魏　靜，陳景瑞，苗　琳，王亞東，樊官偉

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津　300193）

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·中藥研究·

燈盞乙素對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥介質(zhì)分泌的影響*

魏靜，陳景瑞，苗琳，王亞東，樊官偉

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津300193）

［目的］研究燈盞乙素對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥的影響，初步探討其抗炎作用機(jī)制。［方法］用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測燈盞乙素對RAW264.7細(xì)胞活力的影響；用Griess法檢測燈盞乙素對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中一氧化氮（NO）生成的影響；用熒光素酶報告質(zhì)粒法檢測燈盞乙素對LPS誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）轉(zhuǎn)錄活性的影響；用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測燈盞乙素對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NF-κB靶基因腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）mRNA表達(dá)的影響。［結(jié)果］0.01～10 μmol/L的燈盞乙素處理24 h后對RAW264.7活力無顯著影響；1、10 μmol/L的燈盞乙素可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NO的生成及NF-κB轉(zhuǎn)錄活性；燈盞乙素可以不同程度的抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NF-κB靶基因TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的上調(diào)作用。［結(jié)論］燈盞乙素可能通過抑制NF-κB的活化及炎癥因子的表達(dá)發(fā)揮一定的抗炎作用。

燈盞乙素；炎癥；RAW264.7細(xì)胞；作用機(jī)制

炎癥是人體為了確保去除有害刺激并修復(fù)受損組織的一種防御反應(yīng)，據(jù)流行病學(xué)和臨床資料顯示，多數(shù)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中都伴有炎癥的發(fā)生，此外炎癥反應(yīng)還可引起一些自身免疫疾病或癌癥，并加速疾病的發(fā)展［1］，因此，研究開發(fā)具有抗炎作用的藥物意義重大。臨床證實，中國傳統(tǒng)中藥中具有抗炎作用的藥物眾多［2-3］，明確抗炎有效成分及探索抗炎作用機(jī)制成為學(xué)者們關(guān)注的焦點。桑白皮是?？粕僦参锔稍锏母?，具有平喘利尿、降糖降壓、鎮(zhèn)痛抗炎等功效，臨床用于肺熱咳喘，小便不利等癥的治療［4］。近年來關(guān)于桑白皮抗炎的報道日益增加，但其抗炎有效成分及機(jī)制還尚不明確。筆者以抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）轉(zhuǎn)錄活性為指標(biāo)，篩選桑白皮中有效單體成分時發(fā)現(xiàn)燈盞乙素顯示出較強(qiáng)的抗炎作用，并進(jìn)一步對其發(fā)揮抗炎作用可能的機(jī)制進(jìn)行了探討。

1　材料與方法

1.1材料RAW264.7細(xì)胞（小鼠腹腔單核巨噬細(xì)胞）購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；pGL4.32及pTk-Renila質(zhì)粒均由南開大學(xué)藥學(xué)院饋贈；LPS；熱滅活胎牛血清（HI-FBS）美國BI公司；NO（Nitric Oxide）檢測試劑盒及噻唑藍(lán)（MTT）試劑為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑及 Trizol為美國 Invitrogen公司產(chǎn)品；Dual-Luciferase報告基因檢測系美國 Promega公司；cDNA合成試劑盒（TaqMan Reverse Transcription Rengents）及聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增試劑盒（SYBR GREEN PCR Master Mix）為Roche公司產(chǎn)品；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量快速提取試劑盒為北京天根生物技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、胰酶為Hyclone公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%熱滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。待細(xì)胞處于對數(shù)生長期或接近鋪滿整個培養(yǎng)瓶底面后用細(xì)胞刮輕輕將細(xì)胞刮下，反復(fù)吹吸，形成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計數(shù)后，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，5%二氧化碳（CO2）、37℃的條件下培養(yǎng)，依細(xì)胞狀態(tài)以1∶3或1∶6進(jìn)行傳代。

1.3MTT實驗將RAW264.7細(xì)胞以1×104個每孔接種于96孔板，24 h后加入不同濃度的燈盞乙素（0.01、0.1、1、10 μmol/L）。待加藥處理72 h后，取出培養(yǎng)板，小心吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 5 mg/mL MTT試劑，37℃孵育4 h，小心吸棄上清液，每孔加入100 μL DMSO。振蕩器上振蕩15 min，于490 nm處檢測OD值。

1.4一氧化氮（NO）生成量檢測將RAW264.7細(xì)胞以2×105個每孔接種于24孔板，24 h后加入不同濃度的燈盞乙素（0.1、1、10 μmol/L）孵育2 h后加入1 mg/L的LPS孵育24 h，收集上清液離心后取上清液，按照試劑盒說明分別加入Griess ReagentⅠ和Ⅱ，于540 nm測定吸光度值。用標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值與溶度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，計算得到各待測樣品中NO的濃度。

1.5 細(xì)胞總RNA的提取和實時定量PCRRAW264.7細(xì)胞以2×106個每孔接種于6孔板。使用Trizol裂解法提取細(xì)胞總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg RNA反轉(zhuǎn)為cDNA第Ⅰ鏈，采用SYBR-Green染料摻入法進(jìn)行實時定量PCR，GAPDH為管家基因。引物序列見表1。

表1　基因引物序列Tab.1　Gene primer sequences

反應(yīng)條件為：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，40 cycles。

1.6轉(zhuǎn)染及熒光素酶活性檢測RAW264.7細(xì)胞以含10%熱滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液接種于96孔板，使得轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度為75%～90%按照Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑說明轉(zhuǎn)染pGL4.32及pTk-Renila質(zhì)粒。8 h后吸去上清液，加入含有不同濃度受試藥物孵育2 h，加入1 mg/L的LPS，同時設(shè)置空白對照組，刺激24 h后進(jìn)行熒光素酶活性檢測。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。實驗結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較若為方差不齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞活性檢測本實驗采用MTT法檢測了燈盞乙素對RAW264.7細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示0.01～10 μmol/L的燈盞乙素對RAW264.7細(xì)胞處理24 h后活力無顯著影響（見表2），后續(xù)研究選取0.1～10 μmol/L的燈盞乙素進(jìn)行實驗。

表2　燈盞乙素對RAW264.7細(xì)胞活力的影響（±s）Tab.2　Effects of scutellarin on viability of RAW264.7 cells （±s）

表2　燈盞乙素對RAW264.7細(xì)胞活力的影響（±s）Tab.2　Effects of scutellarin on viability of RAW264.7 cells （±s）

組別　細(xì)胞活力（%）對照組　100.00±5.17燈盞乙素組　97.51±4.58 97.81±3.83 103.25±7.16 100.76±6.37 n6 6濃度（μmol/L）-0.01 0.1 1 10

2.2燈盞乙素抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO的生成NO是近年來發(fā)現(xiàn)的一個重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)，具有重要的生物學(xué)意義，NO可參與多種炎癥信號傳導(dǎo)，與多種炎癥因子相互作用，在炎癥反應(yīng)的發(fā)生和信號傳導(dǎo)方面起著重要的作用。結(jié)果顯示，1、10 μmol/L的燈盞乙素可以顯著抑制由LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO生成（見表3），提示燈盞乙素具有較強(qiáng)的抗炎作用。

表3　燈盞乙素對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO生成的影響（±s）Tab.3　Effects of scutellarin on LPS-induced NO production in RAW264.7 cells（±s）

表3　燈盞乙素對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO生成的影響（±s）Tab.3　Effects of scutellarin on LPS-induced NO production in RAW264.7 cells（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與LPS組比，#P＜0.01。

組別對照組LPS組燈盞乙素組n6 6 6濃度　NO生成量（μmol/L）-4.92±0.27 1 μg/mL　22.37±0.81* 0.1 μmol/L　22.24±0.62 1 μmol/L　20.92±0.66#10 μmol/L　15.19±0.39#

2.3燈盞乙素抑制由LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的NF-κB靶基因mRNA的表達(dá)采用1 mg/L的LPS刺激 RAW264.7，24 h后腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。給予不同濃度燈盞乙素處理細(xì)胞24 h后，可不同程度抑制炎癥因子mRNA表達(dá)上調(diào)作用。其中，0.1～10 μmol/L的燈盞乙素均可顯著抑制TNF-α及IL-6 mRNA的表達(dá)上調(diào)作用，僅10 μmol/L的燈盞乙素可顯著抑制IL-1β mRNA的表達(dá)（見表4）。

2.4燈盞乙素抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性將載有NF-κB的重組報告基因質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒pTk-Renila共轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞8 h后，不同受試藥預(yù)處理2 h后給予1 mg/L 的LPS刺激24 h。只經(jīng)LPS處理組的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性顯著上調(diào)（P＜0.01）。而1、10 μmol/L的燈盞乙素可顯著抑制由LPS誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的上調(diào)作用（見表5）。

表4　燈盞乙素LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TNF-α，IL-1β，IL-6 mRNA表達(dá)的影響（±s）Tab.4　Effects of scutellarin on LPS-induced TNF-α，IL-1β，IL-6 mRNA expression in RAW264.7 cells （±s）

表4　燈盞乙素LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TNF-α，IL-1β，IL-6 mRNA表達(dá)的影響（±s）Tab.4　Effects of scutellarin on LPS-induced TNF-α，IL-1β，IL-6 mRNA expression in RAW264.7 cells （±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與LPS組比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別IL-1β mRNA相對表達(dá)對照組LPS組燈盞乙素組n　4 4 4 IL-6 mRNA相對表達(dá)-　1.00±0.09　1.00±0.05　1.00±0.04 1 μg/mL　3.58±0.36*　18.36±1.37*　4.51±0.49* 0.1 μmol/L　2.03±0.29#　17.90±1.69　3.55±0.26##1 μmol/L　2.68±0.18##　17.04±0.54　3.77±0.18##10 μmol/L　3.09±0.23##　6.80±1.08##3.25±0.34##濃度　TNF-α mRNA相對表達(dá)

表5　燈盞乙素對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響（±s）Tab.5　Effects of scutellarin on LPS-induced NF-κB activity in RAW264.7 cells（±s）

表5　燈盞乙素對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響（±s）Tab.5　Effects of scutellarin on LPS-induced NF-κB activity in RAW264.7 cells（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與LPS組比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別對照組LPS組燈盞乙素組n4 4 4濃度　NF-κB熒光素酶-103.86±17.42 1 μg/mL　433.09±44.48* 0.1 μmol/L　429.61±42.29 1 μmol/L　371.65±13.55#10 μmol/L　299.98±25.65##

3　討論

桑白皮含有多種化學(xué)成分，因而具有多種藥效作用。本實驗所采用的燈盞乙素由桑白皮中提取分離而得。先前的研究顯示燈盞乙素具有增加腦血流量、改善腦部血液循環(huán)、提高機(jī)體耐氧能力、促進(jìn)纖溶活性及良好的溶栓功效，抗肝臟及肺的纖維化等多種藥理作用。臨床上多用于急性腦梗死，缺血性腦卒中和冠心病等心腦血管疾病的治療［5-6］。近年來的研究顯示燈盞乙素可通過抑制腦內(nèi)炎癥反應(yīng)發(fā)揮腦保護(hù)作用。該保護(hù)作用可能是燈盞乙素通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4（TLR4）、p65、TNF-α、IL-1β、IL-18、Bax的表達(dá)而實現(xiàn)的［7］。炎癥是機(jī)體抵御外界傷害和組織損傷的一種非常復(fù)雜的病理過程，大量的研究均表明炎癥與許多疾病的發(fā)生發(fā)展都密切相關(guān)，對急性炎癥和慢性炎癥加以抑制，將有效減緩疾病的發(fā)展。巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的吞噬清除凋亡細(xì)胞的能力。LPS為革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，因與機(jī)體一系列病、生理過程如促進(jìn)炎癥因子轉(zhuǎn)錄和表達(dá)等相關(guān)，被認(rèn)為是造成全身性炎癥的重要原因［8-9］。RAW264.7可在LPS的刺激下分泌TNF-α，IL-1β，IL-6，NO，前列腺素E2（PGE2）等不同的促炎癥因子對炎癥進(jìn)行調(diào)節(jié)［1］，它是目前有關(guān)炎癥介質(zhì)研究中應(yīng)用最廣，最為高效的模型［10］。

在炎癥反應(yīng)中NO被認(rèn)為是一種重要的介質(zhì)和調(diào)節(jié)因子［11-12］，在活化的炎癥細(xì)胞中NO可由一氧化氮合酶催化L-精氨酸產(chǎn)生。NO在體內(nèi)易被氧化成亞硝酸鹽，酸性條件下與重氮鹽磺胺發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。本實驗應(yīng)用Griess法檢測細(xì)胞上清液中亞硝酸鹽含量從而表征NO的生成量。NO可通過抑制黏附因子表達(dá)，抑制中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及抑制肥大細(xì)胞脫顆粒等發(fā)揮抗炎作用。本實驗發(fā)現(xiàn)燈盞乙素體外毒性小，1、10 μmol/L的燈盞乙素可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NO生成。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-6、IL-1β作為炎癥敏感指標(biāo)，可有效反應(yīng)炎癥的嚴(yán)重程度。TNF-α作為重要的促炎因子，可激活炎癥細(xì)胞，上調(diào)黏附因子，氧自由基和NO，還可作用于內(nèi)皮細(xì)胞增加毛細(xì)血管通透性。IL-6可有激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可直接激活炎癥細(xì)胞，誘導(dǎo)急性期蛋白的合成［13］。IL-6可促進(jìn)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）活化，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子從而加重炎癥反應(yīng)［14］。然而，當(dāng)上述促炎癥因子分泌過多時，可在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中激發(fā)一系列的級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)其他多種炎癥因子的表達(dá)［15］。因此，抑制促炎因子的生成，可有效降低炎癥反應(yīng)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，燈盞乙素可有效降低由LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 TNF-α，IL-1β，IL-6 mRNA的表達(dá)。大量研究表明NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是炎癥反應(yīng)信號通路中最重要的下游通路，LPS作用于TLR4后導(dǎo)致其活化，激活一系列的激酶引起NF-κB的磷酸化，活化后的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄［16］。TNF-α，IL-1β，IL-6作為NF-κB的下游靶基因，燈盞乙素對其抑制作用可能是通過抑制NF-κB活化而實現(xiàn)的。本實驗采用雙熒光素酶報告基因法證實LPS可增加RAW264.7的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，而燈盞乙素可顯著抑制該種上調(diào)作用。提示燈盞乙素可能通過抑制NF-κB的活化入核發(fā)揮抗炎作用。燈盞乙素是否會通過其他途徑發(fā)揮抗炎作用還有待于進(jìn)一步實驗研究。

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（本文編輯：高杉，馬英）

Effect of scutellarin on the secretion of inflammatory mediators of RAW264.7 cell induced by LPS

WEI Jing，CHEN Jing-rui，MIAO Lin，WANG Ya-dong，F(xiàn)AN Guan-wei
（Tianjin Modern Chinese Medicine Key Laboratory，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To study the effect of scutellarin on RAW264.7 cell inflammation induced by LPS，and to explore the mechanism of its anti-inflammatory effect.［Methods］To detect effect of scutellarin on RAW264.7 cell viability by MTT，detect effect of scutellarin on NF-κB transcription activity induced by LPS，detect scutellarin on TNF-α，IL-1β，IL-6 mRNA expression of NF-κB target gene in RAW264.7 cell induced by LPS.［Results］It had no obvious significance on RAW264.7 by 0.01～10 μmol/L scutellarin treatment for 24 h；1，10 μmol/L scutellarin could significantly inhibit NO generation and NF-κB transcription activity induced by LPS；scutellarin could inhibit up-regulation of TNF-α，IL-1β，IL-6 mRNA of NF-κB target gene in RAW264.7 cell induced by LPS.［Conclusion］Scutellarin has certain anti-inflammatory effect by inhibition NF-κB activation and inflammatory factor expression.

scutellarin；inflammation；RAW264.7 cell；mechanism

R285.5

A

1672-1519（2016）08-0487-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.08.11

2016-04-26）

國家科技支撐計劃課題（2014BAI05B01）。

魏靜（1989-），女，碩士研究生，從事中藥藥理研究。

樊官偉，E-mail：fgw1005@hotmail.com。