江蘇省連云港市藥品檢驗(yàn)所（222006）姜燕

附表1 梯度洗脫參數(shù)

附表2 養(yǎng)陰扶正膠囊樣品中橙皮苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量測(cè)定結(jié)果

養(yǎng)陰扶正膠囊（蘇藥制字Z04000048）是由黃芪、白術(shù)、山藥、石斛、陳皮、防風(fēng)、天花粉七味中藥組成的復(fù)方制劑，具有養(yǎng)陰清熱，健脾益氣的功效，用于呼吸道反復(fù)感染兒童及肺炎后期的治療。陳皮和防風(fēng)為方中兩味主藥，陳皮有效成分主要為橙皮苷，防風(fēng)有效成分主要為升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷，因此對(duì)這兩味藥材的含量進(jìn)行測(cè)定意義較大。為了保證臨床用藥的安全有效，本文采用RP-HPLC梯度洗脫、檢測(cè)波長(zhǎng)切換法對(duì)制劑中的橙皮苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量進(jìn)行測(cè)定。

1 儀器與試藥

Aglilent 1200高效液相色譜儀；Mettler Toledo AE240電子天平（瑞士Mettler公司）；KQ-250DA型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司；橙皮苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供（批號(hào)依次為110721-201316，111522-200607，111523-201509；純度依次為95.3%，100%，100%），3批養(yǎng)陰扶正膠囊為醫(yī)院自制（批號(hào)依次為20150421，20150506，20150526）。磷酸為分析純，甲醇、乙腈為色譜純，水為二次蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK C18反相色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈為流動(dòng)相A，0.2%磷酸為流動(dòng)相B，梯度洗脫（見(jiàn)附表1）；流速：1.0ml·min-1；進(jìn)樣量：5μl；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：256nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取橙皮苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml各含0.12mg的溶液，分別精密量取3種對(duì)照品儲(chǔ)備液各5ml，置20ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。

附圖 養(yǎng)陰扶正膠囊，HPLC色譜圖。A 橙皮苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷混合對(duì)照品（1. 升麻素苷，2. 橙皮苷，3. 5-O-甲基維斯阿米醇苷） B 養(yǎng)陰扶正膠囊試品 C 陰性對(duì)照溶液

2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取約4g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入石油醚60～90℃50ml，回流1h，棄去石油醚，精密加入甲醇50ml，稱定重量，回流2h，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò)，取濾液，即得。

2.4 專屬性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果顯示，理論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算為9348，按升麻素苷峰計(jì)算為97833，按5-O-甲基維斯阿米醇苷峰計(jì)算為53498，養(yǎng)陰扶正膠囊樣品色譜圖中3種成分峰附近無(wú)明顯雜質(zhì)干擾，方法專屬性良好。色譜圖如附圖。

2.5 線性關(guān)系考察 分別配制定量限濃度、含量測(cè)定的50%濃度、含量測(cè)定的80%濃度、含量測(cè)定的100%濃度和含量測(cè)定的120%濃度的溶液。每個(gè)濃度的溶液連續(xù)進(jìn)樣3次并記錄圖譜。以平均峰面積Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品的濃度X（μg·ml-1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程：橙皮苷Y=5.9467X+0.6342，結(jié)果表明橙皮苷在0.5～144.8μg·ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9996)；升麻素苷Y=6.6378X+0.2398，結(jié)果表明升麻素苷在1.2～148.7μg·ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9994)；5-O-甲基維斯阿米醇苷Y=5.3053X+0.2241，結(jié)果表明5-O-甲基維斯阿米醇苷在2.3～138.3μg·ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9995)。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10μl，按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果得橙皮苷峰面積的RSD為0.4%(n=6)，升麻素苷峰面積的RSD為0.2%(n=6)，5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD為0.3%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液分別在0、2、4、6、8、10、12、24h進(jìn)樣，記錄色譜圖，橙皮苷峰面積的RSD為0.5%，升麻素苷峰面積的RSD為0.4%，5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD為0.4%，結(jié)果表明對(duì)照品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

取養(yǎng)陰扶正膠囊供試品溶液分別在0、2、4、6、8、10、12、24h進(jìn)樣，記錄色譜圖，橙皮苷峰面積的RSD為0.4%，升麻素苷峰面積的RSD為0.7%，5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD為0.6%，結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)樣品（批號(hào)：20150421），按供試品溶液制備方法平行制備6份，依次測(cè)定，計(jì)算得橙皮苷的平均含量為0.21%，結(jié)果的RSD為1.3%（n=6），升麻素苷的平均含量為0.12%，結(jié)果的RSD為1.6%（n=6），5-O-甲基維斯阿米醇苷的平均含量為0.16%，結(jié)果的RSD為1.2%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)：20150421）（橙皮苷的含量為0.21%，升麻素苷的含量為0.12%，5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量為0.16%）5份，每份2g，精密稱定。于5份樣品中依次精密加入濃度為32.6μg·ml-1的橙皮苷對(duì)照品溶液、33.4μg·ml-1的升麻素苷對(duì)照品溶液、31.7μg·ml-1的5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品溶液各1ml。照供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述高效液相色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。橙皮苷的平均回收率為102.1%，RSD=1.2%，升麻素苷的平均回收率為101.5%，RSD=1.4%，5-O-甲基維斯阿米醇苷的平均回收率為100.5%，RSD=1.6%。

2.10 樣品含量測(cè)定 取3批養(yǎng)陰扶正膠囊樣品，按供試品溶液制備項(xiàng)下方法分別制成供試品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中橙皮苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量，含量結(jié)果見(jiàn)附表2。

2.11 耐用性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)的養(yǎng)陰扶正膠囊樣品，按供試品溶液制備方法平行制備3份，考察4根不同商品規(guī)格的色譜柱Thermo C18(250mm×4.6mm，5μm)，Phenomenex C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，Agilent C18(250mm×4.6mm，5μm)，CAPCELL PAK C18反相色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)，測(cè)定并計(jì)算樣品中6-姜辣素的含量。結(jié)果顯示，不同色譜柱對(duì)姜皮樣品的含量測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯影響。

3 討論

對(duì)含量測(cè)定供試品溶液制備方法進(jìn)行考察：取同一批號(hào)樣品依次考察不同提取溶劑，不同提取時(shí)間，不同提取方法的橙皮苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量。結(jié)果表明橙皮苷在回流提取時(shí)含量最高，超聲提取結(jié)果不理想，不同提取方法雜質(zhì)干擾均較大，因此采用石油醚回流進(jìn)行預(yù)處理，減少雜質(zhì)對(duì)含量測(cè)定的干擾。參照《中國(guó)藥典》2010年版一部增補(bǔ)本中膽樂(lè)膠囊的提取方法，綜合考慮含量和操作的簡(jiǎn)便性，最終選定回流提取方法。