反應(yīng)液pH6.0為條件進(jìn)行擴(kuò)大性試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表明，所得滸苔蛋白酶解液美拉德反應(yīng)體系的平均還原力為2.523±0.079，感官評(píng)價(jià)值為87.91均高于正交試驗(yàn)的9個(gè)組別，且樣品的香氣豐滿、和諧，顏色呈誘人的黃棕色。

3 結(jié)論

影響美拉德反應(yīng)的各種因素有很多，包括參加反應(yīng)的糖、反應(yīng)溫度、時(shí)間及pH值等。糖的種類(lèi)對(duì)于提高美拉德產(chǎn)物抗氧化性是很重要的因素篩選，通常多糖分子量較大，反應(yīng)進(jìn)程慢，故研究選擇葡萄糖、木糖、果糖以及其復(fù)配進(jìn)行篩選試驗(yàn)，同時(shí)它們均具有安全性高、成本低的特點(diǎn)，是食品加工中普遍使用的原料。通過(guò)比較美拉德產(chǎn)物還原力大小，確定木糖更加適合與滸苔蛋白酶解液反應(yīng)。

表6 排隊(duì)分析法極差分析表

表7 正交試驗(yàn)方差分析表

結(jié)果表明，木糖為參與滸苔蛋白酶解液進(jìn)行美拉德反應(yīng)的理想還原糖品種；而且滸苔蛋白酶解液-木糖體系的美拉德反應(yīng)關(guān)鍵工藝參數(shù)的優(yōu)化組合為A2B2C3D2，即反應(yīng)溫度110 ℃，反應(yīng)時(shí)間115 min，反應(yīng)液pH6.0，木糖濃度6.0%（w/v），以此為條件進(jìn)行擴(kuò)大性驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得滸苔蛋白酶解液美拉德反應(yīng)體系的平均還原力可達(dá)2.523±0.079，相比于空白組的滸苔蛋白酶解液0.788提高了3.0倍，而且反應(yīng)體系的感官評(píng)價(jià)值為87.91，均高于正交試驗(yàn)的9個(gè)組別，試驗(yàn)樣品色澤呈誘人的黃棕色，香氣豐滿、和諧，并帶有淡淡的海鮮味，有效改善了滸苔原料原有的海藻腥味過(guò)重的缺陷。

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TS254.9

A

1007-550X（2016）05-0029-06

10.3969/j.issn.1007-550X.2016.05.001

海洋生物資源綜合加工及安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工程研究中心（612014043）。

2016-03-17

劉晨（1990-），女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。

呂峰（1964-），女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：天然產(chǎn)物綜合利用，農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。