李鵬　劉濟(jì)明　文愛華

摘要：以羅甸縣小蓬竹根際土壤為研究對(duì)象，采用稀釋平板法調(diào)查土壤微生物數(shù)量，并挑選菌落形態(tài)存在差異的細(xì)菌菌株，對(duì)其16S rDNA序列進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，研究根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性，為小蓬竹的保護(hù)以及喀斯特山地土壤微生物多樣性研究提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。結(jié)果表明：小蓬竹根際土壤微生物數(shù)量由多到少為細(xì)菌>放線菌>真菌，干土中所含細(xì)菌、真菌、放線菌的平均數(shù)量分別為8.32×107、9.19×105、2.32×106 CFU/g。分離純化共獲得菌落表型差異的細(xì)菌41株，16S rDNA有效序列進(jìn)行Blast比對(duì)，可劃分為26個(gè)分類單元，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)H為1.067 9，豐富度指數(shù)S為7，均勻度指數(shù)J為0.548 8，優(yōu)勢(shì)度指數(shù)D為0.521 7。基于細(xì)菌16S rDNA序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明：30株細(xì)菌屬于厚壁菌門（Firmicutes）（按單元種類數(shù)計(jì)算所占比例為73.17%），10株屬于變形菌門（Proteobacteria）（24.39%），1株屬于擬桿菌門（Bacteroidetes）（2.44%），其中芽孢桿菌屬（Bacillus）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。由結(jié)果可知，小蓬竹根際土壤中含有較為豐富的微生物多樣性。

關(guān)鍵詞：小蓬竹；根際土壤；可培養(yǎng)細(xì)菌；微生物多樣性

中圖分類號(hào)： S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0223-04

根際微生物是指存在于植物根系微區(qū)域直接影響土壤的結(jié)構(gòu)、生物化學(xué)活性及土壤養(yǎng)分利用效率[1]的微生物類群，主要包括細(xì)菌、放線菌、真菌、藻類和原生動(dòng)物等。根際土壤微生物具有數(shù)量龐大、種群結(jié)構(gòu)復(fù)雜、代謝旺盛、繁殖速度快等特點(diǎn)，推動(dòng)土壤物質(zhì)與能量的流動(dòng)，將土壤微生物種群、數(shù)量以及分布作為評(píng)價(jià)土壤生態(tài)環(huán)境質(zhì)量的重要指標(biāo)。根際微生物的研究越來(lái)越受到學(xué)者的重視[2-3]，國(guó)內(nèi)有關(guān)茶樹[4]（Camellia sinensis）、烤煙[5]（Nicotiana tabacum）、檳榔[6]（Semen arecae）、野生稻[7]（Oryza rufipogon）根際微生物的研究較多。但是對(duì)喀斯特地區(qū)土壤微生物種群多樣性的研究相對(duì)較少，針對(duì)于小蓬竹根際土壤微生物種群多樣性的研究更是一片空白。

小蓬竹[Drepanostachyum luodianense （Yi et R. S. Wang） Keng f.]對(duì)于喀斯特環(huán)境具有很好的生境適應(yīng)性以及較強(qiáng)的抗逆性，在裸露的喀斯特石山甚至懸崖上均有廣泛分布[8]。叢生的小蓬竹的枝葉可較好地覆蓋裸露的巖層，提高喀斯特地區(qū)植被的覆蓋率，其地下部分可以減少水土流失、改良土壤理化性質(zhì)，進(jìn)而提高土壤活力。在石漠化治理中關(guān)于石漠化地區(qū)植被恢復(fù)物種的選擇上，小蓬竹完全可以作為一個(gè)很好的候選物種。因此，開展小蓬竹根際微生物研究，掌握小蓬竹根際土可培養(yǎng)微生物數(shù)量及種群結(jié)構(gòu)，對(duì)于小蓬竹的保護(hù)、豐富喀斯特地區(qū)土壤和竹類微生物資源，都具有很好的理論及現(xiàn)實(shí)意義。

本研究采用稀釋平板法統(tǒng)計(jì)小蓬竹土壤微生物數(shù)量，分離純化其根際土壤中的細(xì)菌，并基于16S rDNA序列特征對(duì)分離的菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，初步獲得小蓬竹根際細(xì)菌的物種多樣性信息，以期為進(jìn)一步開展小蓬竹對(duì)惡劣的喀斯特生境適應(yīng)性與微生物關(guān)系研究和喀斯特地區(qū)微生物資源的開發(fā)利用提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 土樣的采集與處理

于2014年5月上旬，選擇小蓬竹主產(chǎn)區(qū)羅甸，該區(qū)域?yàn)榈湫偷目λ固厍鹆甑孛玻∨钪袢郝浞植驾^為典型。試驗(yàn)地位于坡下位，地理位置為106°45′17″E、25°30′39″N，平均海拔757 m，土壤為典型的喀斯特石灰土，土壤肥力較高，pH值為7.68。沿等高線分別設(shè)置5個(gè)樣地（5 m×5 m），在各樣方隨機(jī)選10株竹，沿著竹基部挖取健康根系，采集土壤的深度為 5～20 cm，連同根系一起裝入無(wú)菌袋中并注明采集地點(diǎn)、日期、土樣號(hào)（輕輕抖動(dòng)1 min，取附著根系2 mm左右的土壤為根際土）[9]。試驗(yàn)所用小蓬竹根際土壤為5個(gè)樣地采集的等量混合土壤樣品，土樣冰箱低溫保存（4 ℃），以進(jìn)行微生物的分離和計(jì)數(shù)（1周內(nèi)分離）。

1.2 根際微生物的分離計(jì)數(shù)

（1）細(xì)菌分離和培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15～25 g，加水補(bǔ)足至1 000 mL，pH值7.4～7.6。（2）真菌分離培養(yǎng)采用馬丁氏-孟加拉紅培養(yǎng)基：KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨 5 g，葡萄糖10 g，1/3 000孟加拉紅（Rose Bengal）100 mL，瓊脂15～20 g，加水補(bǔ)足至1 000 mL，pH值自然。培養(yǎng)基也可以加入青霉素，加入量為100 U/mL，同時(shí)加入慶大霉素 160 U/mL，主要是為了抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，減少干擾性。（3）放線菌培養(yǎng)采用改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20 g，pH值7.4～7.6 （每300 mL培養(yǎng)基中加3%重鉻酸鉀1 mL）。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和改良的高氏1號(hào)培養(yǎng)基于121 ℃滅菌20 min，土壤微生物的分離計(jì)數(shù)每種培養(yǎng)基倒6皿，純化時(shí)每種培養(yǎng)基倒3皿，凝固成平板備用。

采用稀釋平板涂抹法，在無(wú)菌培養(yǎng)皿中倒入15～20 mL選擇性培養(yǎng)基，待凝固后，用無(wú)菌移液槍吸取0.1 mL各稀釋度的土壤懸液，不同濃度稀釋度的土壤懸液在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號(hào)培養(yǎng)基和孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布培養(yǎng)。細(xì)菌于37 ℃培養(yǎng)2～4 d，放線菌于28 ℃培養(yǎng) 7 d，真菌于28 ℃培養(yǎng)5 d，然后進(jìn)行分離、計(jì)數(shù)（細(xì)菌和放線菌的最佳計(jì)數(shù)的菌落形成單位在30～300個(gè)之間，真菌的菌落形成單位在10～100個(gè)之間）。

1.3 細(xì)菌16S rDNA的擴(kuò)增

采取購(gòu)買的生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取分離純化的細(xì)菌基因組DNA，提取之后的DNA選用細(xì)菌通用引物（正向引物27 F；反向引物1495 R）對(duì)細(xì)菌、放線菌的16S rDNA擴(kuò)增，然后采用1.2%瓊脂糖凝膠（含0.5 mg/L溴化乙錠）電泳檢測(cè)。

選用細(xì)菌通用引物[10]（正向：27 F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向：1 495 R，5′-CTACGGCTACCTTGTTALGA-3′），采用適宜的反應(yīng)條件，對(duì)16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物27F、反向引物1 495R分別位于大腸埃希氏菌（Escherichia coli）16S rDNA序列的8～27位和1 495～1 514 位的堿基位置上。

細(xì)菌采用50 μL的PCR反應(yīng)體系：Taq PCR Master Mix 25 μL；基因組DNA模板1 μL；正向引物27F 2 μL；反向引物1495R 2 μL；Nuclease-free ddH2O 20 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 3 min，51 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。用1.2%瓊脂糖凝膠（含0.5 mg/L溴化乙錠）電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 16S rDNA序列分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司 （Invitrogen） 測(cè)序，測(cè)序后登陸GenBank對(duì)比，利用GenBank通過(guò)BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，下載最相近菌株的16S rDNA序列，用Clustal X[11]按照最大同源性的原則進(jìn)行排序，采用Kimura 2（Kimura，1980）計(jì)算核苷酸差異值[12]，再采用Neighbor-Joining[13]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展數(shù)（bootstrap）為 1 000。

1.5 細(xì)菌種群的多樣性分析

定義16S rDNA、ITS rDNA序列同源性>97%作為同一分類單元[14]，采用Shannom-Wiener指數(shù)（H）、均勻度（Pielou）指數(shù)（J）、豐富度指數(shù)（S）和Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（D），分析小蓬竹根際土壤環(huán)境的微生物多樣性特征。

多樣性Shannom-Wiener指數(shù)：

H=-∑Si=1PilnPi。

式中：Pi為第i種的多度比例，可表示為Pi=Ni/N，Ni為屬i的單菌落數(shù)量，N為根際土樣的所有菌株數(shù)之和。

Pielou指數(shù)：

J=-∑Si=1PilnPi/lnS。

式中：S為分類單元，可表示為屬（種）i所在根際土壤中屬（種）的數(shù)目。

根際土壤中不同物種所起的作用及所占的地位，選用Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)表示，公式如下：

D=∑P2i。

2 結(jié)果與分析

2.1 小蓬竹根際土壤微生物數(shù)量分析

由表1可知，干土中微生物數(shù)量由多到少為細(xì)菌>放線菌>真菌，細(xì)菌在根際土壤中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，占根際土壤微生物總數(shù)的96.25%。小蓬竹根際土壤中，干土中約含有細(xì)菌832×107 CFU/g，與張友杰等對(duì)烤煙不同生育期根際土壤微生物含量變化的研究（3.73×107個(gè)/g干土）結(jié)果[15]在同一數(shù)量級(jí)；約含放線菌2.32×106 CFU/g，比雍太文等對(duì)不同種植模式下小麥土壤根際微生物數(shù)量研究結(jié)果（2.3×105～3.8×105個(gè)/g 干土）結(jié)果[16]高1個(gè)數(shù)量級(jí)；約含真菌9.19×105 CFU/g，與殷瑤等對(duì)不同年齡麻瘋樹林土壤放線菌、真菌（14.68×104～22.46×104 CFU/g）的研究結(jié)果[17]在同一數(shù)量級(jí)。

2.2 小蓬竹根際土壤細(xì)菌種群多樣性分析

利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基對(duì)小蓬竹根際土壤的41株細(xì)菌分離培養(yǎng)物的16S rDNA進(jìn)行測(cè)定，共獲得41條有效序列。登陸GenBank，進(jìn)行相似性對(duì)比表明，它們分屬于7屬26種。小蓬竹根際土壤細(xì)菌Shannon-Wiener多樣性指數(shù)H為1067 9，豐富度指數(shù)S為7，均勻度指數(shù)J為0.548 8，及優(yōu)勢(shì)度指數(shù)D為0.521 7。土壤細(xì)菌菌株與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知細(xì)菌的16S rDNA具有較高的相似度，從97%到99%不等（表2）。

細(xì)菌16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果（圖1）顯示，所得41條有效序列主要分屬3大類群。其中30株細(xì)菌屬于厚壁菌門（Firmicutes）（按單元種類數(shù)計(jì)算所占比例為73.17%），10株屬于變形菌門（Proteobacteria）（24.39%），1株屬于擬桿菌門（Bacteroidetes）（2.44%）。

厚壁菌門在小蓬竹根際細(xì)菌種類中所占比例較高，成為根際可培養(yǎng)細(xì)菌的最優(yōu)勢(shì)類群。該類群29株細(xì)菌（68.4%）均與芽孢桿菌屬（Bacillus）關(guān)系密切，細(xì)菌16S rDNA序列除B-107與Bacillus sp. CL1.8（AM934693.1）的相似度為97%外，其余均為99%，相似度極高；僅1株與動(dòng)物球菌屬（Planococcus）關(guān)系密切，16S rDNA序列相似度為98%。

變形菌門為分離得到的第二大優(yōu)勢(shì)類群，其中5株與溶桿菌屬（Lysobacter spp.）關(guān)系密切，細(xì)菌16S rDNA序列相似度為99%；2株與假單胞菌屬（Pseudomonas）關(guān)系密切，16S rDNA序列相似度為99%；2株與貪銅菌屬（Cupriavidus）密切相關(guān)，16S rDNA序列相似度為99%；反1株與鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）關(guān)系密切，16S rDNA序列相似度為98%。

1株擬桿菌門（Bacteroidetes）的細(xì)菌（B-12）與金黃桿菌屬（Chryseobacterium）關(guān)系密切，16S rDNA序列相似度為99%。

3 討論

3.1 小蓬竹根際土壤微生物數(shù)量

小蓬竹根際土壤干土中所含微生物總數(shù)為8.64×107 CFU/g，總體上小蓬竹根際土壤中微生物總數(shù)較多，細(xì)菌數(shù)量占優(yōu)勢(shì)，防線菌次之、真菌數(shù)量較少?；ò粑⑸锟倲?shù)及細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量均高于小蓬竹根際土壤微生物數(shù)量[18]。灰木蓮人工林地土壤微生物春、秋、冬季2種林地都是細(xì)菌>放線菌>真菌[19]。華菊玲等對(duì)連作芝麻根際土壤微生物群落的研究表明，新生、連作2、5年芝麻地微生物數(shù)量與本研究的微生物細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量都在同一數(shù)量級(jí)[20]。

3.2 小蓬竹根際土壤細(xì)菌多樣性

小蓬竹根際土壤細(xì)菌主要分為三大類，分別為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門。李潞濱等研究發(fā)現(xiàn)，毛竹、冷箭竹共有細(xì)菌類群厚壁菌門、變形菌門[21]，其中在毛竹的厚壁菌門方面，本研究結(jié)果與之較為相似。小蓬竹細(xì)菌類群的芽孢桿菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，與竹林根際可培養(yǎng)微生物種群多樣性分析結(jié)果[22]一致。雖然小蓬竹與冷箭竹（Bashania fangiana）[23]、毛竹（phyllostahys pubescens）[21]根際土壤微生物種類之間存在一定的相似性，但具有其自身特有的菌群結(jié)構(gòu)。

本研究?jī)H采用牛肉膏蛋白胨單一培養(yǎng)基分別對(duì)小蓬竹根際土壤細(xì)菌進(jìn)行分離研究，初步揭示了小蓬竹根際土壤特有生境中微生物種群的組成特征，但仍然存在一定的局限性。應(yīng)采用多種有效的培養(yǎng)基對(duì)土壤樣品進(jìn)行更為全面的分離培養(yǎng)，將充分了解小蓬竹根際可培養(yǎng)微生物細(xì)菌種群的完整信息。此外，由于自然環(huán)境中大部分微生物不能通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)用傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法研究土壤微生物區(qū)系將導(dǎo)致微生物多樣性嚴(yán)重丟失[24]。對(duì)于小蓬竹根際土壤未培養(yǎng)或不能培養(yǎng)的微生物，非常有必要采用不依賴純培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法，以獲取更全面的小蓬竹根際微生物多樣性信息。

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