孫縵利，鄧海峰，李明華，劉國(guó)良，常全忠

美滿霉素對(duì)阿爾茨海默病大鼠認(rèn)知損傷及海馬BDNF、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

孫縵利，鄧海峰，李明華，劉國(guó)良，常全忠△

目的觀察美滿霉素對(duì)阿爾茨海默?。ˋD）大鼠認(rèn)知功能和海馬腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、凋亡相關(guān)因子Bcl-2和Bax表達(dá)的影響，探討美滿霉素對(duì)AD大鼠腦保護(hù)作用的機(jī)制。方法側(cè)腦室注射Aβ25-35建立AD大鼠模型。30只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組和治療組，每組10只。對(duì)照組和模型組腹腔內(nèi)注射生理鹽水1 mL/（kg·d），治療組腹腔注射美滿霉素50 mg/（kg·d），均持續(xù)14 d。Morris水迷宮檢測(cè)行為學(xué)變化，蛋白免疫印跡（Western blotting）法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)海馬BDNF、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，原位末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡率。結(jié)果美滿霉素可以明顯提高AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，上調(diào)AD大鼠海馬BDNF、Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)，減少海馬神經(jīng)元凋亡。結(jié)論美滿美素可以通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、抑制神經(jīng)元的凋亡發(fā)揮腦保護(hù)作用。

四環(huán)素類；阿爾茨海默?。患?xì)胞凋亡；神經(jīng)組織蛋白質(zhì)類；認(rèn)知；美滿霉素；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

阿爾茨海默病（AD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶、認(rèn)知障礙等癥狀［1］，隨著發(fā)病率不斷上升，嚴(yán)重威脅著人類健康和社會(huì)發(fā)展。AD的發(fā)病機(jī)制目前還不清楚，有研究報(bào)道腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、凋亡相關(guān)因子Bcl-2和Bax與AD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［2-3］。美滿霉素是一種半合成的第2代四環(huán)素衍生物，容易透過(guò)血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)［4］。研究表明，美滿霉素可以通過(guò)抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞的激活、神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激等途徑改善癡呆大鼠的認(rèn)知障礙［5-6］。然而，美滿霉素是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)BDNF、Bcl-2和Bax的表達(dá)來(lái)改善AD大鼠的認(rèn)知障礙，發(fā)揮腦保護(hù)作用，目前報(bào)道甚少。本課題組擬通過(guò)觀察側(cè)腦室注射β淀粉樣肽25-35（Aβ25-35）誘導(dǎo)的AD大鼠的認(rèn)知和海馬BDNF、Bcl-2和Bax的表達(dá)變化，探討美滿霉素對(duì)AD大鼠的腦保護(hù)作用機(jī)制，以期為臨床治療AD提供新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料Morris水迷宮裝置（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制）；DW-5大鼠腦立體定位儀（成都泰盟科技有限公司）；美滿霉素膠囊（100 mg/粒，中國(guó)惠氏制藥有限公司）；青霉素（哈藥集團(tuán)）；BDNF、Bcl-2和Bax酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（鄭州森斯科貿(mào)有限公司）；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；兔抗鼠BDNF、Bcl-2和Bax多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、Aβ25-35、戊巴比妥鈉均購(gòu)自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組30只健康雄性SD大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量（250±10）g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK豫2013-0002），所有動(dòng)物都在自然光暗周期的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由覓食、飲水。隨機(jī)數(shù)字表法分成對(duì)照組、模型組和治療組，每組10只。

1.2.2AD模型的制備用二甲基亞砜50 μL溶解0.1 mg Aβ25-35，再用0.1 mol/L PBS 50 μL稀釋成10 g/L的溶液，置于37℃溫箱孵育72 h，觀察其呈現(xiàn)明顯絮狀，孵育完成，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)2周后，用0.8%戊巴比妥鈉（10μL/g，腹腔注射）麻醉，固定于腦立體定位儀上。參照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟為原點(diǎn)，向后1.5 mm，旁開(kāi)1.2 mm為穿刺點(diǎn)，顱鉆穿孔，自顱骨表面進(jìn)針3.5 mm至側(cè)腦室，用微量注射泵將2 μL凝聚態(tài)Aβ25-35在5 min內(nèi)緩慢注入，留針5 min，以使Aβ25-35充分浸潤(rùn)局部組織，退針后縫合傷口。對(duì)照組給予2 μL生理鹽水。術(shù)后給予青霉素（4×106U/kg）肌內(nèi)注射，傷口處碘伏消毒，1次/d，共5 d。術(shù)后對(duì)照組和模型組腹腔內(nèi)注射生理鹽水1 mL/（kg·d），治療組腹腔注射美滿霉素50 mg/（kg·d），均持續(xù)14 d，給藥劑量參照文獻(xiàn)［5］。

1.2.3行為學(xué)檢測(cè)各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力Morris水迷宮水池中加入適量的墨汁，使水池成為不透明色（去除視覺(jué)干擾），水溫保持在22～23℃。將大鼠面向池壁放入水池，記錄大鼠從入水到找到水下隱蔽平臺(tái)并站立于其上所需時(shí)間，作為逃避潛伏期，歷時(shí)5 d。5 d后去除平臺(tái)，測(cè)其第1次到達(dá)原平臺(tái)位置的時(shí)間、120 s內(nèi)穿環(huán)次數(shù)。

1.2.4蛋白免疫印跡（Western blotting）法檢測(cè)各組大鼠海馬BDNF、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)0.8%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，經(jīng)4%多聚甲醛心臟灌流，快速取出全腦，冰浴分離出大鼠前額葉皮質(zhì)，按10 mL/g的比例加入全細(xì)胞裂解液，組織經(jīng)勻漿、超聲破碎后，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，10%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)NC膜。雜交步驟如下：10%脫脂牛奶封閉NC膜1 h，TBST（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5；0.15 mmol/L NaCl；0.05%Tween 20）漂洗3次，每次10 min，然后室溫下與兔抗鼠一抗BDNF（1∶500）、Bcl-2（1∶200）、Bax（1∶200）雜交反應(yīng)2 h，TBST漂洗同前。再將NC膜與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG（1∶2 000）雜交反應(yīng)1 h。最后用TTBS漂洗NC膜3次，每次10 min，加入ECL試劑反應(yīng)5 min，保鮮膜包裹，暗室進(jìn)行X線膠片曝光、顯影和定影。然后同一張NC膜再與β-actin（1∶1 000）進(jìn)行雜交反應(yīng)。Western印跡條帶經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描處理，計(jì)算單位光密度值和條帶面積，將各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的總光密度值與對(duì)照組比較，得到相對(duì)百分?jǐn)?shù)。

1.2.5ELISA法檢測(cè)各組大鼠海馬BDNF、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)0.8%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，經(jīng)4%多聚甲醛心臟灌流，快速取出全腦，冰浴分離出大鼠前額葉皮質(zhì)，1∶10勻漿，4℃，10 000 r/min，離心10 min，取上清液。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.2.6原位末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測(cè)各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率嚴(yán)格按照TUNEL檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的方法進(jìn)行，所有切片染色均采用相同的條件，每批染色均設(shè)陰性對(duì)照。陰性對(duì)照滴加PBS代替TUNEL反應(yīng)混合物孵育切片，結(jié)果為陰性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 19.0軟件包，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1美滿霉素對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響與對(duì)照組相比，模型組大鼠平均逃避潛伏期和第1次到達(dá)原平臺(tái)位置的時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P＜0.05），穿環(huán)次數(shù)明顯減少（P＜0.05）；與模型組相比，治療組大鼠平均逃避潛伏期和第1次到達(dá)原平臺(tái)位置的時(shí)間明顯縮短（P＜0.05），穿環(huán)次數(shù)明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1Effects of minocycline on the cognition in three groups表1　美滿霉素對(duì)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響（n=10，）

Tab.1Effects of minocycline on the cognition in three groups表1　美滿霉素對(duì)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響（n=10，）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組治療組F逃避潛伏期（s）50.24±9.57 89.56±12.38a 57.23±10.14b 37.97＊＊第1次到達(dá)原平臺(tái)位置的時(shí)間（s）7.54±1.98 16.63±4.19a 9.58±2.70b 23.72＊＊穿環(huán)次數(shù)6.52±1.04 2.61±0.85a 5.25±1.36b 32.67＊＊

Tab.2Expressions of BDNF，Bcl-2 and Bax in hippocampus of three groups表2　各組大鼠海馬BDNF、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)（n=10，ng/L，）

Tab.2Expressions of BDNF，Bcl-2 and Bax in hippocampus of three groups表2　各組大鼠海馬BDNF、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)（n=10，ng/L，）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組治療組F Bax 28.62±5.29 87.35±11.53a 49.13±9.62b 105.15＊＊BDNF 38.60±6.46 12.14±3.28a 24.07±4.59b 71.62＊＊Bcl-2 34.27±6.53 13.60±3.42a 21.32±4.16b 45.68＊＊

2.2美滿霉素對(duì)各組大鼠海馬BDNF、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

2.2.1Western blotting法檢測(cè)結(jié)果模型組大鼠海馬BDNF和Bcl-2蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組（P＜0.05），而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。與模型組相比，治療組大鼠海馬BDNF和Bcl-2蛋白表達(dá)量均顯著上調(diào)（P＜0.05），而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.2.2ELISA法檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬BDNF和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，治療組大鼠海馬BDNF和Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05），而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.3美滿霉素對(duì)各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示，3組間海馬神經(jīng)元凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=106.22，P＜0.01）。與對(duì)照組（6.47±3.28）%相比，模型組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率（43.26±7.73）%顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，治療組海馬神經(jīng)元凋亡率（22.68±5.05）%明顯減少，但高于對(duì)照組（P＜0.05）。

3　討論

AD的主要病理特征是神經(jīng)元的丟失，而細(xì)胞凋亡在AD患者神經(jīng)元的丟失中扮演重要角色，與AD的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，而且在大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)的神經(jīng)元丟失更加明顯［7-8］。AD神經(jīng)元凋亡機(jī)制復(fù)雜，目前尚無(wú)定論。因此，進(jìn)一步研究AD神經(jīng)元凋亡機(jī)制并采取一定的措施干預(yù)神經(jīng)元的凋亡可以為防治AD提供一定的幫助。Bcl-2家族蛋白是所有細(xì)胞凋亡通路中的下游蛋白，Bcl-2家族成員包括Bcl-2、Bax、Bcl-xl、Bad等［9］，當(dāng)Bcl-2表達(dá)增加可抑制凋亡，而B(niǎo)ax表達(dá)增加可促進(jìn)凋亡，Bcl-2/Bax比值通常被認(rèn)為是反映細(xì)胞是否凋亡的重要指標(biāo)［10］。BDNF是神經(jīng)生長(zhǎng)因子的家族成員之一，在中樞和外周均廣泛存在，對(duì)神經(jīng)元的存活、再生、修復(fù)和誘導(dǎo)分化具有重要作用［11-13］。因其主要在海馬和皮質(zhì)表達(dá)，而海馬涉及了學(xué)習(xí)和記憶、執(zhí)行、注意等認(rèn)知功能［14］，這提示BDNF可能與認(rèn)知功能有關(guān)。

基于以上研究和假設(shè)，本課題組通過(guò)側(cè)腦室注射Aβ25-35建立AD大鼠模型，采用行為學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)的手段，觀察美滿霉素對(duì)AD大鼠海馬區(qū)BDNF、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，美滿霉素可以明顯改善AD大鼠的認(rèn)知能力，上調(diào)AD大鼠海馬BDNF、Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Bax的表達(dá)，降低神經(jīng)元凋亡率，提示美滿霉素可能通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、抑制神經(jīng)元的凋亡，改善AD的認(rèn)知功能，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

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（2016-01-22收稿2016-05-22修回）

（本文編輯魏杰）

Effects of minocycline on the cognition and expression of BDNF，Bcl-2 and Bax in hippocampus of Alzheimer's disease model rats

SUN Manli，DENG Haifeng，LI Minghua，LIU Guoliang，CHANG Quanzhong△
School of Basic Medical Sciences，Luohe Medical College，Luohe 462000，China△

E-mail：cqzchang@tom.com

ObjectiveTo investigate the effect of minocycline on the cognition and expressions of brain-derived neurotrophic factor（BDNF），apoptosis related factor Bcl-2 and Bax in hippocampus of rats with Alzheimer's disease（AD）.MethodsThe rat model was established by microinjection of Aβ25-35into lateral ventricle.Thirty healthy male SD rats were randomly divided into three groups:control group，model group and minocycline treatment group.Normal saline 1 mL/（kg·d）was intraperitoneally injected in control group and model group.The minocycline treatment group was intraperitoneally injected with minocycline 50 mg/（kg·d）for 14 days.Morris water maze was used to detect the behaviors of animals.The expressions of BDNF，Bcl-2 and Bax in hippocampus were measured by Western blotting and enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.The apoptosis of neurons was detected by TdT-mediated dUTP nick-end labeling（TUNEL）.Results Minocycline greatly improved the behaviors of AD rats，up-regulated the expressions of BDNF and Bcl-2，and downregulated the expression of Bax in hippocampus，and reduced cell apoptosis.ConclusionMinocycline plays a protective role in neural function by promoting the growth of neurons and inhibiting the neuronal apoptosis.

Tetracyclines；Alzheimer disease；apoptosis；nerve tissue proteins；cognition；Minocycline；brain-derived neurotrophic factor

R741

A

10.11958/20160028

漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校2015年度基礎(chǔ)科學(xué)重點(diǎn)研究項(xiàng)目（2015-S-LMC06）；2015年度河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究（152300410014）；2014年度河南省科技廳自然科學(xué)項(xiàng)目資助（142300410431）

漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部（郵編462000）

孫縵利（1987），女，講師，碩士，主要從事腦認(rèn)知功能的研究

E-mail:cqzchang@tom.com