馬宗琪　崔　靜　王　秀　刁潤潔　傅雁春　楊　文　王修順　邱念偉（曲阜師范大學生命科學學院， 山東　曲阜　273165）

樹木葉片葉綠素含量三種測定方法的比較*

馬宗琪崔靜王秀刁潤潔傅雁春楊文王修順邱念偉**
（曲阜師范大學生命科學學院， 山東曲阜273165）

丙酮浸提法測定油松和楊樹葉片葉綠素含量比丙酮研磨提取法和二甲基亞砜-丙酮兩步快速提取法偏低10%～30%；葉綠素a/b比也存在一定差異。而對于小麥和油菜三種方法測定結果基本一致。樹木葉片葉綠素含量結果偏低的主要原因是丙酮浸提后的葉片材料中仍有少量褐色（楊樹）或淺黃色物質(zhì)（油松）。上述殘余材料中的色素在65℃下用二甲基亞砜再次浸提，或者常溫下用二甲基亞砜進行研磨提取，測定吸光度發(fā)現(xiàn)上述殘余材料中的色素對葉綠素a和b的吸光度具有顯著干擾，導致吸光度增大，測定結果偏高。丙酮浸提法不會將干擾物質(zhì)溶出，或者溶出較少，葉綠素含量測定最為準確，適合含有次生有色物質(zhì)的樹木葉片的葉綠素含量測定。

樹木；葉片；葉綠素含量；次生代謝物；丙酮；二甲基亞砜

葉綠素含量是反映樹木健康狀況的最常用的生理指標之一。能夠用來提取葉綠素的有機溶劑，如氯仿、石油醚、二甲基甲酰胺、乙醇、丙酮、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）等［1-3］。其中80%丙酮提取測定法最為常用。因為葉綠素在80%丙酮溶液中的溶解度最大；80%丙酮還能減少丙酮的揮發(fā)，加快植物材料尤其是干材料中葉綠素的提取速度，也可以避免材料中的水分影響吸光度［3］。該方法最早由Arnon于1949年提出，后經(jīng)陳毓荃、Lichtenthaler、段光明等人修正，在大部分實驗教材和參考文獻中廣泛應用［4-6］。80%丙酮提取葉綠素大多采用研磨法，提取過程復雜繁瑣，需要經(jīng)過稱重、研磨、洗滌、過濾、定容等步驟，植物材料和試劑的用量都較大，不適合大批樣品的測定［7，8］。提取過程中，由于提取容器、研缽、濾紙等黏附葉綠素會造成葉綠素測定結果偏低［7，9］。2010年舒展等人發(fā)明了綠色組織80%丙酮直接浸提法［8］，該方法大大減小了實驗工作量，節(jié)省了試劑和植物材料的用量，但提取時間過長。為提高提取速度，本實驗發(fā)明了DMSO-80%丙酮兩步快速提取法［10］，在用上述方法測定樹木葉綠素含量時發(fā)現(xiàn)，3種測定方法測定結果差異較大。本文系統(tǒng)分析了樹木葉片葉綠素含量測定誤差產(chǎn)生的原因，確定了樹木葉片葉綠素含量測定的最優(yōu)方案。

1　材料與方法

1.1實驗材料

采用小麥（Triticum aestivum）、油菜（Brassicacampestris）、油松 （Pinus tabuiaeformis）、毛白楊（Populus tomentosa）等4種植物的葉片為實驗材料，比較和篩選適合樹木葉片葉綠素含量測定的方法。其中小麥和油菜葉片用于分析三種測定方法差異性產(chǎn)生的原因。

1.2提取方法

1.2.180%丙酮直接浸提法（以下簡稱浸提法）

用直徑為0.9cm的打孔器將小麥、油菜、楊樹等植物的葉片鉆取2個葉圓片，切成寬度為1mm的細絲；油松針葉稱取100mg，切成1mm的小段。上述材料放入10mL具塞試管中，直接用10mL 80%丙酮4℃下暗處浸泡提取一周，至葉片無色或白色，然后測定葉綠素溶液在663.6nm、646.6nm處的吸光度。

1.2.280%丙酮研磨提取法（以下簡稱研磨法）

按1.2.1的方法鉆取葉圓片10片，或稱取油松針葉0.5g，置于預冷的研缽中，加入少許CaCO3和石英砂，用少量預冷80%丙酮充分研磨后過濾，再用少量80%丙酮洗滌研缽、研棒、殘渣和濾紙，并再次過濾，合并濾液于50mL容量瓶中，定容至50mL備用，然后測定663.6nm、646.6nm處的吸光度。

1.2.3兩步快速浸提法（以下簡稱兩步法）

按1.2.1的方法將植物材料放入10mL具塞試管中，先用2mL DMSO 65℃下避光提取至葉片完全褪色（約需0.5～3 h），然后用8mL 80%丙酮稀釋并混勻，然后測定663.6nm、646.6nm處的吸光度。

1.3葉綠素含量計算

浸提法和研磨法用Porra等人（1989）的修訂公式［3］計算葉綠素濃度：Ca（mg/L）=12.25A663.6-2.55A646.6；Cb（mg/L）=20.31A646.6-4.91A663.6，CT=Ca+Cb。兩步法用邱念偉等人（2016）推導的矯正公式［10］計算葉綠素濃度：Ca（mg/L）=12.27A663.6-2.52A646.6；Cb（mg/L）=20.10A646.6-4.92A663.6；CT=Ca+Cb。

2　結果與分析

2.1三種方法測定葉綠素含量的結果比較

在研究葉綠素快速提取與精密測定實驗中（邱念偉等2016），我們以同等質(zhì)量或面積的植物材料，分別用三種方法提取葉綠素，測定663.6nm、646.6nm處的吸光度后，代入各自的葉綠素含量計算公式，發(fā)現(xiàn)三種方法測定小麥、油菜的葉綠素含量，葉綠素總含量和葉綠素a/b相差不大。但是楊樹葉片和松樹葉片葉綠素含量差異極大，用丙酮浸提法測定的楊樹葉綠素含量比兩步法和研磨法分別低28.3%和25.9%；而松樹分別低18.4%和13.2%。三種測定方法測定結果差異較大，影響實驗結果的可靠性。分析這一差異產(chǎn)生的原因，對準確測定樹木葉片的葉綠素含量具有重要意義。

表1　三種提取方法提取測定葉綠素含量結果的比較

2.2丙酮浸提法浸提時間對實驗結果的影響

丙酮浸提法測定樹木葉片的葉綠素含量結果偏低很有可能是由于浸提時間不夠，提取不完全導致。為此，我們?nèi)⊥荣|(zhì)量或面積的植物材料，放入具塞試管中，用10mL 80%丙酮在4℃下浸提不同時間，測定葉綠素含量的變化。結果顯示4種植物葉片的葉綠素含量大約在2～4天內(nèi)被完全提取，超過4天，葉綠素含量不再增加，說明葉綠素已經(jīng)提取完全。楊樹葉片用80%丙酮浸提了7天，所以浸提法測定結果偏低不是由于提取時間短，葉綠素未完全提取造成的。

圖1　四種植物葉片80%丙酮浸提法提取時間

2.3丙酮浸提法浸提過程中葉綠素的降解

由于丙酮浸提法需要時間過長，其測定結果偏低也有可能是長時間提取過程中葉綠素降解造成的。我們將上述材料完全提取的葉綠素溶液放置在4℃冷藏冰箱中保存1～7天，每天測定葉綠素濃度變化，計算葉綠素含量，觀察葉綠素降解情況。葉綠素溶液在4℃下保存7天后，僅有微弱的降解。楊樹和油松葉綠素含量分別僅下降了2.86% 和2.37%。而浸提法測定結果比研磨法或兩步法低13%～28%（表1）。

表2　葉綠素在低溫提取過程中的降解

2.4丙酮浸提法提取殘渣的顏色

葉綠素是否從葉片中完全提取，可以從提取殘渣的顏色進行判斷。小麥和油菜用三種方法提取后，殘渣呈白色半透明狀或白色粉末（表3），說明這兩種植物的葉綠素已被完全提取。但楊樹用80%丙酮浸提7天后，殘渣仍然呈褐色；油松的殘渣則呈淺黃色。用兩步法或研磨法提取楊樹和油松的葉綠素，殘渣則為白色半透明狀或白色粉末。浸提法的殘渣再用DMSO 65℃高溫提取，并無綠色物質(zhì)溶出，也證明浸提法可以將葉綠素完全溶出，殘渣中已無葉綠素。根據(jù)上述現(xiàn)象，我們推測，浸提法殘渣中的有色物質(zhì)可被DMSO高溫提取或者研磨提取，從而可能會對葉綠素a和b的吸光度具有顯著干擾，導致兩步法和研磨法吸光度測定結果偏大。

表3　三種提取方法提取葉綠素后葉片殘渣的顏色

2.5丙酮浸提法提取殘渣中有色物質(zhì)的溶出及其對葉綠素吸光度的干擾

浸提法的楊樹葉片殘渣中的褐色物質(zhì)用DMSO高溫65℃下浸提，褐色物質(zhì)仍然無法溶出；但在高溫65℃下DMSO能溶出松樹殘渣中的黃色素，使油松殘渣變白。將楊樹的褐色殘渣用DMSO研磨提取，則能溶解出部分褐色物質(zhì)，殘渣變成淺褐色粉末。將兩種樹木葉片的有色殘渣按照上述兩種辦法分別用DMSO提取，然后再用80%丙酮稀釋。DMSO和80%丙酮的用量與葉片樣品完全一致，然后測定有色干擾物質(zhì)在663.6nm和646.6nm處的吸光度。表4結果顯示，殘渣的有色提取物在663.6nm和646.6nm處有顯著的光吸收，其對葉綠素a和葉綠素b的干擾值與兩步法及研磨法的吸光度偏大值比較接近。說明兩步法和研磨法葉綠素測定結果偏大主要是由殘渣中有色物質(zhì)所造成。因此楊樹葉片或油松葉片的葉綠素含量測定用丙酮浸提法更為準確。兩種有色物質(zhì)的吸光度與兩步法及研磨法的吸光度偏大值并不完全一致可能是因為干擾物質(zhì)在不同條件下溶出量不同所致。

3　討　論

3.1本文在論證兩步快速提取法的可行性時發(fā)現(xiàn)，研磨法和兩步法測定楊樹和油松葉片的葉綠素含量比丙酮浸提法高13%～28%，如此大的誤差會顯著影響實驗結果可靠性［10］。系統(tǒng)分析了這一誤差產(chǎn)生的原因，為樹木葉片葉綠素含量測定選擇合適的方法提供參考。

3.2實驗結果顯示，丙酮浸提法可以充分提取葉片中的葉綠素，長時間浸提過程雖有少量葉綠素的降解，但不足以引起葉綠素含量的大幅度降低。但浸提法提取葉綠素的葉片殘渣中有明顯的有色物質(zhì)，楊樹葉片殘渣呈褐色，油松葉片殘渣呈淺黃色。兩種葉片殘渣中的有色物質(zhì)可用DMSO高溫提取或者DMSO研磨提取，它們在663.6nm和646.6nm處的吸光度與兩步法和研磨法的吸光度偏大值相接近。因此可以推斷兩步法和研磨法測定結果偏大主要是由于樹木葉片中的有色次生物質(zhì)對葉綠素吸光度有明顯干擾。

3.3這些有色物質(zhì)的成分還不清楚，李春媛等報道楊樹葉片中含有大量的酚類化合物［11］，酚類化合物氧化可以變成褐色的醌，可以使楊樹具有抗病、抗蟲、抗低溫及抗強光的能力。醌類常溫下難微溶水，高溫下可增加溶解度，可能是兩步法測定結果偏高的原因；研磨法也有助于酚類的溶出，對葉綠素吸光度造成干擾。因此推測楊樹葉片殘渣中的褐色物質(zhì)可能是醌類。醌可能是在提取過程中有酚類氧化產(chǎn)生，也可能在葉片中已經(jīng)產(chǎn)生，因為楊樹葉片呈深綠色。松樹葉片中含有大量的松脂，松脂中的松香為微黃色，屬于萜類化合物，松針殘渣中的黃色物質(zhì)有可能是松脂［12］。因此，凡是含有類似有色次生代謝物質(zhì)的葉片，其葉綠素含量測定最好用80%丙酮直接浸提法，以減少此類物質(zhì)溶出，減小其對葉綠素吸光度的干擾，提高測定結果準確性和可靠性。

表4　浸提法提取殘渣中有色物質(zhì)對葉綠素吸光度的干擾

［1］蘇正淑，張憲政.幾種測定植物葉綠素含量的方法比較［J］.植物生理學通訊，1989，25（7）：75-78.

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［3］Porra RJ.Thechequered history of the development and use ofsimultaneousequationsfortheaccuratedeterminationofchlorophylls a and b［J］.Photosyn Res，2002，73（1-3）：149-156.

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［5］Lichtenthaler HK.Chlorophylls andcarotenoids：Pigments of photosynthetic biomenbranes［J］.Meth Enzymol，1987，148：350-382.

［6］段光明.葉綠素含量測定中Arnon公式的推導［J］.植物生理學通訊，1992，28（3）：221-222.

［7］張其德.測定葉綠素的幾種方法［J］.植物學通報，1985，3 （5）：60-64.

［8］舒展，張曉素，陳娟，等.葉綠素含量測定的簡化［J］.植物生理學通訊，2010，46（4）：399-402.

［9］許大全.葉綠素含量的測定及其應用中的幾個問題［J］.植物生理學通訊，2009，45（9）：896-898.

［10］邱念偉，王修順，楊發(fā)斌，等.葉綠素的快速提取與精密測定［J］.植物學報，2016（印刷中）.

［11］李春媛，王洋，于文喜.楊樹酚類物質(zhì)對春季溫度驟降的響應［J］.東北林業(yè)大學學報，2009，37（5）：4-6.

［12］宋湛謙，梁志勤，劉星，等.中國油松組松樹松脂的化學特征［J］.林產(chǎn)化學與工業(yè)，1993，13（2）：97-102.

第1作者簡介：馬宗琪（1964-），男，實驗師，研究方向：植物生理學實驗技術。

（責任編輯：張亞楠）

Comparativestudy on threemethods ofchlorophyllcontent Determination of Tree Leaves

MA Zongqi
（College of Lifescience，Qufu Normal University，ShandongQufu273165）

Our results in this papershowed thatchlorophyllcontent of Pinus trees and Populus trees determined by direct extractionmethod with acetone was lower 10%～30%than that of the grindingmethod with acetone or two-step extraction with dimethylsulfoxide（DMSO）and acetone.The ratio ofchlorophyll a tochlorophyll b also had obvious variability among the threemethods.However，there was no obvious difference among threemethod inchlorophyllcontent of wheat and rape.Small amount of brownsubstance in Populus trees leaves and yellowsubstance in Pinus trees leaves were themaincauses resulting in the lowchlorophyllcontent determined by direct extractionmethod.The residualsubstance in above plantmaterial were extracted with DMSO at 65℃or extracted with DMSO by grindingmethod，and their absorbance at 663.6nm，646.6nm weremeasured.The absorbance resultsshowed that the residualsubstance in leaves had obvious interference on the absorbance ofchlorophyll a andchlorophyll b，which results in an increase ofchlorophyll absorbance andmeasured results.Thecoloredsecondarysubstancescould not be extracted by direct extractionmethod with acetone，or little be extracted.So themeasured results ofchlorophyllcontent by direct extractionmethod with acetone is themost accuratemethod among the threemethods.Chlorophyllcontent of tree leaves withcoloredsecondarysubstancesshould be determined using birect extractionmethod.

Tree；Leaf；Chlorophyllcontent；Secondarysubstances；Acetone；DMSO

S718.43，Q945.11

A

1001-9499（2016）05-0042-04

邱念偉（1976-），男，副教授，研究方向：植物光合作用。

2016-07-20

* 山東自然科學基金（ZR2015DL009）；曲阜師范大學實驗教改項目（SJ201409）和國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201510446053）資助