程　實，王長坤，張　梁，*，李　贏，石貴陽，楊盛榮，陳國安

（1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；3.無錫江大百泰科技有限公司，江蘇 無錫 214122）

復合重組磷脂酶用于大豆油脫膠的工藝優(yōu)化

程實1，2，王長坤1，2，張梁1，2，*，李贏2，石貴陽2，楊盛榮3，陳國安3

（1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；3.無錫江大百泰科技有限公司，江蘇 無錫 214122）

利用實驗室前期構建的重組大腸桿菌所產磷脂酶A1（phospholipase A1，PLA1）和磷脂酶C（phospholipase C，PLC）進行大豆油酶法脫膠研究，探討自主開發(fā)重組酶進行酶法脫膠的可行性。以諾維信商品酶Lecitase Ultra?為對照，研究酶法脫膠反應溫度、反應pH值、反應時間、攪拌速率、復合磷脂酶添加量工藝參數(shù)對大豆油脫膠的影響，并采用正交試驗對脫膠工藝條件進行優(yōu)化。研究結果表明，大豆油復合酶法脫膠的最佳工藝參數(shù)為：反應溫度45 ℃、反應pH 6.5、反應時間3 h、攪拌速率300 r/min、PLA1和PLC添加量分別為7 940 U/kg和23 130 U/kg。復合磷脂酶對大豆油脫膠的效果與諾維信商品酶Lecitase Ultra?基本一致，大豆油磷含量可降至5 mg/kg以下，能夠滿足物理精煉的要求，為進一步開發(fā)具有知識產權的食品級油脂脫膠用酶制劑產品提供了理論依據。

重組大腸桿菌；復合磷脂酶；大豆油；酶法脫膠；正交試驗

在油脂加工工藝中，油脂脫膠是油脂精煉過程中一道重要的工序，脫膠主要是脫除毛油中的磷脂，良好的脫膠效果是油脂物理精煉的前提，若脫膠不完全，則會加重后續(xù)工藝的負擔，造成設備結焦損壞，影響精煉的經濟效益和油脂產品的質量［1］。

油脂中的磷脂主要分為水化磷脂和非水化磷脂兩大類，傳統(tǒng)脫膠方法如水化脫膠等可以除去水化磷脂，但很難除去非水化磷脂。而酶法脫膠技術通過添加磷脂酶，使非水化磷脂水解成溶血性磷脂，溶血性磷脂具有良好的親水性，可以利用水化方法去除。此法減少了精煉過程中酸堿的用量和廢水的排放量，提高了生產效率，降低了經濟成本［2-3］。如今隨著人們對環(huán)保要求的進一步提高和酶工程技術的飛速發(fā)展，尤其利用現(xiàn)代生物技術開發(fā)出一些具有更優(yōu)性能的酶［4-5］，酶法脫膠日益顯示出明顯優(yōu)勢和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

油脂脫膠工業(yè)中應用最為廣泛的是磷脂酶A1（phospholipase A1，PLA1）和磷脂酶C（phospholipase C，PLC），近年來該領域的研究主要包括對產磷脂酶微生物的篩選和構建［6-7］，以及對新型磷脂酶脫膠工藝條件的優(yōu)化［8］。磷脂酶應用于油脂脫膠的研究受到越來越多的關注，尤其是可以利用發(fā)酵法對微生物來源的磷脂酶進行大規(guī)模生產以后［9］，國外方面越來越深入地研究了磷脂酶的植物油脫膠應用［10-12］，并開發(fā)出了多種脫膠效果理想的磷脂酶，主要有諾維信公司推出的Lecitase Novo［13］和Lecitase Ultra［14］，以及帝斯曼公司生產的PLC產品Purifine［15］等。國內也有一些自主研發(fā)的磷脂酶應用于油脂脫膠的研究［16］，但存在一些不足：大多數(shù)PLA1脫膠時間較長，至少需4 h；多數(shù)PLC因其只對磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺具有較高的特異性，而對磷脂酰肌醇等活性較低，致使脫膠不完全［17］。本研究使用實驗室自主開發(fā)的重組磷脂酶PLA1［18］和PLC［19］復配后制成復合酶，并通過設計正交試驗探索了復合酶對大豆毛油脫膠的最優(yōu)條件，以期綜合兩種磷脂酶各自的脫膠優(yōu)勢，實現(xiàn)脫膠效率和脫膠效果的雙重提升，從而為進一步完善酶法脫膠工藝及其工業(yè)應用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

重組菌E. coli BL21（DE3）/pET28a-pla和E. coli BL21（DE3）/pET28a-plcH為本實驗室保藏。

1.1.2培養(yǎng)基配制

PLA1發(fā)酵種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖8 g/L，25 mmol/L Na2HPO4，25 mmol/L KH2PO4，50 mmol/L NH4Cl，5 mmol/L Na2SO4，2 mmol/L MgSO4，自然pH值。1×105Pa高壓滅菌20 min。

PLA1發(fā)酵誘導培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，甘油5 g/L，葡萄糖0.5 g/L，乳糖2 g/L，25 mmol/L Na2HPO4，25 mmol/L KH2PO4，50 mmol/L NH4Cl，5 mmol/L Na2SO4，2 mmol/L MgSO4，自然pH值，1×105Pa高壓滅菌20 min。

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，自然pH值，1×105Pa高壓滅菌20 min。

1.1.3原料與試劑

大豆毛油 中糧東海糧油工業(yè)有限公司；Lecitase Ultra? 美國Novozymes公司；卡那霉素 美國Amresco公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

V-1200分光光度計 尤尼科上海儀器有限公司；VCX-750型超聲波細胞破碎儀 美國Sonic & Materials有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇榮華儀器制造有限公司；CT16RE型高速冷凍離心機 日立中國有限公司；強力電動攪拌器 常州市國華電器有限公司；KSW型馬弗爐 上海電理儀器廠。

1.3方法

1.3.1粗酶液的制備

將E. coli BL21（DE3）/pET28a-pla菌株活化后接種至含卡納霉素（終質量濃度100 mg/L）的種子培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min的搖床振蕩培養(yǎng)8～10 h；按5%接種量轉接至含卡納霉素（終質量濃度100 mg/L）的發(fā)酵誘導培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min的搖床培養(yǎng)24 h，取發(fā)酵液于6 000 r/min離心3 min，收集離心上清液即為PLA1粗酶液［18］。

將E. coli BL21（DE3）/pET28a-plcH菌株活化后接入到30 mL含卡納霉素（終質量濃度100 mg/L）的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)10 h，以5%轉接量接種至50 mL含卡納霉素（終質量濃度100 mg/L）的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)4 h后，添加乳糖至終質量濃度為0.05 g/L，在25 ℃、150 r/min誘導培養(yǎng)14 h。取發(fā)酵液于6 000 r/min離心10 min，收集細胞，并用25 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl緩沖液重懸進行超聲破碎。破碎液經8 000 r/min離心20 min，收集上清液，即為PLC粗酶液［19］。

PLA1和PLC粗酶液的實測酶活性［20-21］分別為662 U/mL和826 U/mL。其中，PLA1酶活單位定義為：pH 7.0、40 ℃條件下，每分鐘產生1 μmol棕櫚酸所需的酶量；PLC酶活單位定義為：pH 7.2、37 ℃條件下，每分鐘水解對硝基磷酸膽堿產生1 nmol對硝基苯酚所需的酶量。

1.3.2磷含量測定

取油樣約5 mL，在10 000 r/min條件下離心10 min，取3 g上層油樣測定磷含量，油脂中磷含量的測定參照GB/T 5537—2008《糧油檢驗：磷脂含量的測定》。

1.3.3油相pH值的測定

取酸處理后的油水混合物40 g置于50 mL離心管，5 000 r/min離心10 min，棄去上層油相，向沉淀中加入5 mL蒸餾水，充分攪拌混合后，5 000 r/min離心10 min，取離心管中水相測定pH值，采用油相pH 5左右時的經驗校正公式計算出油相pH值，油相pH值為離心管中水相測定pH值減去0.3。

1.3.4酶法脫膠工藝

準確稱取50 g大豆毛油于250 mL具塞三角燒瓶中，水浴加熱至80 ℃，加入質量分數(shù)為45%的檸檬酸60 μL，在80 ℃水浴500 r/min條件下進行酸處理20 min。結束后冷卻至預設的溫度，加入質量分數(shù)4% NaOH溶液混勻調節(jié)pH值，再加入蒸餾水和磷脂酶的粗酶液，于10 000 r/min高剪切混合1 min。然后在一定的攪拌速率和溫度條件下進行酶解脫膠，定時取樣，將樣品放于90 ℃熱水中滅酶10 min，再進行含磷量分析。酶添加量定義為每千克大豆毛油脫膠所加入PLA1或PLC的酶活單位，單位為U/kg。

1.3.5單一酶脫膠實驗

分別研究PLA1、PLC和諾維信商品酶Lecitase Ultra?應用于大豆油酶法脫膠過程中，加水量、反應溫度、反應pH值、反應時間、攪拌速率、酶添加量因素對脫膠效果的影響，并確定了PLA1、PLC及Lecitase Ultra?單一酶大豆毛油脫膠的最適反應條件。

1.3.6復合酶脫膠單因素試驗

1.3.6.1反應溫度對復合酶脫膠的影響

在復合酶體系中PLA1和PLC添加量分別13 240 U/kg和16 520 U/kg、pH 6.0、攪拌速率250 r/min的條件下，分別于35、40、45、50、55、60、65 ℃脫膠反應3 h后，取樣測定脫膠后大豆油的含磷量，考察反應溫度對復合酶脫膠效果的影響。

1.3.6.2反應pH值對復合酶脫膠的影響

在復合酶體系中PLA1和PLC添加量分別13 240 U/kg和16 520 U/kg、反應溫度50 ℃、攪拌速率250 r/min條件下，pH值分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5時，脫膠反應4 h，取樣測定脫膠后大豆油的含磷量，考察反應pH值對復合酶脫膠效果的影響。

1.3.6.3反應時間對復合酶脫膠的影響

在復合酶體系中PLA1和PLC添加量分別13 240 U/kg和16 520 U/kg、反應溫度50 ℃、反應pH 7.0、攪拌速率250 r/min的條件下進行脫膠實驗，分別在脫膠反應0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h時取樣測定大豆油磷含量，考察反應時間對復合酶脫膠效果的影響。

1.3.6.4攪拌速率對復合酶脫膠的影響

在復合酶體系中PLA1和PLC添加量分別13 240 U/kg和16 520 U/kg、反應溫度50 ℃、反應pH 7.0、反應時間3 h的條件下，分別使用100、150、200、300、350、400 r/min的攪拌速率進行脫膠反應，反應結束后取樣測定大豆油磷含量，考察攪拌速率對復合酶脫膠效果的影響。

1.3.6.5復合酶添加量對復合酶脫膠的影響

將酶活分別為662 U/mL和826 U/mL的PLA1和PLC粗酶液等體積混合后制成復合酶，在反應溫度50 ℃、反應pH 7.0、反應時間3 h、攪拌速率300 r/min的條件下，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL的復合酶液，對應體系中PLA1和PLC添加量分別為6 620 U/kg和8 260 U/kg（0.5 mL）、13 240 U/kg和16 520 U/kg（1.0 mL）、19 860 U/kg和24 780 U/kg（1.5 mL）、26 480 U/kg和33 040 U/kg（2.0 mL）、33 100 U/kg和41 300 U/kg（2.5 mL）、39 720 U/kg和49 560 U/kg（3.0 mL）、46 340 U/kg和57 820 U/kg（3.5 mL），進行脫膠實驗，反應結束后取樣測定大豆油磷含量，考察復合酶添加量對脫膠效果的影響。

1.3.6.6復合酶體積比對復合酶脫膠的影響

在復合酶添加總體積2 mL、反應溫度50 ℃、反應pH 7.0、反應時間3 h、攪拌速率300 r/min的條件下，將酶活分別為662 U/mL和826 U/mL的PLA1和PLC粗酶液按照體積比1∶9、2∶8、3∶7、4∶5、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1混合，配成總體積2 mL的復合酶，考察復合酶體積比對脫膠效果的影響。

1.3.7正交試驗

通過以上對復合酶脫膠條件的探索，為得到一個最佳的脫膠條件組合，選取反應溫度、反應pH值、攪拌速率3 個因素作為變量，各自選取4 個水平，以脫膠油中磷含量作為脫膠效果考察指標，進行L16（43）正交試驗，試驗因素與水平見表1。

表1　L316（4）正交試驗因素與水平Table1　Factors and levels used for L316（4） orthogonal array design

1.4數(shù)據處理

實驗均做3 次以上平行，取平均值，數(shù)據使用Origin Pro 8.0軟件作圖，使用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行處理。不同平均值之間利用最小顯著差異法進行差異顯著性檢驗，實驗數(shù)據誤差以標準差表示。

2　結果與分析

2.1單一酶脫膠最適反應條件

表2　不同磷脂酶大豆油脫膠的最適反應條件Table2　Optimal conditions for enzymatic degumming using different phospholipases

通過實驗結果分析，分別確定了PLA1、PLC及Lecitase Ultra?應用于大豆毛油脫膠的最適反應條件，如表1所示。其中，在PLA1和PLC實驗中，本研究得到結論是加水量（體積分數(shù)）為0%～4%的變化對脫膠效果無顯著影響，分析原因主要是因為粗酶液所帶入的含水量已使反應體系形成較大的油水界面面積，當繼續(xù)添加蒸餾水（0%～4%）時，一方面可能會增大反應面積而提高催化效率，另一方面也可能會因加水量過多而形成乳化體系，導致部分水化磷脂無法脫除，上述兩方面因素使得加水量的變化對脫膠效果無顯著影響。故對于PLA1、PLC及其復合酶的脫膠實驗均不再額外添加水。在上述各自最適反應條件下，PLA1、PLC以及Lecitase Ultra?的脫膠效果，如圖1所示。

圖1　不同磷脂酶大豆毛油酶法脫膠效果Fig.1　Degumming efficiency of different phospholipases

由圖1可知，Lecitase Ultra?脫膠后油中磷含量降至5 mg/kg以下，脫膠效果理想，酶用量也較少。而PLA1和PLC脫膠后油中磷含量都在10 mg/kg以上，雖然隨著反應時間的繼續(xù)進行，其磷含量會有所下降，但下降幅度已不明顯。說明單一使用PLA1、PLC無法達到和商品酶Lecitase Ultra?對大豆毛油相同的脫膠水平，脫膠處理后油脂的磷含量仍較高。

2.2復合酶脫膠單因素試驗結果

2.2.1反應溫度對復合酶脫膠的影響

由圖2可見，在40～50 ℃時復合酶脫膠效果較好，50 ℃之后，隨著反應溫度的升高，磷含量呈上升趨勢，說明酶逐漸失活，可知脫膠的最適溫度范圍在45～55 ℃之間，其中50 ℃時的磷含量下降為10.36 mg/kg，磷含量顯著低于其他反應溫度（P＜0.05），故以下其他單因素試驗的溫度選擇為50 ℃。

圖2　反應溫度對復合酶脫膠的影響Fig.2　Effects of reaction temperature on degumming efficiency with mixed phospholipases

2.2.2反應pH值對復合酶脫膠的影響

圖3　反應pH值對復合酶脫膠的影響Fig.3　Effects of pH on degumming efficiency with mixed phospholipases

如圖3所示，反應pH值對復合酶脫膠有較大影響，pH值過低或過高都不利于酶反應的進行，當pH值在6.0～7.5之間時，磷含量較低，脫膠效果較好，而在pH 7.0時磷含量達到最低，顯著低于其他反應pH值（P＜0.05），故選取7.0作為脫膠單因素試驗的最適反應pH值。

2.2.3反應時間對復合酶脫膠的影響

圖4　反應時間對復合酶脫膠的影響Fig.4　Effects of reaction time on degumming efficiency with mixed phospholipases

由圖4可知，0.5～2.5 h內，油樣磷含量明顯下降，之后隨著時間的延長，磷含量下降速率減緩，3 h后油樣磷含量基本趨于穩(wěn)定，雖然磷含量繼續(xù)降低，但已不明顯。為了酶反應的充分進行和脫膠效果的穩(wěn)定，確定最適反應時間為3 h。

圖5　攪拌速率對復合酶脫膠的影響Fig.5　Effects of stirring speed on degumming efficiency with mixed phospholipases

2.2.4攪拌速率對復合酶脫膠的影響由圖5可見，在攪拌速率100～300 r/min范圍內，隨著攪拌速率的增加，磷含量明顯下降，這是因為攪拌速率越大，水在油相中分散的越均勻，反應界面越大，當攪拌速率加快至300 r/min時，油中磷含量降至最低，顯著低于其他攪拌速率條件下（P＜0.05）。但繼續(xù)加快攪拌速率時，磷含量開始逐漸增加，一方面可能是因為高速攪拌形成的強剪切力影響了酶的活性，另一方面可能是因為高速攪拌下形成的乳化體系會造成水化磷脂的殘留，從而影響了脫膠效果。故綜合考慮以下單因素試驗中的攪拌速率定為300 r/min。

2.2.5復合酶添加量對復合酶脫膠的影響

圖6　復合酶添加量對酶法脫膠的影響Fig.6　Effects of dosages of enzymes （PLA1and PLC） on degumming efficiency with mixed phospholipases

如圖6所示，在相同的反應條件下，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0 mL的復合酶，油脂磷含量變化顯著（P＜0.05），2 mL的復合酶可使油脂磷含量降至6.57 mg/kg，隨著復合酶添加量的增加，脫膠后油脂的磷含量下降已不明顯，故從經濟性的角度考慮，取復合酶添加量為2.0 mL。

2.2.6復合酶體積比對復合酶脫膠的影響

表3　復合酶體積比對復合酶脫膠的影響Table3　Effects of ratio of PLA1to PLC on degumming efficiency

由表3可知，復合酶體積比對復合酶脫膠效果有較大影響，當復合酶體系中PLA1-PLC體積比為3∶7，即復合酶中PLA1和PLC添加量分別為7 940 U/kg和23 130 U/kg時，油脂中磷含量降至最低。

2.3復合酶脫膠正交試驗結果

在復合酶體系中PLA1和PLC添加量分別為7 940 U/kg和23 130 U/kg、反應時間3 h條件下，選取反應溫度、反應pH值、攪拌速率3 個因素作為變量，各自選取4 個水平，以脫膠油中磷含量作為脫膠效果考察指標，選用L16（43）正交表安排試驗，試驗設計與結果見表4。

表4　正交試驗設計與結果Table4　Design and results of orthogonal array experiments

通過表4中正交試驗因素指標分析發(fā)現(xiàn)，3 個因素的脫膠效果影響順序依次是反應溫度＞攪拌速率＞反應pH值，由正交試驗結果可以看出優(yōu)化后的組合為A1B2C3，即反應溫度45 ℃、反應pH 6.5、攪拌速率300 r/min，在此條件下，復合酶中PLA1和PLC添加量分別為7 940 U/kg和23 130 U/kg，進行大豆毛油脫膠實驗，反應3 h后測定油中的磷含量為3.60 mg/kg?？梢钥闯鰪秃厦笇Υ蠖姑偷拿撃z效果與諾維信商品酶Lecitase Ultra?基本一致。

3　結 論

本研究將重組大腸桿菌來源的復合磷脂酶應用于大豆毛油的脫膠。通過單因素和正交試驗，確定了該復合酶用于大豆油脫膠的最優(yōu)工藝條件為：反應溫度45 ℃、反應pH 6.5、反應時間3 h，攪拌速率300 r/min，PLA1和PLC添加量分別7 940 U/kg和23 130 U/kg。結果顯示使用PLA1和PLC復合酶用于大豆油脫膠，綜合了兩種磷脂酶各自的脫膠優(yōu)勢，實現(xiàn)了脫膠效率和脫膠效果的雙重提升，經過脫膠的油脂磷含量為3.60 mg/kg，達到了油脂物理精煉的要求，與諾維信磷脂酶產品Lecitase Ultra?的脫膠效果基本一致。為進一步開發(fā)具有知識產權的食用油脫膠用酶制劑產品提供了理論依據。

［1］ NARAYANA T， KAIMAL B， VALI S， et al. Origin of problems encountered in rice bran oil processing［J］. European Journal of Lipid Science and Technology， 2002， 104（4）: 203-211. DOI:10.1002/1438-9312（200204）104:4＜203::AID-EJLT203＞3.0.CO；2-X.

［2］ DIJKSTRA A. Enzymatic degumming［J］. European Journal of Lipid Science and Technology， 2010， 112（11）: 1178-1189. DOI:10.1002/ ejlt.201000320.

［3］ ROY S， RAO B， PRASAD R. Enzymatic degumming of rice bran oil［J］. Journal of the American Oil Chemists Society， 2002， 79（8）: 845-846. DOI:10.1007/s11746-002-0568-5.

［4］ FU J H， HUANG H Q， MENG K， et al. A novel cold-adapted phospholipase A1from Serratia sp xjF1: gene cloning， expression and characterization［J］. Enzyme and Microbial Technology， 2008， 42（2）: 187-194. DOI:10.1016/j.enzmictec.2007.09.004.

［5］ SONG J， KIM M， RHEE J. Cloning and expression of the gene encoding phospholipase A1from Serratia sp MK1 in Escherichia coli［J］. Journal of Biotechnology， 1999， 72（1/2）: 103-114. DOI:10.1016/S0168-1656（99）00096-6.

［6］ NISHIHARA M， KAMATA M， KOYAMA T， et al. New phospholipase A1-producing bacteria from a marine fish［J］. Marine Biotechnology， 2008，10（4）: 382-387. DOI:10.1007/s10126-007-9074-5.

［7］ 長崎詠子， 深澤徹也， 小野泰典. 新型磷脂酶C: 中國， CN101410513［P/OL］.［2006-03-10］. http://d.g.wanfangdata.com.cn/Patent_ CN200680053785.2.aspx.

［8］ BORA L. Characterization of novel phospholipase C from Bacillus licheniformis MTCC 7445 and its application in degumming of vegetable oils［J］. Applied Biochemistry and Microbiology， 2013，49（6）: 555-561. DOI:10.1134/S0003683813060197.

［9］ MARIA L D， VIND J， OXENB?LL K M， et al. Phospholipases and their industrial applications［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2007， 74（2）: 235. DOI:10.1007/s00253-006-0775-x.

［10］ YANG J G， WANG Y H， YANG B， et al. Degumming of vegetable oil by a new microbial lipase［J］. Food Technology and Biotechnology，2006， 44（1）: 101-104.

［11］ LOEFFLER F， PLAINER H， SPROESSLER B， et al. Vegetable oil enzymatic degumming process by means of aspergillus phospholipase: US， US6001640［P］. 1999.

［12］ CLAUSEN K. Enzymatic oil-degumming by a novel microbial phospholipase［J］. European Journal of Lipid Science and Technology， 2001， 103（6）: 333-340. DOI:10.1002/1438-9312（200106）103:6＜333::AID-EJLT333＞3.0.CO；2-F.

［13］ HASIDA M， TSUTSUMI N， HALKIER T， et al. Acidic phospholipase，production and methods using thereof: US， US6127137［P］. 2000.

［14］ KELLENS M， de GREYT W. Enzymatic oil recuperation process: US，US8435766［P］. 2013.

［15］ BARTON N. A new process for degumming: the use of phospholipase C to improve yields during refining of high phosphorus vegetable oils［C］//99th AOCS Annual Meeting & Expo. Seattle: 2008.

［16］ HUANG S， LIANG M L， XU Y H， et al. Characteristics and vegetable oils degumming of recombinant phospholipase B［J］. Chemical Engineering Journal， 2014， 237: 23-28. DOI:10.1016/ j.cej.2013.09.109.

［17］ 余榛榛， 常明， 劉睿杰， 等. 磷脂酶C在酶法脫膠中的研究進展［J］. 中國油脂， 2013， 38（7）: 19-22. DOI:10.3969/ j.issn.1003-7969.2013.07.006.

［18］ 延晉雷， 張梁， 顧正華， 等. 液化沙雷氏菌磷脂酶A1的克隆表達及乳糖自誘導發(fā)酵［J］. 生物工程學報， 2013， 29（6）: 853-856.

［19］ 趙金星， 張梁， 顧正華， 等. 重組大腸桿菌表達銅綠假單胞菌溶血性磷脂酶C［J］. 微生物學報， 2013， 53（3）: 259-268.

［20］ 高林. 微生物磷脂酶C檢測方法的研究進展［J］. 安徽農業(yè)科學， 2010， 38（23）: 12412-12413. DOI:10.3969/ j.issn.0517-6611.2010.23.038.

［21］ 趙夢夢， 薛正蓮， 黃祖耀， 等. 三種磷脂酶A1活力測定方法的比較［J］.食品與發(fā)酵科技， 2012， 48（3）: 74-77； 85. DOI:10.3969/j.issn.1674-506X.2012.03.020.

Optimization of Soybean Oil Degumming by Mixed Recombinant Phospholipases

CHENG Shi1，2， WANG Changkun1，2， ZHANG Liang1，2，*， LI Ying2， SHI Guiyang2， YANG Shengrong3， CHEN Guo’an3
（1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology， Ministry of Education， Jiangnan University， Wuxi 214122， China；2. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China；3. Wuxi Jiangda Baitai Technology Co. Ltd.， Wuxi 214122， China）

Crude soybean oil was degummed by mixtures of recombinant phospholipases A1（PLA1） and phospholipase C （PLC）， which were expressed successfully in the recombinant E. coli. by our laboratory. We investigated the effects of different parameters， including temperature， pH， reaction time， water dosage， stirring rate and enzyme dosage on degumming efficiency. Commercial PLA1（Lecitase Ultra?） was used for comparison. Then， these parameters were optimized by orthogonal array design. The optimal conditions were confirmed as follows: reaction temperature， 45 ℃； pH， 6.5； reaction time， 3 h； stirring speed， 300 r/min； PLA1dosage， 7 940 U/kg； and PLC dosage， 23 130 U/kg. The degumming efficiency obtained with the mixed recombinant enzymes was comparable to that obtained with Lecitase Ultra?. The final phosphorus content of degummed soybean oil was lower than 5 mg/kg， which met the requirements of physical refining. This study laid the foundation for developing food-grade enzyme preparations with self-owned intellectual property rights of cooking oil degumming.

recombinant E. coli； mixed phospholipases； soybean oil； enzymatic degumming； orthogonal array experiment

10.7506/spkx1002-6630-201618003

Q814.9

A

1002-6630（2016）18-0013-06

程實， 王長坤， 張梁， 等. 復合重組磷脂酶用于大豆油脫膠的工藝優(yōu)化［J］. 食品科學， 2016， 37（18）: 13-18. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201618003. http://www.spkx.net.cn

CHENG Shi， WANG Changkun， ZHANG Liang， et al. Optimization of soybean oil degumming by mixed recombinant phospholipases［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 13-18. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618003. http://www.spkx.net.cn

2016-03-16

國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2011AA100905）；教育部“新世紀優(yōu)秀人才支持計劃”項目（NCET-11-0665）；江南大學食品科學與技術國家重點實驗室自由探索課題項目（SKLF-ZZA-201201）

程實（1988—），男，博士研究生，研究方向為工業(yè)微生物學與酶工程。E-mail：jack11181@sina.com

張梁（1978—），男，教授，博士，研究方向為酶工程與技術和農業(yè)益生菌。E-mail：zhangl@jiangnan.edu.cn