李 松，張國(guó)文

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047)

塑化劑鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl Phthalate,DBP)是廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，并存在于人們生活環(huán)境中的一種工業(yè)添加劑，為潛在有毒有害物質(zhì)。研究表明，DBP作為一種雌激素類似物，主要對(duì)人體具有生殖和發(fā)育毒性[1]，另外還有一定的基因毒性和致癌性[2]。近年，塑化劑威脅人類健康的事件屢見不鮮，人們也越來越關(guān)注其安全性問題。DNA是重要的遺傳物質(zhì)，在生命過程中發(fā)揮著重要作用，并掌控著遺傳信息的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[3]，此外，DNA還是許多小分子在體內(nèi)的作用靶點(diǎn)。小分子與DNA相互作用的研究能夠在分子水平提供其結(jié)合機(jī)制，以及小分子對(duì)DNA構(gòu)象的影響等信息，有助于深入了解有害小分子對(duì)人體的毒理效應(yīng)。

DBP在動(dòng)物體內(nèi)的毒性實(shí)驗(yàn)已有一些研究[1,2]，但在體外與DNA相互作用還未見報(bào)道。本文以小牛胸腺DNA(ctDNA)為作用靶點(diǎn)，采用體外實(shí)驗(yàn)，在模擬人體生理酸度(pH=7.4)條件下，應(yīng)用多種光譜學(xué)方法、化學(xué)計(jì)量學(xué)，以及分子模擬技術(shù)研究DBP與ctDNA相互作用，以期為認(rèn)識(shí)DBP與ctDNA的作用機(jī)制及DBP的毒性行為提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

F-7000型熒光光度計(jì)(日本，日立公司)；UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì)(日本，島津公司)；MOS 450型圓二色光譜儀(法國(guó)，Bio-Logie公司)；Nicolet-5700型紅外光譜儀，配置ATR附件(美國(guó)，Nicolet公司)；烏氏粘度計(jì)(上海前鋒橡塑玻璃制品廠)；pHS -3C型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)。

DBP標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.5%，阿拉丁試劑公司)用95%乙醇配制成2.0×10-3mol·L-1的儲(chǔ)備溶液； ctDNA(Sigma公司)用0.1 mol·L-1NaCl溶液溶解，其濃度利用ε260=6 600 L·mol-1·cm-1[4]確定為2.45×10-3mol·L-1，測(cè)得A260/A280>1.80，表明ctDNA已充分脫去蛋白質(zhì)；超螺旋pUC18質(zhì)粒DNA(索萊寶試劑公司)；0.05 mol·L-1pH=7.4的Tris-HC1緩沖溶液。上述溶液均保存于4 ℃冰箱中備用，其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1構(gòu)建紫外吸收光譜數(shù)據(jù)矩陣實(shí)驗(yàn)1：固定ctDNA溶液濃度為6.24×10-5mol·L-1，然后以每次2.0×10-6mol·L-1的濃度間隔加入31次DBP；實(shí)驗(yàn)2：保持DBP溶液濃度為8.0×10-5mol·L-1不變，依次滴加濃度間隔為2.08×10-6mol·L-1的ctDNA 31次，至最終濃度為6.45×10-5mol·L-1。每次加樣后均混勻靜置4 min，待充分反應(yīng)后進(jìn)行紫外光譜測(cè)定，記錄波長(zhǎng)215～350 nm數(shù)據(jù)，共136個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，得到了DctDNA(32×136) 和DDBP(32×136)兩個(gè)數(shù)據(jù)矩陣，組成[DctDNA,DDBP]矩陣。

1.2.2多元曲線分辨-交替最小二乘法(MCR-ALS) MCR-ALS是一種能夠分析數(shù)據(jù)矩陣、特征重疊光譜，并從復(fù)雜反應(yīng)系統(tǒng)中記錄每一個(gè)參與組分的響應(yīng)信號(hào)和濃度變化的有效方法[5]。該方法可以幫助我們從復(fù)雜反應(yīng)系統(tǒng)中得到更多本質(zhì)直觀的信息,如濃度變化、純光譜等。解析步驟如下：(1)構(gòu)建擴(kuò)展數(shù)據(jù)矩陣,通過奇異值分解(SVD)方法分析獲取體系中主要組分?jǐn)?shù)目；(2)用漸進(jìn)因子分析法(EFA)初步估計(jì)初始濃度，得到ALS迭代的初始濃度矩陣；(3)運(yùn)用ALS進(jìn)行迭代優(yōu)化。

對(duì)于二維光譜數(shù)據(jù)矩陣，根據(jù)以下代數(shù)模型進(jìn)行雙線性分解[6]:

D=C×ST+E

(1)

其中，D分別為光譜矩陣；C為濃度矩陣；ST為純光譜矩陣；E為誤差矩陣。

將1.2.1得到的光譜數(shù)據(jù)矩陣分解為：

(2)

1.2.3熒光光譜的測(cè)定分別在298、304和310 K三個(gè)溫度下向濃度為6.67×10-5mol·L-1的DBP溶液中連續(xù)滴加濃度間隔為6.24×10-6mol·L-1的ctDNA，在激發(fā)波長(zhǎng)為254 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為2.5 nm下，掃描溶液在280～400 nm的熒光發(fā)射光譜。為消除紫外重吸收和內(nèi)濾效應(yīng)，所有熒光數(shù)據(jù)均采用文獻(xiàn)方法[7]對(duì)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。

1.2.4瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)將超螺旋pUC18質(zhì)粒(DNA 3 μL，400 μg/mL) 用不同濃度的DBP處理并用Tris-HCl緩沖液稀釋至10 μL。在37 ℃水浴中孵化24 h后加入上樣緩沖溶液(包含0.03%溴酚藍(lán)、0.03%二甲苯藍(lán)和30%甘油)。準(zhǔn)備1.0% 瓊脂糖凝膠，用GoldView 溶液染色，放入含有1×Tris-乙酸-EDTA緩沖液中，將樣品加入加樣孔中，在80 V電壓條件下電泳30 min，之后取出凝膠進(jìn)行紫外成像。

1.2.5分子模擬從 Protein Data Bank 庫獲取B型DNA的結(jié)構(gòu)(PDB ID:453D)，對(duì)接運(yùn)行前對(duì)DNA進(jìn)行去水、加氫和Gasteiger 電荷修飾。配體DBP模型通過SYBYL×1.1軟件構(gòu)建，并在MMFF94力場(chǎng)使用MMFF94電荷將其能量最小化優(yōu)化[8]。采用Autodock 4.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接(總共100次對(duì)接實(shí)驗(yàn))，并用Lamarckian Genetic Algorithm(LGA)算法完成對(duì)接計(jì)算，以2.0 ?的均方根偏差容量對(duì)100次對(duì)接結(jié)果進(jìn)行能量分析，獲得一系列的能量簇，取能量最低且次數(shù)最多的構(gòu)象進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 DBP與ctDNA相互作用的紫外吸收光譜

實(shí)驗(yàn)1為固定ctDNA濃度連續(xù)加入DBP，發(fā)現(xiàn)ctDNA位于259 nm處的特征吸收峰強(qiáng)度隨著DBP的加入緩慢增大并有一定的藍(lán)移，而位于230 nm附近的吸收強(qiáng)度有較大的增強(qiáng)(圖1A)。由實(shí)驗(yàn)2結(jié)果可見，DBP在230 nm和285 nm處有兩個(gè)特征吸收峰，隨著ctDNA濃度的增加，DBP在230 nm處吸光度先減小后略微增大(圖1B)，并且在259 nm處出現(xiàn)一個(gè)新峰。DBP與ctDNA光譜高度重疊，很難獲得兩者相互作用有價(jià)值的信息。

2.2 MCR-ALS解析紫外光譜數(shù)據(jù)矩陣

利用MCR-ALS法對(duì)光譜數(shù)據(jù)擴(kuò)展矩陣進(jìn)行分析，通過奇異值分解(SVD)確定反應(yīng)體系中的組分?jǐn)?shù)。所提取到的前4個(gè)特征值分別為112.53、61.41、59.24和7.58，可以預(yù)測(cè)到體系中存在3種主要組分，即DBP、ctDNA和DBP-ctDNA復(fù)合物。MCR-ALS算法解析[DctDNA,DDBP]數(shù)據(jù)矩陣得到了3種組分濃度變化趨勢(shì)圖，隨著DBP加入量的增加，DBP-ctDNA復(fù)合物的濃度逐漸增大，伴隨著ctDNA濃度逐漸減少(圖2A)。相反，當(dāng)向DBP溶液中加入ctDNA，DBP濃度逐漸降低而DBP-ctDNA復(fù)合物的濃度逐漸增加(圖2B)，并且解析出的各組分純光譜曲線(實(shí)線)與實(shí)際測(cè)得光譜曲線(虛線)較好地吻合(圖2C)，表明預(yù)測(cè)反應(yīng)體系中存在3種主要組分且其濃度變化趨勢(shì)是可靠的，組分間濃度變化直觀地顯示DBP與ctDNA發(fā)生相互作用形成了復(fù)合物。

2.3 ctDNA對(duì)DBP熒光光譜影響

當(dāng)熒光激發(fā)波長(zhǎng)為254 nm 時(shí)，DBP在316 nm處有一個(gè)較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰(圖3A)。隨著ctDNA的加入，DBP在316 nm的熒光強(qiáng)度顯著降低，表明ctDNA猝滅DBP的熒光，兩者發(fā)生了相互作用。

為了明確其猝滅機(jī)制，采用Stern-Volmer方程對(duì)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[9]：

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(3)

式中，F(xiàn)0和F分別為加入ctDNA前后DBP溶液的熒光強(qiáng)度;KSV為猝滅常數(shù);Kq為雙分子猝滅過程的速率常數(shù);[Q]為猝滅劑的濃度;τ0為沒有猝滅劑存在下的熒光分子平均壽命，約為10-8s[10]。

以F0/F對(duì)[Q]作圖(圖3B)，得到3個(gè)不同溫度下的猝滅常數(shù)值，見表1。隨著溫度的升高KSV的值逐漸減小，且猝滅速率常數(shù)Kq達(dá)到1012數(shù)量級(jí)，遠(yuǎn)大于最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)(2.0×1010L·mol-1·s-1)，表明ctDNA對(duì)DBP的熒光猝滅為單一靜態(tài)猝滅過程。

此外，由修正的Stern-Volmer方程分析熒光數(shù)據(jù)[11]：

(4)

以F0/(F0-F)對(duì)1/[Q]作圖，獲得結(jié)合常數(shù)值Ka(表1)，Ka隨著溫度升高而降低，表明溫度升高復(fù)合物穩(wěn)定性下降，這與靜態(tài)猝滅機(jī)制相符。

2.4 熱力學(xué)參數(shù)及作用力類型的確定

為進(jìn)一步了解DBP與ctDNA反應(yīng)熱力學(xué)過程，其熱力學(xué)參數(shù)可由Van’t Hoff 方程[12]求得，焓變?chǔ)Θ和熵變?chǔ)Θ分別為-14.03 kJ·mol-1和28.62 J·mol-1·K-1，表明該反應(yīng)為放熱，疏水作用和氫鍵是結(jié)合作用的主要驅(qū)動(dòng)力，且是一個(gè)自發(fā)過程[3,13]。

表1 三個(gè)溫度下的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)

Rais the correlation coefficient for theKSVvalues.Rbis the correlation coefficient for theKavalues.

2.5 ctDNA解鏈溫度及粘度測(cè)定

DNA的熔點(diǎn)(Tm)，即為DNA加熱發(fā)生解鏈?zhǔn)ヒ话肼菪Y(jié)構(gòu)時(shí)的溫度，也稱解鏈溫度。當(dāng)小分子嵌插于DNA堿基對(duì)當(dāng)中，DNA結(jié)構(gòu)變得更加穩(wěn)定，Tm則會(huì)明顯升高，而通過溝槽與靜電作用方式與DNA結(jié)合，Tm則不會(huì)有明顯變化[14]。圖4A顯示ctDNA與DBP-ctDNA復(fù)合物的Tm值沒有明顯的差異，表明DBP通過溝槽模式與ctDNA結(jié)合。

經(jīng)典嵌插劑嵌入DNA堿基對(duì)會(huì)引起堿基對(duì)間距增大，導(dǎo)致雙螺旋松弛，長(zhǎng)度變大，使得粘度明顯增大，而溝槽結(jié)合劑對(duì)DNA粘度無明顯影響[15]。圖4B顯示了DBP與小溝結(jié)合劑Hoechst33258一樣對(duì)于ctDNA粘度均無明顯影響，這是DBP與ctDNA通過溝槽模式結(jié)合的有力證據(jù)。

2.6 單、雙鏈ctDNA對(duì)DBP熒光猝滅

為探究DBP與ctDNA結(jié)合模式，采用雙鏈ctDNA(dsctDNA)與單鏈ctDNA(ssctDNA)分別對(duì)DBP進(jìn)行熒光猝滅實(shí)驗(yàn)。若小分子與ctDNA通過嵌插模式結(jié)合，dsctDNA更利于DBP的結(jié)合，其對(duì)DBP熒光猝滅的程度要強(qiáng)于要ssctDNA，而溝槽結(jié)合則相反[16]。圖5顯示，ssctDNA對(duì)DBP熒光的猝滅效應(yīng)明顯強(qiáng)于dsctDNA，進(jìn)一步表明DBP與ctDNA的溝槽結(jié)合方式。

2.7 結(jié)合位點(diǎn)

為測(cè)定DBP在ctDNA上的結(jié)合位點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)對(duì)加入DBP前后的ctDNA分別進(jìn)行了紅外光譜掃描。B型DNA在紅外光譜中1 717 cm-1、1 660 cm-1、1 610 cm-1和1 490 cm-1處的特征峰，分別對(duì)應(yīng)鳥于嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)的伸縮振動(dòng)。而1 222 cm-1和1 088 cm-1的特征峰則為磷酸骨架的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)和對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的[17]。隨著DBP比例的增大，T堿基和A堿基的峰位有明顯的移動(dòng)，分別從1 667 cm-1移動(dòng)到了1 659 cm-1，1 610 cm-1移動(dòng)到1 600 cm-1，而其他各個(gè)特征峰均沒有出現(xiàn)移動(dòng)(圖6)，表明DBP可能主要結(jié)合于ctDNA的A-T堿基富集區(qū)[18]。

2.8 ctDNA構(gòu)象變化

B型構(gòu)象的ctDNA 有兩個(gè)分別由右手螺旋結(jié)構(gòu)和堿基堆積引起的特征峰，即245 nm處的負(fù)峰和280 nm處的正峰。隨著DBP濃度的增大，ctDNA負(fù)峰增強(qiáng)、正峰減弱(圖7)，表明B型ctDNA結(jié)構(gòu)變得更為松散[19]。

2.9 DNA損傷檢測(cè)

采用瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)DBP對(duì)pUC18質(zhì)粒DNA可能的損傷。當(dāng)環(huán)狀超螺旋DNA進(jìn)行電泳時(shí)，可能出現(xiàn)3種形式，即Form Ⅰ(環(huán)狀)、Form Ⅱ(開環(huán)狀)和Form Ⅲ(線狀)，它們?cè)谀z中的遷移速率為Form Ⅰ>Form Ⅲ>Form Ⅱ[20]。電泳圖中并沒有出現(xiàn)除Form I外的其他條帶(圖8)，表明該濃度范圍內(nèi)DBP沒有造成DNA明顯損傷。

2.10 DBP與ctDNA的分子對(duì)接

通過Autodock軟件對(duì)整個(gè)DNA模型范圍完成100次模擬對(duì)接后，形成了由15個(gè)構(gòu)象能量簇構(gòu)成的能量圖(圖9(A))。從能量角度考慮，選取能量圖中能量最低，次數(shù)最多的DBP與ctDNA結(jié)合狀態(tài)進(jìn)行分析。圖9(B)顯示DBP與DNA的小溝富集區(qū)A-T堿基結(jié)合，且與DA5和DA6堿基形成了兩個(gè)氫鍵，分子模擬結(jié)果與紅外光譜實(shí)驗(yàn)相一致，進(jìn)一步確證了DBP與ctDNA溝槽結(jié)合模式。

3 結(jié)論

在模擬生理酸度(pH=7.4)條件下，聯(lián)合應(yīng)用MCR-ALS法結(jié)合多種光譜學(xué)以及分子模擬技術(shù)，研究了DBP與ctDNA的相互作用。結(jié)果表明，DBP能與ctDNA發(fā)生相互作用形成DBP-ctDNA復(fù)合物。ctDNA通過單一的靜態(tài)方式猝滅DBP的內(nèi)源熒光，疏水作用和氫鍵是兩者作用的主要驅(qū)動(dòng)力。DBP與ctDNA通過溝槽方式結(jié)合，且DBP主要作用于A-T堿基富集區(qū)，這種作用誘導(dǎo)B型ctDNA結(jié)構(gòu)變得更為松散，但未對(duì)質(zhì)粒DNA產(chǎn)生明顯損傷。研究結(jié)果為理解DBP與DNA的相互作用機(jī)制和DBP毒理效應(yīng)提供了有益的信息。