張潔

摘要：分析干旱鹽堿共脅迫下玉米miR398的表達(dá)變化，闡明miR398與玉米水勢脅迫生理指標(biāo)關(guān)系。干旱鹽堿共脅迫處理72 h，利用qRT-PCR技術(shù)分別驗證了miR398及其他對應(yīng)的靶基因在鹽脅迫條件下的表達(dá)變化情況；應(yīng)用ELISA和茚三銅方法分別檢測玉米的ABA （脫落酸）和脯氨酸含量。結(jié)果表明：經(jīng)過干旱鹽堿共脅迫處理，玉米出現(xiàn)了明顯的水分虧缺癥狀，24、48、72 h各處理組玉米ABA和脯氨酸含量與對照組比較上升明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。說明干旱鹽堿共脅迫條件下玉米miR398表達(dá)下調(diào)，可能參與抗逆相關(guān)基因ABA的調(diào)控。試驗為后續(xù)抗旱抗鹽堿玉米遺傳性狀研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：玉米；干旱；鹽堿；miR398

中圖分類號： S513.032 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0045-03

玉米（Zea mays L.）是世界三大糧食作物之一，它的產(chǎn)量對世界糧食的供給有著重要的影響[1]。非生物因子中干旱是引起玉米減產(chǎn)的最為重要的脅迫因子[2]，干旱脅迫是植物逆境最普遍的形式，在許多地區(qū)是農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸，每年全世界玉米產(chǎn)量損失中的幾乎一半是由干旱造成的。特別是在實(shí)際生產(chǎn)中干旱脅迫往往也伴隨著鹽堿的脅迫危害。統(tǒng)計現(xiàn)實(shí)表明，我國平均每年受旱面積0.22億hm2，成災(zāi)面積0.09億hm2，直接減收糧食100億kg以上[3]。應(yīng)用分子遺傳學(xué)方法研究作物抗旱抗鹽堿機(jī)制并通過基因工程培育新的作物品種已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究的重要目標(biāo)。

Small RNA是一類非編碼的、能夠在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的小分子RNA。最近的研究表明，植物在多種逆境脅迫下存在著miceo RNA（miRNA）的誘導(dǎo)表達(dá)并證實(shí)了某些miRNA在植物感受逆境脅迫而作出適應(yīng)性調(diào)整的過程中發(fā)揮著重要的作用[4-5]。隨著研究的深入，miRNA將為我們闡明植物耐脅迫機(jī)理和提高植物耐脅迫能力提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑與儀器

玉米幼苗營養(yǎng)液培養(yǎng)所需試劑及藥品：液氮，Trizol（Invitrogen），三氯甲烷，異丙醇，無水乙醇，DEPC，無 RNA 酶雙蒸水。試劑盒：Reverse Transcription System（Promega），TaqMan RmicroRNA Reverse Transcription Kit （Applied Biosystems），SYBR Premmix Ex TaqTMⅡ （TaKaRa）。主要儀器：NANO 2000 紫外分光光度計（Thermo），普通 PCR 儀（伯樂），ABI 7300 熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems）。

1.2 方法

1.2.1 玉米處理和收集 試驗選用玉米品系YQ7-96，玉米種子催芽后待根長2～3 cm時，點(diǎn)種于營養(yǎng)盤中，用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，置于網(wǎng)室。處理組在三葉一心期（苗期，長度為 20 cm），每盆澆5 L含100 mmol/L混合鹽（50 mmol/L NaCl，50 mmol/L Na2SO4） 的Hoagland液作為鹽脅迫處理組和含 25 mmol/L NaHCO3、25 mmol/L Na2CO3的Hoagland液（pH值11，水勢為-0.7 MPa）作為堿共脅迫處理。0、24、48、72 h后分別取根莖和葉組織，立即用液氮冷凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆?，每個樣品取3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 總 RNA 提取 miRNA反轉(zhuǎn)錄莖環(huán)RT引物設(shè)計依據(jù)50 nt可自行折疊成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，序列如下：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACNNNNNN-3′，3′端的6個N代表與成熟miRNA 3′端反向互補(bǔ)的6個堿基。用于miRNA熒光定量的反向引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′，該引物實(shí)際上為RT引物上的一部分，對所有miRNA來說是通用的。正向引物利用Primer Express 3.0 （Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA） 設(shè)計，基礎(chǔ)序列為目標(biāo)miRNA成熟序列，根據(jù)對引物的長度、Tm值及GC含量的要求再用軟件進(jìn)行調(diào)整，可在5′端加2～3個GC以增加退火溫度，平衡GC含量。

1.2.3 miRNA反轉(zhuǎn)錄 利用TaqMan RmicroRNA Reverse Transcription Kit （Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）試劑盒反轉(zhuǎn)錄miRNA，內(nèi)參選擇18S rRNA。

1.2.4 miRNA 熒光定量PCR 利用ABI 7300 Sequence Detection System （Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）熒光定量PCR儀進(jìn)行miRNA熒光定量PCR反應(yīng)。熒光定量PCR試劑盒采用TaKaRa公司的SYBR Premmix ExTaqTMⅡ，并以18S rRNA 作為內(nèi)參對照，miR398a引物序列如下：5′-ATTCGCACTGGATACGACCGGGGG-3′，5′-GCCGCTGTGTTCTCAGGTC-3′，退火溫度為58 ℃。

1.2.5 脫落酸（ABA）的含量 ABA含量測定方法依據(jù)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的ELISA試劑盒說明書，并參考酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定內(nèi)源植物激素。

1.2.6 脯氨酸的含量 脯氨酸含量測定方法是依據(jù)茚三酮比色法[6]。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 PCR反應(yīng)結(jié)束后，手動設(shè)置合適的閾值，之后導(dǎo)出CT值數(shù)據(jù)，利用ΔΔCT法衡量miRNA及其靶基因在不同樣品中的差異表達(dá)水平。對于特定時間點(diǎn)的處理樣品，有以下表達(dá)式：

ΔΔCT=（CT，miRNA干旱鹽堿處理組-CT，18S rRNA，干旱鹽堿處理組）-（CT，miRNA，對照組-CT，18S rRNA，對照組）。

統(tǒng)計分析采用Stata統(tǒng)計分析軟件，比較各試驗組與對照組間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 非生物脅迫處理的玉米和正常條件下玉米

玉米種子經(jīng)過催芽后盆栽于溫室中。待苗生長至雌雄分化盛期（大喇叭口期，約12張真葉），觀察玉米生長情況，以保證玉米生長良好且均一，無明顯形態(tài)差異，此時將玉米材料分為處理組和對照組。48 h后，對照組玉米葉片舒展生長良好；處理組玉米葉片卷蔫，且有黃葉出現(xiàn)，表現(xiàn)為典型的水分虧缺癥狀（圖1）。

2.2 在干旱和鹽堿共脅迫條件下玉米miR398表達(dá)模式

熔解曲線可用來衡量引物質(zhì)量的好壞，較好的引物具有較高的擴(kuò)增效率，不會形成引物二聚體或產(chǎn)生錯配?？蓮那€形狀看出miR398和內(nèi)參（18S rRNA）PCR擴(kuò)增過程熔解曲線呈現(xiàn)“S”形（圖2），這表明PCR擴(kuò)增試驗進(jìn)行良好。

為了進(jìn)一步探索miRNA在鹽脅迫條件下的表達(dá)變化情況，利用 qRT-PCR 技術(shù)檢測玉米miR398b在干旱鹽堿共脅迫條件下（0、24、48、72 h）變化情況。圖3結(jié)果顯示，24、48、72 h的處理組miR398表達(dá)量與對照組相比明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P

2.3 干旱鹽堿共脅迫下玉米脫落酸和脯氨酸含量的變化

在干旱鹽堿共脅迫處理后，通過ELISA技術(shù)測定對照和處理2組玉米幼苗樣品的細(xì)胞內(nèi)源ABA、脯氨酸含量。圖4結(jié)果表明，與對照組相比，24、48、72 h的處理組玉米脫落酸累積量與對照組相比明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P

3 討論

植物中的小RNA在植物的生長發(fā)育、組織器官的形態(tài)建成、逆境應(yīng)答和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。通過對靶基因預(yù)測和功能分析后發(fā)現(xiàn)，某些脅迫（旱、鹽堿、熱、冷、凍）誘導(dǎo)的miRNA還直接參與植物逆境脅迫下的適應(yīng)性反應(yīng)。尤其是miRNA在植物非生物環(huán)境脅迫應(yīng)答中的調(diào)控作用日益受到重視[7]。miRNA389可以同時受這4種非生物因素脅迫的調(diào)控。在轉(zhuǎn)基因擬南芥中研究進(jìn)一步揭示miRNA398在調(diào)控CSD2基因表達(dá)中和氧化脅迫中的重要作用。而干旱、嚴(yán)寒和鹽分則會影響植物 miR319c、miR393、miR395、miR397b和miR402 的表達(dá)水平[8]。實(shí)際上，Sunkar等構(gòu)建了擬南芥幼苗經(jīng)脫水、高鹽、低溫和ABA脅迫處理后的小分子RNA文庫并對文庫的測序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了26個新的miRNAs，它們來源于15個新的miRNA家族[9]。但是，miRNA在植物抗逆反應(yīng)中作用的分子機(jī)制目前還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是玉米在多種逆境脅迫環(huán)境下的生理反應(yīng)，氧化應(yīng)激反應(yīng)可導(dǎo)致玉米體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加。植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸。因此測定脯氨酸含量可以作為抗旱育種的生理指標(biāo)。同時，在玉米葉片中ABA誘導(dǎo)產(chǎn)生的H2O2能通過促發(fā)促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）引起的級聯(lián)反應(yīng)來調(diào)節(jié)一些抗氧化酶類基因的表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)抗氧化酶類的活性，最終啟動氧化防御系統(tǒng)[10]。本試驗結(jié)果顯示，miR398在干旱鹽堿脅迫過程中參與靶基因ABA和脯氨酸的抗氧化防御機(jī)制的調(diào)控。因此我們認(rèn)為：miR398可以通過增加ABA的累積，進(jìn)而激活A(yù)BA誘導(dǎo)的抗氧化防御系統(tǒng)，且此過程還涉及到脯氨酸。

試驗過程中玉米鹽堿處理濃度是獲得相關(guān)基因表達(dá)的重要因素。目前，國內(nèi)外對玉米耐鹽堿性鑒定還沒有形成統(tǒng)一的、權(quán)威的耐鹽堿鑒定濃度，大部分研究者都是根據(jù)自身的鑒定方法、處理溶液選取不同的鑒定濃度，而且在操作過程中的誤差或人為因素都有可能造成鑒定濃度的不同[11-13]。因此，本試驗中對耐鹽堿性鑒定濃度的篩選是很必要的。本研究最終確定的玉米苗期鹽性處理濃度為100 mmol/L，確定的玉米苗期堿處理濃度為35 mmol/L；劉芳等研究表明，NaCl濃度為 250 mmol/L 是玉米苗期耐鹽性篩選的理想濃度[14]；崔美燕的研究表明，Na2CO3濃度為25 mmol/L可以作為玉米苗期耐堿性鑒定的理想濃度[15]。另外，玉米在苗期的耐鹽堿性很重要，因為植株苗期的生長情況影響其最終的產(chǎn)量。本試驗是在選取玉米對鹽堿脅迫最敏感的“3葉1心”期進(jìn)行鹽堿脅迫處理3 d。

本試驗中使用的耐鹽堿性鑒定濃度與其他人的研究存在一定的差異，并使用較重的脅迫參數(shù)。這樣更有利于獲得特異性相關(guān)miRNA表達(dá)。此外，崔美燕等采用苗情評價的方法對玉米自交系幼苗進(jìn)行耐鹽、堿性鑒定，根據(jù)鹽或堿脅迫處理 7 d 后苗情觀察來評價玉米材料的耐鹽、堿性性狀，非常直觀、簡單[15-16]。為了檢測玉米對干旱鹽堿脅迫的早期反應(yīng)，在試驗中收集處理3 d后的玉米混合組織作為抽提RNA的材料。

本研究建立了鹽、堿和旱共脅迫下的玉米品系YQ7-96模型，檢測miR398在不同處理時期的表達(dá)水平，并驗證miR398表達(dá)與多個玉米抗旱指標(biāo)（ABA和脯氨酸）的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，在玉米幼苗植株中miR398表達(dá)在干旱鹽堿共處理后被抑制，而基因ABA和脯氨酸在處理組的玉米葉片中也被大量誘導(dǎo)表達(dá)。試驗將初步闡明由miRNA介導(dǎo)的玉米幼苗干旱脅迫響應(yīng)機(jī)制的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為更好地理解植物耐旱分子機(jī)理提供試驗數(shù)據(jù)。

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