李鵬，陳丹丹，陳章強，楊文超，彭曉紅

(華中科技大學附屬普愛醫(yī)院，武漢430000)

?

·基礎研究·

融合蛋白PTD4-SOD1對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌的保護作用

李鵬，陳丹丹，陳章強，楊文超，彭曉紅

(華中科技大學附屬普愛醫(yī)院，武漢430000)

目的觀察融合蛋白轉(zhuǎn)導結構域4(PTD4)- 超氧化物歧化酶1( SOD1)對心肌缺血再灌注損傷(I/R)大鼠血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)及丙二醛(MDA)水平的影響，并探討其對心肌細胞的保護作用。方法 將雄性SD 大鼠40 只隨機分為假手術組(S組)、I/R組、SOD1蛋白組(SOD1組)、PTD4-SOD1融合蛋白組(PTD4-SOD1組) 4組，每組10只。免疫熒光法檢測PTD4-SOD1融合蛋白穿膜能力，比色法檢測各組血清CK、LDH水平，TBA染色法檢測各組血清MDA水平。結果 S組、I/R組、SOD1組均沒有代表融合蛋白的紅色熒光出現(xiàn)，PTD4-SOD1組出現(xiàn)紅色熒光。與S 組比較，I/R 組、SOD1 組、PTD4-SOD1 組的CK、 LDH、MDA水平明顯升高(P均<0.01)。與I/R 組、SOD1 組比較，PTD4-SOD1 組CK、 LDH、MDA水平降低(P均<0.01)。結論 PTD4-SOD1融合蛋白有較強的穿膜能力，轉(zhuǎn)導進入細胞內(nèi)部的SOD1仍保持其活性，能有效抑制脂質(zhì)過氧化反應，降低血清CK、LDH、MDA水平，對心肌細胞有保護作用。

心肌缺血再灌注損傷；蛋白轉(zhuǎn)導結構域；融合蛋白；肌酸激酶；乳酸脫氫酶；丙二醛；大鼠

蛋白轉(zhuǎn)導結構域(PTD)是以肽為載體的轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，是一種能夠?qū)⑸頎顟B(tài)下不能進入細胞發(fā)揮生物學效應的物質(zhì)帶入細胞內(nèi)的載體工具[1]。目前，國內(nèi)外研究者將有穿膜能力的多肽結構引入到超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶或者其他目的蛋白的穿透細胞膜實驗均顯示多肽結構有很強的穿膜特性[2～6]。與其他PTD 相比，本研究所選用的是PTD4具有更加穩(wěn)定的二級結構和更高的轉(zhuǎn)運效率[7]。2015年8月～2016年4月，我們觀察融合蛋白PTD4-SOD1 對心肌缺血再灌注(I/R)損傷模型大鼠血清肌酸激酶(CK) 、乳酸脫氫酶(LDH) 及丙二醛(MDA)的影響，以探討融合蛋白PTD4-SOD1對心肌的保護作用。

1　材料與方法

1.1材料融合蛋白PTD4-SOD1、SOD1 蛋白(上海生物工程有限公司)；一抗兔抗His-probe(G-18)抗體 、二抗羅丹明熒光素標記的山羊抗兔抗體、一抗小鼠抗心肌TnT 抗體、二抗異硫氰酸標記的山羊抗小鼠抗體(美國Santa cruz biotechnology 公司)；大鼠肌酸激酶試劑盒、大鼠乳酸脫氫酶試劑盒 、大鼠丙二醛試劑盒(南京建成科技有限公司)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量(330±20)g，由我院實驗動物中心提供。

1.2動物分組及處理隨機將大鼠分為4 組，每組10 只。假手術組(S 組)： 冠狀動脈只穿線不結扎，30 min 后由尾靜脈給予0.9%氯化鈉注射液1 mL。I/R 組： 缺血30 min再灌注120 min，再灌注時由尾靜脈給予0.9%氯化鈉注射液1 mL。SOD1 蛋白組(SOD1 組) ：缺血30 min再灌注120 min，于再灌注時由尾靜脈給予SOD1 蛋白500 μg(1 mL)。PTD4-SOD1 融合蛋白組 (PTD4-SOD1 組)：缺血30 min再灌注120 min，于再灌注時由尾靜脈給予PTD4-SOD1 融合蛋白500 μg(1 mL)。

1.3動物模型制備常規(guī)術前準備，10%水合氯醛腹腔注射(0.3 mL/100 g)麻醉后將大鼠仰臥位固定于手術臺上。使用規(guī)格為18G的靜脈留置針行氣管插管術，接小動物呼吸機輔助呼吸(潮氣量3 mL/100 g，頻率60 次/min，呼吸比5∶3)，經(jīng)右頸總動脈置管接壓力換能器，使用BL-420 生物系統(tǒng)監(jiān)測心電活動。于胸骨左側0.5 cm 第三、四肋間隙處切皮，鈍性分離肌肉，使用手術鉗夾斷左側第三、第四肋骨，使用小型撐開器沿胸骨縱軸方向撐開胸骨，暴露心臟，適應性放置10 min；使用小鑷子輕柔充分的撕開心包膜，適應性放置5 min，結扎左冠狀動脈前降支(LAD)。觀察心電監(jiān)護波形變化，若ST 段抬高、T 波高聳、左心室變?yōu)樯n白色為結扎成功標志。30 min 后，松解LAD 行再灌注；再灌注時心電監(jiān)護示ST 段明顯降低、T 波下降、左心室由蒼白色變?yōu)榘导t色為再灌注成功標志。

1.4血清CK 、LDH、MDA水平測定再灌注結束后，通過連有負壓管的靜脈采血針直接刺入左心室采血5 mL，經(jīng)高溫低速離心機離心(4 000 r/min，8 min)，用移液器吸取上清液，存于1.5 mL的EP 管中，置于-20 ℃冰箱。嚴格按照試劑盒說明書采用比色法、TBA染色法檢測血清CK 、LDH 及MDA水平。

1.5心肌染色及融合蛋白穿膜能力檢測采血液完畢后，使用眼科剪從主動脈根部快速剪斷，使用0.9%氯化鈉注射液經(jīng)主動脈沖洗心腔，沖洗干凈以備后用。心肌染色采用TTC 染色法，嚴格按照試劑盒說明書進行。PTD4-SOD1融合蛋白穿膜能力檢測采用免疫熒光法。

2　結果

2.1大鼠心肌染色及免疫熒光檢測情況S組大鼠無心肌缺血壞死，心肌TTC 染色為紅色；其他三組大鼠缺血梗死區(qū)TTC 染色為蒼白色，說明LAD 結扎成功。S組、I/R組、SOD1組均沒有代表融合蛋白的紅色熒光出現(xiàn)，PTD4-SOD1組出現(xiàn)紅色熒光。

2.2四組血清CK 、LDH、MDA水平比較與S 組比較，I/R 組、SOD1 組、PTD4-SOD1 組的CK、 LDH、MDA水平明顯升高(P均<0.01)。與I/R 組、SOD1 組比較，PTD4-SOD1 組CK、 LDH、MDA水平降低(P均<0.01)。見表1。

表1　四組血清CK 、LDH、MDA水平比較

注：與S 組比較，*P<0.01；與I/R 組、SOD1 組比較，△P<0.01。

3　討論

雖然PTD 轉(zhuǎn)導技術仍處于探索的早期階段，但作為一種新興技術，它不僅用于腫瘤的基因治療，還用于攜帶目的蛋白進入細胞內(nèi)部起到治療氧化應激相關疾病的作用。融合蛋白穿透細胞膜進入細胞內(nèi)部是其對缺血再灌注損傷心肌發(fā)揮保護作用的基礎。本研究中PTD4-SOD1 組在熒光顯微鏡下顯示代表融合蛋白的紅色熒光與藍色熒光及綠色熒光重合，表示融合蛋白成功穿透細胞膜進入細胞內(nèi)部，并在細胞質(zhì)內(nèi)散在分布。SOD1 組僅出現(xiàn)藍色熒光和綠色熒光，而沒有紅色熒光，說明沒有PTD4 結構的SOD1 無法進入細胞內(nèi)。

在I/R發(fā)生發(fā)展的多種可能機制中，氧自由基機制最為重要。氧自由基增加的主要原因是線粒體氧化磷酸化障礙和中性粒細胞呼吸爆發(fā)。在心臟再灌注過程中，缺血過程產(chǎn)生的黃嘌呤氧化酶被認為與活性氧(ROS)產(chǎn)生有關。ROS 能引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，并且引起細胞核和胞質(zhì)成分損傷，導致產(chǎn)生線粒體內(nèi)部自由基釋放的正反饋反應，加劇了對細胞的損傷[8～10]。因此，有效清除I/R過程中產(chǎn)生的ROS至關重要。機體通過酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)產(chǎn)生ROS，ROS 能夠攻擊細胞膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化反應，并形成脂質(zhì)過氧化物，如MDA、羥基、酮基、羰基、內(nèi)過氧基和氫過氧基。初始的一個ROS 便能導致很多脂類分解產(chǎn)物的形成，這些產(chǎn)物中，部分會導致細胞代謝及功能障礙，甚至是死亡。心肌組織缺血再灌注后，大量產(chǎn)生的ROS 引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用是再灌注損傷的首要原因。心肌缺血再灌注同時也改變了ROS產(chǎn)生和ROS 消除之間的動態(tài)平衡，即心肌缺血再灌注時，ROS嚴重增多，ROS 清除劑SOD 減少。

CK 是心肌缺血受損時血清酶中升高最早的一種酶，其釋放量是衡量心肌損害程度的重要標志[11～13]。LDH存在于所有組織細胞的細胞質(zhì)中，在急性心肌梗死發(fā)生初期，LDH 呈顯著性升高。目前，I/R過程中LDH 的升高主要認為是由于ROS 的堆積和Ca2+超載兩大因素引起。有研究者發(fā)現(xiàn)，在心肌細胞缺血缺氧時，ROS 清除系統(tǒng)的功能將會降低甚至喪失;一旦恢復血供和氧供后，ROS 便爆發(fā)性產(chǎn)生并急劇堆積，破壞膜結構完整性，Ca2+通透性增加，造成細胞慢性或急性損傷，細胞內(nèi)LDH 大量外流入血。因此，血清中LDH 的升高程度可以用來作為細胞損傷的判斷指標。本研究通過PTD 技術將ROS 清除劑SOD1 轉(zhuǎn)導入細胞內(nèi)部，觀察I/R損傷大鼠血清CK、LDH、MDA 水平變化，以確定融合蛋白對心肌的保護作用。結果顯示，PTD4 能夠?qū)⑼庠葱缘腟OD1 轉(zhuǎn)導入細胞內(nèi)部，增強了心肌ROS 清除系統(tǒng)清除ROS的能力，降低I/R時ROS 的產(chǎn)生，抑制ROS 引起的脂質(zhì)過氧化反應，實現(xiàn)了對心肌細胞的保護作用。

本研究雖已證實融合蛋白PTD4-SOD1在動物模型中穿膜后仍保持高效活性，但未對融合蛋白處理前后心功能進行測定；且融合蛋白不具靶向性，選擇合適的注射途經(jīng)也是至關重要的。若能對以上指標及注射途徑的選擇進行完善，進一步充實融合蛋白的心肌保護證據(jù)，則本研究內(nèi)容更具臨床意義。

[1] Zhao KS, Zhao GM, Wu DL,et al. Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling,oxidative cell death, and reperfusion injury[J]. J Biol Chem, 2004,279(33):34682-34690.

[2] Zhang K, Fang H, Chen Z, et al. Shape effects of nanoparticles conjugated with cell-penetrating peptides (HIV Tat PTD) on CHO cell uptake[J]. Bioconjug Chem, 2008,19(9):1880-1887.

[3] 姚玲玲，王家寧，黃永章，等.PEP-1-CAT 融合蛋白預處理對過氧化氫誘導的內(nèi)皮細胞氧化應激損傷的保護作用[J].中華心血管病雜志，2006,34(10):932-938.

[4] Rousselle C, Clair P, Temsamani J, et al.Imp roved brain delivery of benzylpenicillin with a peptide vector mediated strategy[J]. J Drug Target, 2002,10(4):309-315.

[5] Li T, Fan Y, Luo Y, et al. In vivo delivery of a XIAP(B IR3-RING) fusion protein containing the protein transduction domain protects against neuronal death induced by seizures[J]. Exp N eurol, 2006,197(2):301-308.

[6] Sun J, Yan Y, Wang XT, et al. PTD4-apoptin protein therapy inhibits tumor growth in vivo[J]. Int J Cancer, 2009,124(12):2973-2981.

[7] 姚玲玲,王家寧,黃永章,等.PEP-1-CAT融合蛋白預處理對過氧化氫誘導的內(nèi)皮細胞氧化應激損傷的保護作用[J].中華心血管病雜志,2006,34(10):932-938.

[8] 陳靖宜，劉菊英. 大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的制備及改進[J]. 臨床誤診誤治雜志，2012,25(2):14-17.

[9] 姚玲玲,王家寧,黃永章,等.PEP-1-CAT融合蛋白預處理對過氧化氫誘導的內(nèi)皮細胞氧化應激損傷的保護作用[J].中華心血管病雜志,2006,34(10):932-938.

[10] Zorov DB, Juhaszova M, Yaniv Y, et al. Regulation and pharmacology of the mitochondrial permeability transition pore[J]. Cardiovasc Res，2009(83):213-225.

[11] 施學文,陳娟,殷銘東,等.腸道病毒71型感染患兒心肌損害及心肌酶譜變化分析[J].國際流行病學傳染病學雜志,2014,41(4):241-244.

[12] 史軍然,金靜維,張秀華,等.血清肌酸激酶同工酶、肌鈣蛋白I水平在早期評估窒息新生兒心肌損害中的臨床意義[J].河北醫(yī)科大學學報,2014(11):1318-1320.

[13] 金怡汶,韓玉增,王爽,等.肌酸激酶正常的兒童皮肌炎3例并文獻復習[J].中華實用兒科臨床雜志,2014,29(21):1657-1660.

湖北省衛(wèi)計委科研基金資助項目(WJ2015MB154)。

楊文超(E-mail: eyhyg@sina.com )

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.33.009

R542.2

A

1002-266X(2016)33-0028-03

2016-03-06)