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熱研4號王草和桂閩引象草的核型分析

2016-10-20 09:47羅宗志林潔榮林志魁陳碧成林占熺
草業(yè)科學 2016年9期
關鍵詞:狼尾草核型數(shù)目

羅宗志,林潔榮,,林志魁,陳碧成,梅 蘭,林占熺

(1.福建農林大學動物科學學院,福建 福州 350000; 2.國家菌草工程技術研究中心,福建 福州 350000;3.福建農林大學生命科學學院,福建 福州 350000)

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熱研4號王草和桂閩引象草的核型分析

羅宗志1,林潔榮1,2,林志魁3,陳碧成1,梅 蘭3,林占熺2

(1.福建農林大學動物科學學院,福建 福州 350000; 2.國家菌草工程技術研究中心,福建 福州 350000;3.福建農林大學生命科學學院,福建 福州 350000)

采用常規(guī)壓片法,對熱研4號王草(Pennisetumpurpureum×P.americanumcv. Reyan No.4)和桂閩引象草(P.purpureumcv. Guiminyin)的染色體數(shù)目和核型進行分析,以期為狼尾草屬種質資源多樣性保護利用和遺傳育種研究提供理論依據(jù)。結果表明,兩者染色體基數(shù)均為x=7。其中,熱研4號王草為三倍體,有21條染色體,核型公式2n=3x=21=21m(3SAT),染色體相對組成I.R.L=9S+3M1+3M2+6L,3條染色體含有隨體;桂閩引象草為四倍體,有28條染色體,核型公式2n=4x=28=18m(2SAT)+10sm(2SAT),染色體相對組成I.R.L=10S+6M1+4M2+8L,4條染色體含有隨體。熱研4號王草和桂閩引象草核型不對稱系數(shù)分別為60.15%和62.19%,屬于1B型和1C型,其核型都屬于比較原始的類型。

熱研4號王草;桂閩引象草;染色體;核型分析

熱研4號王草(Pennisetumpurpureum×P.americanumcv. Reyan No.4)隸屬禾本科狼尾草屬多年生草本植物,由中國熱帶農業(yè)科學院從國際熱帶農業(yè)中心引進并經(jīng)多年試驗選育而成[1],為多年生、抗倒伏、抗病蟲性強、產量高、早期刈割適口性好的優(yōu)良牧草[2]。桂閩引象草(P.purpureumcv. Guiminyin)隸屬禾本科狼尾草屬多年生草本植物[3],由廣西畜牧研究所2003年從臺灣引進,該品種適應性廣、產量高、品質優(yōu)、適口性好,適合飼喂牛、羊、兔等草食動物,是一種優(yōu)良的牧草[4]。近年來,國內外學者對熱研4號王草的研究主要集中在植物學特性、栽培技術、原生質體制備及降解糖化技術等方面[5-7],對桂閩引象草的研究主要集中在栽培技術、生產性能和飼用等領域[8-10],在細胞核型研究方面未曾報道。

染色體是基因的攜帶者,遺傳物質的載體[11]。研究染色體數(shù)目與核型對植物系統(tǒng)演化、物種之間親緣關系及遺傳工程中染色體鑒別具有重要意義[12]。目前,狼尾草屬牧草核型方面的研究已有報道,如對長序狼尾草(P.longissimum)核型的分析研究[13],對象草(P.purpureum)和巨菌草[(P.giganteumz.x.lin(暫定名)]核型及親緣關系的研究[14],對云南德宏地區(qū)逸生狼尾草(NaturalizedPennisetumsp. in Dehong)分類學的鑒定[15]。鑒于目前國內外尚無關于熱研4號王草和桂閩引象草的核型參數(shù)信息,本研究以熱研4號王草和桂閩引象草為試驗材料,采用常規(guī)壓片法對其染色體數(shù)目及核型進行分析,旨在從細胞學和遺傳學角度為熱研4號王草和桂閩引象草的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料

熱研4號王草來源于海南中國熱帶農業(yè)科學院;桂閩引象草來源于臺灣畜產實驗所。兩種牧草均采集于福建省福州市福建農林大學國家菌草工程技術研究中心種質資源圃(26°10′55.62″ N、119°23′21.24″ E,海拔10 m)。

1.2試驗方法

1.2.1材料預處理選取不同植株且長勢良好、生長100 d以上的熱研4號王草和桂閩引象草莖稈,按兩節(jié)切成一段,插入帶有細沙的塑料桶中,水以淹沒幼芽1 cm為宜,將塑料桶擺放在塑料大棚內,并且每天換一次水,在常溫下培養(yǎng)生根。待根尖長至2~3 cm時,于08:00-09:00截取不同莖稈上生長旺盛、潔白幼嫩的根尖1 cm作為試驗材料。

1.2.2染色體制片將根尖放入冰水混合物離體處理,然后置于0.05%秋水仙素溶液中室溫處理2 h。用蒸餾水沖洗后將根尖放入4 ℃卡諾氏液(V無水乙醇∶V冰乙酸=3∶1)中固定24 h。然后將根尖洗凈后放入60 ℃恒溫水浴鍋中酸解10 min。用蒸餾水沖洗酸液10 min后轉入2%纖維素酶水溶液中室溫下酶解1 h。將根尖洗凈后重新用卡諾氏液固定30 min。用蒸餾水沖洗酸液后轉入卡寶品紅染液室溫下染色1~2 h。最后,取根尖置于載玻片上,用鑷子和剪刀切取根尖1 mm,加一滴45%乙酸溶液,用鑷子將根尖充分壓碎,并使其均勻分散,加蓋玻片,用帶有橡皮擦的鉛筆輕輕敲打,并用食指壓緊,用濾紙吸掉多余的乙酸溶液。

1.2.3染色體觀察將根尖細胞裝片置于熒光顯微鏡載物臺上觀察。在100倍低倍鏡下找到染色體后用1 000倍油鏡繼續(xù)觀察,選擇分散良好、輪廓清晰、數(shù)目較全的染色體中期相進行拍照。

1.3核型分析方法

每個品種選擇30個以上分裂中期細胞,以85%以上的細胞具有相同的染色體數(shù)作為該品種的染色體數(shù)目[16],并選擇5個圖像清晰且分散良好的中期分裂相進行核型分析。利用核型分析軟件Karyo3.1處理染色體圖片并測量其長臂、短臂值,根據(jù)所得的數(shù)據(jù)進行同源染色體配對組合并繪制核型圖,采用Excel 2010繪制核型模式圖,核型參數(shù)以5個細胞的平均值來表示。核型分析按照李懋學和陳瑞陽[17]的方法,染色體相對長度組成參照Kuo等[18]的分類標準,染色體排序參照Levan等[19]提出的命名系統(tǒng),核型分類參照Stebbins[20]的分類標準,核型不對稱性系數(shù)用Arano[21]的計算方法。

2 結果

2.1熱研4號王草染色體數(shù)目

選擇30個染色體分散良好、輪廓清晰的熱研4號王草細胞進行觀測,結果顯示,染色體數(shù)目為20條的有兩個細胞,占計數(shù)總細胞數(shù)的6.67%;21條的有27個細胞,占總細胞數(shù)的90.00%;22條的有1個細胞,占總細胞數(shù)的3.33%。根據(jù)核型分析的標準化建議[17],確定熱研4號王草的染色體數(shù)目為2n=21條。

2.2熱研4號王草核型分析

選取5個分散良好、輪廓清晰的熱研4號王草中期分裂相(圖1、2)進行測量分析,熱研4號王草染色體數(shù)目2n=21條,染色體基數(shù)x=7,為三倍體。

熱研4號王草染色體核型公式為2n=3x=21=21m(3SAT),從核型公式看出,體細胞中期染色體由21條中部著絲點染色體(m)組成,其中第1組染色體含有隨體(表1)。從染色體相對長度組成I.R.L=9S+3M1+3M2+6L來看,熱研4號王草由短染色體(S)、中短染色體(M1)、中長染色體(M2)和長染色體(L)組成,并且這7組染色體相對長度為6.99%~24.06%,相對長度指數(shù)介于0.50~1.69,最長染色體與最短染色體長度比為3.44,臂比范圍在1.38~1.67,臂比值大于2的染色體比例為0(表2、圖3)。核型不對稱系數(shù)As.K%=60.15%,按照核型分類標準,熱研4號王草核型屬于1B型。

圖1 熱研4號王草染色體中期相Fig.1 Metaphase chromosomes of P. purpureum×P. americanum cv. Reyan No.4

圖2 熱研4號王草染色體核型圖Fig.2 Karyotype of P. purpureum×P. americanum cv. Reyan No.4

注:1-7表示染色體序號。

Note: 1-7 are chromosome number, respectively.

表1 熱研4號王草的染色體核型參數(shù)Table 1 Chromsome karyotype parameters of P. purpureum×P. americanum cv. Reyan No.4

注:*為有隨體染色體組,隨體在染色體短臂端,計算在染色體長度內;m為中部著絲點染色體;S為短染色體;M1為中短染色體;M2為中長染色體;L為長染色體。下同。

Note:* is trabant of chromosomes, along with the chromosome short arm side, the length of trabant was calculated in chromosome length;m is metacentric chromosome, S is Short chromosome, M1 is Medium-short chromosome, M2 is Medium-long chromosome, L is Long chromosome.

圖3 熱研4號王草染色體核型模式圖Fig.3  Karyotype diagram of P. purpureum×P. americanum cv. Reyan No.4

2.3桂閩引象草染色體數(shù)目

選擇30個染色體分散良好、輪廓清晰的桂閩引象草細胞進行觀測,結果顯示,染色體數(shù)目為27條的有1個細胞,占計數(shù)總細胞數(shù)的3.33%;28條的有28個細胞,占總細胞數(shù)的93.33%;29條的有1個細胞,占總細胞數(shù)的3.33%。按照核型分析的標準化建議[17],確定桂閩引象草的染色體數(shù)目為2n=28條。

2.4桂閩引象草核型分析

選取5個分散良好、輪廓清晰的桂閩引象草中期分裂相(圖4、5)進行測量分析,桂閩引象草染色體數(shù)目2n=28條,染色體基數(shù)x=7,為四倍體。由表2和表3可知,桂閩引象草染色體核型公式為2n=4x=28=18m(2SAT)+10sm(2SAT),由此可知,體細胞中期染色體由18條中部著絲點染色體(m)和10條近中部著絲點染色體(sm)組成,其中第2對和第4對染色體含有隨體。從染色體相對長度組成I.R.L=10S+6M1+4M2+8L來看,桂閩引象草由短染色體(S)、中短染色體(M1)、中長染色體(M2)和長染色體(L)組成,并且這14對染色體相對長度為2.95%~12.86%,相對長度指數(shù)為0.41~1.80,最長染色體與最短染色體長度比為4.36,臂比范圍為1.45~1.99,臂比值大于2的染色體比例為0(圖6)。核型不對稱系數(shù)As.K%=62.19%,按照核型分類標準,桂閩引象草核型屬于1C型。

圖4 桂閩引象草染色體中期相Fig.4 Metaphase chromosomes of P. purpureumcv. Guiminyin

圖5 桂閩引象草染色體核型圖Fig.5 Karyotype of P. purpureum cv. Guiminyin

注:1-14為染色體序號。

Note: 1-14 are chromosome number, respectively.

圖6 桂閩引象草染色體核型模式圖Fig.6 Karyotype diagram of P. purpureum cv. Guiminyin表2 兩種狼尾草屬植物的染色體核型特征比較Table 2 Chromsome karyotype parameters of P. purpureum cv. Guiminyin

染色體序號Chromosomenumber相對長度Relativelength/%相對長度指數(shù)Relativelengthindex臂比Armratio著絲點類型Typeofcentromer長度類型Typeoflength17.76+5.10=12.861.801.52mL2*7.51+4.20=11.711.641.79smL36.63+4.11=10.741.501.61mL4*5.75+3.54=9.291.301.62mL54.94+3.04=7.981.121.63mM264.71+3.25=7.961.111.45mM274.47+2.46=6.930.971.82smM183.91+2.28=6.190.871.72smM193.57+2.08=5.650.791.72smM1103.21+1.98=5.190.731.63mS113.14+1.58=4.720.661.99smS122.55+1.67=4.220.591.53mS132.19+1.42=3.610.501.54mS141.85+1.10=2.950.411.69mS

注:sm為近中部著絲點染色體。

Note: sm is submedian chromosomes.

表3 桂閩引象草的染色體核型參數(shù)Table 3 Chromsome karyotype characteristics comparision of two plants of Pennisetum

3 討論與結論

染色體的形態(tài)和數(shù)目是穩(wěn)定的細胞學特征,核型可以揭示生物在系統(tǒng)演化中的位置,也是判斷生物與其相近物種間親緣關系的重要依據(jù)[22]。本研究中,熱研4號王草染色體數(shù)為21條的比例超過85%,可以確定熱研4號王草的染色體數(shù)為2n=21條;桂閩引象草染色體數(shù)為28條的比例也超過85%,可以確定桂閩引象草染色體數(shù)為2n=28條。在研究中發(fā)現(xiàn)根尖細胞中偶爾存在附加1~2條額外染色體的非整倍體細胞,也有部分缺失的染色體。據(jù)陳志彤等[23]報道,狼尾草屬牧草染色體基數(shù)分為兩大類:一類基數(shù)為x=7,如美洲狼尾草2n=2x=14,雜交狼尾草2n=3x=21,象草2n=4x=28;另一類基數(shù)為x=9,如中亞狼尾草2n=2x=18,東非狼尾草2n=4x=36??梢酝茢?,熱研4號王草和桂閩引象草染色體基數(shù)均歸為第一類,即染色體基數(shù)為x=7,其中,熱研4號王草為三倍體,染色體數(shù)2n=21條,與雜交狼尾草一致,由此推斷熱研4號王草與雜交狼尾草親緣關系較近;桂閩引象草為四倍體,染色體數(shù)2n=28條,與象草一致,由此推斷桂閩引象草與象草親緣關系較近。熱研4號王草與桂閩引象草染色體數(shù)目和倍性均不同說明其親緣關系較遠,同時也印證了他們的來源不同,熱研4號王草由四倍體象草和二倍體美洲狼尾草雜交而成[1],桂閩引象草由臺畜草二號狼尾草選育而成。

熱研4號王草的核型不對稱系數(shù)為60.15%,由21條中部著絲點染色體(m)組成,核型類型屬于1B型;桂閩引象草的核型不對稱系數(shù)為62.19%,由18條中部著絲點染色體(m)和10條近中部著絲點染色體(sm)組成,核型類型屬于1C型(表3)。根據(jù)核型的分類標準,核型對稱性與物種進化相輔相成,核型對稱性越低的生物,染色體變異越大,物種進化程度越高;核型對稱性越高的生物,染色體變異越小,進化程度越低[24]。因此,從核型類型方面,熱研4號王草和桂閩引象草都屬于比較原始的類型,這與張懷山[25]的研究結果一致。本研究中,熱研4號王草第1組染色體及桂閩引象草第2組和第4組染色體的短臂上均發(fā)現(xiàn)了隨體,此結果在國內外鮮有報道。

目前,從國外引進的狼尾草屬牧草較多,命名比較混亂,常出現(xiàn)同物異名、同名異物的現(xiàn)象,給育種工作帶來較大困難,嚴重阻礙了狼尾草屬牧草的應用推廣和可持續(xù)發(fā)展。核型分析為研究生物系統(tǒng)發(fā)育關系和物種分化提供了重要依據(jù)[26]。

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(責任編輯 王芳)

Karyotype analysis ofPennisetumpurpureum×P.americanumcv. Reyan No.4 andP.purpureumcv. Guiminyin

Luo Zong-zhi1, Lin Jie-rong1,2, Lin Zhi-kui3, Chen Bi-cheng1, Mei Lan3, Lin Zhan-xi2

(1.College of Animal Science, Fujian Agriculture and Foresty University, Fuzhou 350000, China;2.China National Engineering Reserach Center of JUNCAO Technology, Fuzhou 350000, China;3.College of Life Science, Fujian Agriculture and Foresty University, Fuzhou 350000, China)

The present study investigated the chromosome number and karyotype ofPennisetumpurpureum×P.americanumcv. Reyan No.4 andP.purpureumcv. Gui minyin using the conventional compression method to provide theory basis of Pennisetum germplasm resources diversity protection and genetic breeding research. The results showed that their basic chromosome number was 7. Reyan No.4 was triploid and the chromosome number was 21, the karyotype formula was 2n=3x=21=21m (3SAT), the formula of chromosome relative length was I.R.L=9S+3M1+3M2+6L, three of chromosomes have trabant. Gui minyin was tetraploid and the chromosome number was 28, the karyotype formula was 2n=4x=28=18m (2SAT) +10sm (2SAT), the formula of chromosome relative length was I.R.L=10S+6M1+4M2+8L, four of chromosomes have trabant. For Reyan No.4 and Gui minyin, index of the karyotypic asymmetry was 60.15% and 62.19%, the karyotype was 1B type and 1C type, respectively. The results indicated that their karyotype belong to primitive types .

Pennisetumpurpureum×P.americanumcv. Reyan No.4;P.purpureumcv. Guiminyin; chromosome; karyotype analysis

Lin Jie-rongE-mail:fafumcs@163.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0167

2016-03-31接受日期:2016-06-29

國家林業(yè)局公益性行業(yè)專項“渾善達克沙地疏林型植被建設技術研究”(201504412);福建省科技重大專項“菌草食藥用菌產業(yè)化關鍵技術研究與示范”(2014NZ002-1);國家菌草工程技術研究中心項目“菌草生物學特性及優(yōu)良品種評價體系研究”(JCGG14020)

羅宗志(1989-),男,福建連城人,在讀碩士生,主要從事草業(yè)科學研究。E-mail:1183525491@qq.com

林潔榮(1958-),男,福建仙游人,副研究員,學士,主要從事草業(yè)科學研究。E-mail:fafumcs@163.com

S543+.903;Q943.2

A

1001-0629(2016)9-1711-07*

羅宗志,林潔榮,林志魁,陳碧成,梅蘭,林占熺.熱研4號王草和桂閩引象草的核型分析.草業(yè)科學,2016,33(9):1711-1717.

Luo Z Z,Lin J R,Lin Z K,Chen B C,Mei L,Lin Z X.Karyotype analysis ofPennisetumpurpureum×P.americanumcv. Reyan No.4 andP.purpureumcv. Guiminyin.Pratacultural Science,2016,33(9):1711-1717.

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