C. Y. Chiu，G. Tian　著　張水勤　袁　亮　趙秉強*　譯

（1 臺灣中央研究院生物多樣化研究中心 臺北 11529 2 美國芝加哥大都會水再生利用區(qū)環(huán)境監(jiān)測研究部監(jiān)測研究司略興研發(fā)室 西塞羅 IL 60804 3 中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 北京 100081）

運用核磁共振技術揭示生物固體修復土壤中胡敏酸的化學結構

C. Y. Chiu1，G. Tian2著張水勤3袁亮3趙秉強3*譯

（1 臺灣中央研究院生物多樣化研究中心 臺北 11529 2 美國芝加哥大都會水再生利用區(qū)環(huán)境監(jiān)測研究部監(jiān)測研究司略興研發(fā)室 西塞羅 IL 60804 3 中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 北京 100081）

應用核磁共振技術表征長期施用2個水平生物固體的土壤中提取的胡敏酸特征，以評估生物固體修復土壤中有機碳的穩(wěn)定性。同時，量化土壤中富里酸、胡敏酸和Fe/Al氧化物含量。土壤樣品采集于2004年，于伊利諾斯州西南部的富爾頓縣選取7個地塊進行取樣，取樣地塊生物固體的累積施用量分別為0（對照）、554（低施用量）和1066 mg/hm2（高施用量）。結果表明，生物固體的施用增加了土壤富里酸與胡敏酸的含量，但是生物固體修復的土壤和對照土壤的FA/HA比值沒有差異。此外，生物固體的施用不影響水溶性有機碳的含量，卻能增加土壤有機復合體中Fe/Al含量，降低其C/Fe和C/Al比例。13C核磁共振波譜結果表明，隨著生物固體的施用土壤胡敏酸中烷基碳增加和芳香碳降低，且施用量越高，變化程度越大；土壤胡敏酸碳結構也從氧烷基主導變?yōu)橥榛鲗?。生物固體的施用不能降低土壤有機碳的穩(wěn)定性，相反，能夠增加土壤腐殖質的穩(wěn)定性。

非晶型Fe/Al氧化物 生物固體 碳化學結構 胡敏酸 美國中西部 核磁共振 土壤有機碳穩(wěn)定性

隨著生物固體土壤施用量的增加，已開展了大量生物固體施用對土壤有機碳動態(tài)影響的研究，這些研究均證實生物固體的施用能夠增加土壤有機碳含量。Tian等研究指出，生物固體施用引起土壤有機碳含量增加可能源于殘留的生物固體碳和作物殘留碳向土壤有機碳轉化的增強作用。盡管多年后土壤分解殘留的生物固體碳不屬于易分解的組分，但它依舊比腐殖化的土壤有機碳更容易遭受腐殖化的影響。來源于作物殘體的新累積土壤有機碳沒有土壤原始的有機碳穩(wěn)定。因此，可以做出以下假設，生物固體的施用可能會降低土壤有機碳的穩(wěn)定性。

土壤腐殖質由富里酸（FAs）、胡敏酸（HAs）和胡敏素構成。富里酸為結構簡單、水溶性較強的低分子量組分；反之，胡敏酸為結構復雜、水溶性較差的高分子量組分。Qualls經(jīng)過1年的培養(yǎng)實驗研究，結果表明富里酸分解速度是胡敏酸的2倍，新形成的腐殖質趨向于富里酸，它可能是腐植酸的前體。因此，生物固體施用降低土壤有機碳的假設可通過FA/HA比例反映出來。水溶性有機碳含量可提供相似的信息。

過去幾十年，運用13C NMR技術確定有機材料化學結構發(fā)展迅速，然而其在土壤有機碳方面的應用仍然需要進一步研究。NMR光譜已揭示了土壤有機碳含有4個碳的功能基團：烷基碳（脂類、蠟類和脂肪族烴）、氧烷基碳（碳水化合物）、芳香碳（木質素和多酚）和羧基碳（多肽類和有機酸）。以上4種基團中有3種與土壤有機碳的穩(wěn)定性有關：氧烷基碳含量低或烷基碳和芳香碳含量高意味著土壤有機碳穩(wěn)定性的增加。一般情況下，生物固體烷基碳含量較高，長期施用生物固體可能會使土壤有機碳中烷基碳含量增加，最終增加土壤有機碳的穩(wěn)定性。然而，生物固體處理土壤的碳化學結構信息依舊缺乏，因此以上假說還沒有得到證實。

Fe/Al氧化物在土壤有機碳的穩(wěn)定過程中起到了至關重要的作用。由于土壤有機碳帶負電，而三氧化二物帶正電，一些易分解的氧烷基碳能夠被吸附于三氧化二物上，以減少微生物有機體的進入。Boudot等假設不溶的鐵和鋁氫氧化物降低了有機組分溶解性的損失，減少了土壤有機碳的分解性能。由于生物固體在非晶型的Fe/Al氧化物中富集，長期的生物固體施用能夠增加土壤非晶型Fe/Al含量，從而導致土壤有機碳穩(wěn)定性增加。與土壤有機碳結合的鐵和鋁的豐度使得檢測生物固體施用時鐵和鋁氧化物對土壤有機碳穩(wěn)定性的影響成為可能。

因此，本研究旨在通過測定腐殖質組成、碳功能基團含量和Fe/Al豐度，評價美國中西部玉米種植帶土壤生物固體施用對土壤有機碳穩(wěn)定性的復雜影響。

1　 材料與方法

1.1處理

研究區(qū)位于美國伊利諾斯州的富爾頓縣，根據(jù)美國氣象中心數(shù)據(jù)（NCDC），該地區(qū)年平均氣溫為10.4 ℃，年降雨量1013 mm。隨著露天土壤的再生利用，生物固體施用于未開采的農(nóng)田土壤以此維持土壤肥力。1972-1984年，6種生物固體修復的土壤（F19、F21、F22、F35、F36和F40）以液態(tài)生物固體的形式進行施用，1984年平均累計施用量達554 mg/hm2（干重），從1985-2002年，F(xiàn)35和F36處理分別于1991年、1998年和2002年額外施用3次生物固體，取樣時總累計施用量達1066 mg/hm2（干重）。F19、F21、F22和F40處理僅在初期施入554 mg/hm2，被認為是“低量生物固體”處理。F35和F36處理有液體生物固體、風干生物固體的施入，總施入量達1066 mg/hm2，被認為是“高量生物固體”處理。F83處理作為對照處理，未有生物固體施入，但每年施用氮磷鉀分別約為300、100、100 kg/hm2。對照土壤的類型由Udollic Endoaqualfs和Typic Endoaquolls組成。生物固體修復的土壤類型包括Udollic Endoaqualfs（F19和F22）、Mollic Hapludalfs（F21）、Typic Hapludalfs（F35）、Aquic Argiudolls（F36）和Typic Endoaquolls/Alfic Udarents（F40）。大部分地塊面積為10～20 hm2，表層土壤pH為中性，質地變化較大，主要是從粉質砂壤土到粉質黏壤土。主要種植作物為玉米、小麥和大豆輪作，不定期種植冬季覆蓋作物——黑麥草或者在生物固體施用的當年休耕。

所有的生物固體均產(chǎn)自芝加哥，由污水處理污泥于35 ℃厭氧消解15天及以上而制得。厭氧消解液態(tài)的生物固體運至試驗點，農(nóng)田施用前在持水池中貯存數(shù)月乃至數(shù)年。生產(chǎn)風干的生物固體，厭氧消解的液態(tài)或脫水的生物固體貯存于瀉湖18個月后用病菌進一步還原至甲等水平。然后挖出瀉湖中的材料，并平鋪在臺面上攪拌，直至獲得大約65%的固體。液態(tài)生物固體中有機質（通常報道為揮發(fā)性固體，是生物固體熟化的指示指標）含量約為44%，風干生物固體約為33%；液態(tài)生物固體中Fe和Al總量平均值分別為4.4%和1.3%，風干生物固體中分別約為2.8%和1.2%。風干生物固體中鐵含量低于液態(tài)，主要是由于自1993年US EPS，s 40 CFR 503條例頒布后，污水中金屬濃度一般較低。生物固體施入表層土壤。

1.2土壤取樣和加工

于2004年春天取0～15 cm耕層土壤樣品。每個地塊分為2部分，根據(jù)面積大小每部分取20～40個點，組成一個混合土樣。為避免土壤的空間分布差異，在整個地塊取樣時采取隨機布點的方式。每個地塊的2部分土樣最終混合成一個樣。樣品風干后，過2 mm篩；取部分土樣過0.25 mm篩，用來測定土壤有機碳。

1.3實驗室分析

1.3.1碳和Fe/Al

土壤有機碳含量用濕式燃燒法（Walkley和Black，1934）測定?？偟挠坞x鐵和鋁氧化物含量用連二亞硫酸鹽-檸檬酸-重碳酸鹽（DCB）方法（Mehra和Jackson，1960）測定。非晶型的鐵和鋁的氧化物含量用草酸銨（pH 3）浸提（McKeague和Day，1966）測定。有機結合態(tài)的鐵和鋁含量用焦磷酸鈉（pH 10）提?。↙oveland和Digby，1984）。

1.3.2土壤有機碳組分的提取

土壤水溶性有機碳用Millipore Milli-Q水以土水比1∶30的比例連續(xù)浸提，然后以200 rpm的速度在室溫下振蕩6 h。提取液在10000×g的速度離心15 min，上清液濾過Whatman No. 42濾膜。

腐殖質用堿液浸提。非腐殖質成分用0.1 M HCl去除，然后進行FA和HA的進一步提取，即用0.1 M NaOH（土和浸提液比例為1∶10），室溫下于氮氣環(huán)境中提取4 h。上清堿液以10000×g的速度離心10 min后進行分離。離心過程重復3次直至溶液顏色變淺。將所有的提取液混合。

上清液倒出后，用6 M HCl酸化至pH為1，且在室溫下保存24 h以沉淀胡敏酸。上清液為富里酸溶液，沉淀為胡敏酸，以8000×g速度離心15 min后進行分離。胡敏酸用HCl-HF混合液進行純化，然后用蒸餾水徹底洗滌，溶于0.1 M NaOH。

可溶性有機碳，富里酸和胡敏酸組分均通過TOC Analyzer-O.I. Analytical 1010用加熱過硫酸鹽氧化法分析其有機碳總量。部分胡敏酸組分冷凍干燥，用于進行核磁表征。

1.3.3固態(tài)13C交叉極化-魔角旋轉（CPMAS）核磁

胡敏酸組分C組成用固態(tài)13C交叉極化-魔角旋轉（CPMAS）核磁進行測定。樣品量為0.25 g。用配有7 mm直徑樣品管的Bruker DSX 400 MHz核磁光譜儀進行測定。數(shù)據(jù)獲得條件如下所示：掃描頻率100.46 MHz，掃描速度7000 Hz，接觸時間6 ms和緩沖延遲時間1 s。每個樣品約掃描5000次。總的信號強度和每個碳功能基團的比例按以下化學位移區(qū)域劃分：0～50 ppm（烷基碳），50～90 ppm（氧烷基碳），90～110 ppm（二氧烷基碳），110～165 ppm（芳香碳）和165～190 ppm（羧基碳）。甲氧基碳（50～60 ppm）在氧烷基碳區(qū)域有一個寬的肩峰。本研究中將二氧烷基碳含量加到烷氧基碳中。通過計算光譜區(qū)面積得到不同碳的官能團相對含量，并以該區(qū)域占總光譜區(qū)域的面積百分比表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

低量生物固體修復土壤是否與對照差異顯著采用零假設單因子t檢驗法進行檢驗。由于生物固體施用土壤特性的相應比例是希望隨著生物固體施用比例的增加而降低，高量生物固體處理可能不同于低量生物固體處理。因此，在高量和低量生物固體處理差異顯著性檢驗方面，本文使用不等方差學生t檢驗。P＜0.05被視為差異顯著性的標準。

2　 結果與討論

2.1HA/FA和水溶性有機碳

用生物固體修復的土壤富里酸和胡敏酸含量均高于對照處理（表1），這反映了隨著生物固體的施用，土壤中有腐殖質的形成。盡管施用高量生物固體的處理土壤FA/HA比例相對較高，但生物固體修復土壤與對照土壤相比，F(xiàn)A/HA比例并沒有顯著差異。施用低量生物固體的處理是從1985年停止的，約為檢測年份的20年前；而高量生物固體施用的處理是在2002年最后一次施用的，為取樣的2年前。因此本研究的結果表明，新施用生物固體的土壤可能會具有較高含量的FA/HA比值；但隨著生物固體的降解，F(xiàn)A/HA比例將接近對照處理。生物固體施用對可溶性土壤有機碳的影響與其對FA/HA比值的影響相似。

如第1段所述，F(xiàn)A/HA比值是腐殖質穩(wěn)定性的表征。故FA/HA結果意味著施用生物固體后土壤腐殖質的穩(wěn)定性會短暫降低；但隨生物固體施用的終止，穩(wěn)定性會得到改善，達未修復前的水平。土壤水溶性有機碳結果與以上結論一致。

表1　生物固體施用對土壤有機碳含量和土壤腐殖物質組成的影響Tab.1 Effect of biosolids application on soil organic carbon （SOC） concentration and composition of humic substances in soil

2.2NMR

從生物固體修復和對照土壤中提取的胡敏酸的固相13C CPMAS NMR光譜如圖1所示。所有波譜均在化學位移23、30、56、73、105、130、148 、173 ppm處出現(xiàn)化學位移的峰。生物固體修復和對照土壤核磁光譜圖在烷基碳和芳香碳的峰處出現(xiàn)差異（圖1）。生物固體修復的土壤烷基碳峰強于對照土壤，而芳香碳的趨勢與此相反。

胡敏酸碳功能團的分布計算結果如表2?？梢钥闯?，胡敏酸烷基碳和芳香碳含量均對生物固體施用有響應。生物固體施用明顯地增加了胡敏酸烷基碳的含量，且含量越高增加得越多；胡敏酸的芳香碳含量隨著生物固體的施用而降低；生物固體施用后氧烷基和羧基碳含量保持不變。因此，生物固體的施用使土壤胡敏酸從氧烷基碳主導轉化為烷基碳主導。

生物固體修復土壤烷基碳含量的增加有以下幾種解釋：在污水處理過程中，O2或者空氣通入水流而進行曝氣，使腐生細菌或其他細菌吃掉了可溶有機質，這些細菌的數(shù)量通過污泥（廢活性污泥）的歸還部分保持不變。因此，沉淀池內污泥中有機質含有使生物固體固有烷基碳官能團富集的細菌代謝物。本研究中生物固體的長期施用將大量增加土壤中烷基碳的量，進而導致土壤胡敏酸中烷基碳含量較高。通過用葡萄糖（烷基碳）開展土壤培養(yǎng)實驗，檢測其13C CPMAS NMR光譜。Hopkins和Chudek研究發(fā)現(xiàn)，碳水化合物的微生物代謝作用導致烷基碳的累積。Tian等研究結果表明，生物固體的施用增強了土壤微生物活性。因此，增加的烷基碳部分也可能是由于生物固體促進了土壤微生物的過程。

氧烷基官能團主要由纖維素、半纖維素組成，它們不具有抗細菌分解的能力。烷基碳官能團被認為是最穩(wěn)定的碳。Chen和Chiu研究結果表明，高山土壤細粒度部分主要累積的是烷基碳抗氧化材料。烷基碳和芳香碳結構是木炭中占主導地位的有機碳。一些烷基碳具有較高的分子移動性，這影響著隨生物固體施用的化合物的應用。根據(jù)K?gel-Knabner等的研究結果，可移動的烷基比其剛性部分更容易降解。Smith等通過對生物固體處理烷基碳的檢測發(fā)現(xiàn)，烷基碳含量隨著厭氧消化的不斷進行而顯著降低。Piterina等也發(fā)現(xiàn)了類似的結果，即施用生物固體過程降低烷基碳含量。本研究中，生物固體的施用經(jīng)受了厭氧消化，這可能會有助于易變的烷基的分解。此外，自生物固體施用后，低量生物固體處理加權平均時間為25年，而高量施用的年限為18年，這給易變的烷基足夠的分解時間。因此，觀測到的大部分烷基碳都應是剛性結構，這一點需要進一步研究證實。因此，生物固體的施用使腐植酸中氧烷基碳主導向烷基主導發(fā)生轉變，增強了胡敏酸的穩(wěn)定性。Lorenz等強調，土地利用與管理方式使土壤有機碳庫增加應包括地下生物量中脂肪族化合物比例的增加，生物固體應是實現(xiàn)此目的的理想候選物。由于生物固體芳香碳含量低于烷基碳含量，生物固體碳向胡敏酸的轉化將稀釋胡敏酸中芳香碳的濃度。由于芳香有機物有助于胡敏酸抗分解，芳香碳含量的降低也降低了胡敏酸的穩(wěn)定性?？傊谏锕腆w施用條件下，胡敏酸的穩(wěn)定性保持不變。

表2　生物固體施用對土壤中胡敏酸官能團分布的影響Tab.2 Distribution of C functional groups of soil humic acids as affected by biosolids application %

2.3Fe/Al

生物固體的施用極大地增加了土壤中自由鐵氧化物的含量，并且施用生物固體修復的土壤中非晶型鐵含量也顯著高于對照（表3）。土壤有機質帶的是負電荷，而鐵氧化物帶的是正電荷。在特定條件下，有機質和鐵氧化物能緊密結合在一起。由于非晶型鐵氧化物具有較大的比表面積，有機質-鐵結合物中的鐵主要是該種形態(tài)的鐵。用生物固體修復的土壤中，鐵多數(shù)以非晶型形態(tài)存在，這有利于鐵與土壤有機質的結合，從而導致高含量的鐵與土壤有機質結合（表3）。本研究結果表明，施用生物固體降低了土壤C/Fe值，這意味著生物固體的施用不但增加了鐵與土壤有機質結合的總量，而且增加了有機質中鐵的含量。土壤有機質具有較高的鐵強度，可能會增加土壤有機質的穩(wěn)定性。生物固體鋁對土壤有機碳化學鍵的貢獻也值得注意，但施用生物固體修復土壤后，土壤C/Al值與對照土壤的差異遠低于C/Fe值。

表3　生物固體施用對土壤中鐵、鋁形態(tài)的影響Tab.3 Species of Fe and Al in soil as affected by biosolids application

3　 結論

土壤長期施用生物固體不改變其FA/HA比值，但卻能主導使土壤中胡敏酸的碳結構從氧烷基向具有少了芳香組分的烷基轉化。它的施用能夠使與土壤有機質結合的Fe/Al增加。總之，長期施用生物固體可增強土壤有機質的穩(wěn)定性。然而，本研究沒有進行中間周轉時期土壤顆粒碳的測定，這可能也會影響整個土壤有機碳的穩(wěn)定性。

（略）

譯自：Applied Soil Ecology，2011，49：76～80。

腐植酸，爭做綠色農(nóng)資的排頭兵

工業(yè)綠色發(fā)展是生態(tài)文明建設的重要內容，也是工業(yè)轉型升級的必由之路。2016年7月13日，在“石油和化工行業(yè)綠色發(fā)展大會”上，工信部節(jié)能與綜合利用司楊鐵生副司長強調，到2020年將建設千家綠色示范工廠和百家綠色示范園區(qū)。目前，首批51家示范園區(qū)已經(jīng)建成，其中石化行業(yè)有19家。楊司長特別對煉油、石化、化肥、農(nóng)藥、涂料等重點行業(yè)提出了要求，按照廠房集約化、原料無害化、生產(chǎn)潔凈化、廢物資源化、能源低碳化原則進行改造。

腐植酸具有天然、綠色、環(huán)保、低碳的自然屬性。從原料來源——生產(chǎn)過程——產(chǎn)品特點，完全符合工信部設立的綠色農(nóng)資的生產(chǎn)要求。

希望全國腐植酸肥料、農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)，抓住機遇，爭做我國綠色農(nóng)資開發(fā)應用的排頭兵。

（中腐協(xié)技術開發(fā)部 供稿）

Chemical Structure of Humic Acids in Biosolids-amended Soils as Revealed by NMR Spectroscopy

C.Y. Chiu1， G. Tian2write， Zhang Shuiqin3， Yuan Liang3， Zhao Bingqiang3*translate
（1 Biodiversity Research Center， Academic Sinica， Taibei， 11529 2 Environmental Monitoring and Research Division， Monitoring and Research Department， Metropolitan Water Reclamation District of Greater Chicago， Lue-Hing R&D Laboratory， Cicero， IL 60804 3 Institute of Agricultural Resources and Regional Planning， CAAS， Beijing， 100081）

We used NMR spectroscopy to characterize humid acids extracted from soils that had received long-term application of 2 levels of biosolids to evaluate the soil organic matter （SOM） stability in biosolids-amended soils. The study also quantif ed fulvic acids （FAs）， humic acids （HAs） and Fe/Al oxides. The soils were collected in 2004 from 7 f elds， in Fulton County， southwestern Illinois， which received biosolids at a cumulative rate of 0 （control）， 554 mg/hm2（low biosolids） and 1066 mg/hm2（high biosolids）. The application of biosolids increased both FA and HA contents， but biosolids-amended soil and control soil did not differ in FA/HA ratio. Biosolids application had no effect on water-soluble organic carbon content. Biosolids application increased the presence of Fe/Al in the SOM complex and lowered its C/Fe and C/Al ratios.13C NMR spectra showed increased alkyl C and decreased aromatic C content in soil HAs with the application of biosolids， and the extent of such changes was higher with high than low biosolids treatment. Under biosolids application，the soil HAs’ C structure shifts from O-alkyl-dominant to alkyl-dominant. Biosolids application does not decrease SOMstability but rather increases the stability of soil humic substances.

amorphous Fe and Al oxides； biosolids； carbon chemical structure； humic acids； midwest United States；NMR； soil organic carbon stabilization

TQ314.1，O482.53+2

A

1671-9212（2016）04-0034-06

2015-09-23

張水勤，女，1988年生，在讀博士研究生，主要從事肥料資源利用研究。*通訊聯(lián)系人：趙秉強，男，研究員，E-mail：bqzhao@163.com。