盧婷 林二培 張俊紅等

摘要[目的]研究榧樹雄球花發(fā)育過程中可溶性蛋白的動(dòng)態(tài)變化，以進(jìn)一步分離與花芽分化相關(guān)的特異蛋白。[方法]以榧樹雄株花芽及芽基部葉片為材料，測定分析雄球花發(fā)育過程中可溶性蛋白含量以及特異蛋白組分的動(dòng)態(tài)變化。[結(jié)果]在雄球花發(fā)育過程中，花枝葉片的可溶性蛋白存在2個(gè)表達(dá)高峰，分別在鱗片分化期和二核期花粉粒形成期；而花芽中的可溶性蛋白含量呈現(xiàn)一直下降的趨勢。SDSPAGE分析結(jié)果也表明，在雄球花發(fā)育的不同階段，在花枝葉片和花芽中均出現(xiàn)了特異的蛋白譜帶。[結(jié)論]為了解榧樹雄球花發(fā)育的生理過程和進(jìn)一步研究香榧成花調(diào)控提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞榧樹；雄球花；可溶性蛋白

中圖分類號S718.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2016）04-219-03

The Dynamic Changes of Soluble Proteins during Staminate Strobili Development in Torreya grandis

LU Ting1，2，LIN Erpei1，ZHANG Junhong1，LOU Xiongzhen1* et al （1.School of Forestry and Biotechnology，Zhejiang A&F University，Linan，Zhejiang 311300； 2.Yuyao Municipal Bureau of Agriculture and Forestry Seed Management Station，Yuyao，Zhejiang 315400）

Abstract[Objective] To study the dynamics of soluble protein in development process of Torreya grandis staminate strobili，and further isolate specific proteins related to flower bud differentiation.[Method] With male plant flower bud and bud base leaves as materials，the dynamics of soluble protein content and specific protein components during development were determined and analyzed.[Result] During the development of staminate strobili，there were two expression peaks for the soluble proteins in the leaves，which were shown at the microsporophyll differentiation stage and binuclear pollen stage，respectively； while in staminate strobili，the contents of soluble proteins presented the downward trend.Meanwhile，analysis of the SDSPAGE also indicated that several specific protein components were shown in the leaves and staminate strobili.[Conclusion] The study results can provide reference for understanding the physiological process of Torreya grandis staminate strobili，and further research of flowering regulation of Torreya grandis.

Key wordsTorreya grandis； Staminate strobili； Soluble proteins

香榧（Torreya grandis）屬紅豆杉科榧屬，是從榧樹（T.grandis）的自然變異類型中經(jīng)無性繁殖培育而成的優(yōu)良品種，集食用、藥用、油用、材用和觀賞綠化于一身，栽培經(jīng)濟(jì)效益顯著，其果實(shí)是我國特有的珍稀干果[1-3]。浙江省是我國香榧重要的產(chǎn)區(qū)，但香榧營養(yǎng)生長期長，“大小年”現(xiàn)象突出，嚴(yán)重限制其產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展[4]。從生理角度講，營養(yǎng)生長期和“大小年”等生產(chǎn)相關(guān)的問題均與香榧花芽形成分化有關(guān)。因此，開展香榧花芽形成的生理及其調(diào)控研究，對于推動(dòng)當(dāng)前香榧產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

多年生木本植物花芽的形成受到復(fù)雜的內(nèi)在因子和環(huán)境因素的調(diào)控，現(xiàn)有研究表明蛋白質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化與植物花芽形成分化有關(guān)。何紹蘭等[5]以金柑（Fortunella margarita）、椪柑（Citrus reticulata cv.Ponkan）、宮川溫州蜜柑（Citrus unshiu cv.Miyagawa Wase）為材料，分析了促、抑花處理對芽體蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)變化的影響，結(jié)果表明在花芽誘導(dǎo)期間，經(jīng)抑花處理的芽組織中出現(xiàn)新合成的小分子、中性至弱堿性蛋白質(zhì)，而隨著花芽由生理分化向形態(tài)分化過渡，環(huán)割處理的花芽組織出現(xiàn)小分子酸性特異蛋白質(zhì)。肖華山等[6]利用電泳技術(shù)研究了荔枝雌花芽發(fā)育期蛋白質(zhì)的特異性，發(fā)現(xiàn)荔枝雌花在4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期，蛋白質(zhì)合成總體上逐漸增強(qiáng)，大孢子成熟期蛋白質(zhì)含量最高，且蛋白質(zhì)具有發(fā)育時(shí)期的特異性，認(rèn)為荔枝雌花發(fā)育是一個(gè)由多基因控制且受環(huán)境綜合因素影響的極其復(fù)雜的生理過程。可見，蛋白質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化與多年生木本植物花芽的形成有重要關(guān)系。在以往的報(bào)道中，多數(shù)學(xué)者僅對香榧花芽發(fā)育過程中芽體形態(tài)變化[7]、核酸[8]和內(nèi)源激素[9]的動(dòng)態(tài)變化作了研究，迄今尚未涉及蛋白質(zhì)含量變化與香榧花芽發(fā)育的關(guān)系的研究。該研究以榧樹雄花芽分化過程中的葉片和花芽為材料，進(jìn)行可溶性蛋白質(zhì)含量測定和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，明確榧樹雄花芽發(fā)育過程中蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以期進(jìn)一步分離與花芽分化相關(guān)的特異蛋白，為最終實(shí)現(xiàn)調(diào)控香榧成花研究提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1材料供試材料為采自浙江省諸暨市趙家鎮(zhèn)杜家坑村正常開花的4株成年榧樹雄株，樹齡30年左右。根據(jù)前期的形態(tài)觀察及香榧花芽發(fā)育過程的相關(guān)研究[4]，從2012年6月開始分階段采集樣品，相應(yīng)花芽發(fā)育時(shí)期見表1。野外采樣時(shí)，剪取樹冠中上部各個(gè)方向的花枝，放入冰瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室。在室內(nèi)通過顯微解剖觀察選取具代表性的葉片和花芽，立即貯存于超低溫冰箱（-80℃）中，備用。

1.2方法

1.2.1可溶性蛋白提取、含量測定。樣品可溶性蛋白提取采用TrisHCl提取法，稱取0.5 g左右花枝上的葉片或花芽鮮樣，加入5 mL 預(yù)冷TrisHCl （0.1 mol/L，pH 7.5），冰浴研磨，轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，在10 000 g 4 ℃ 條件下離心15 min，取上清液于5 mL離心管中，繼續(xù)10 000 g 4 ℃條件下離心15 min，取上清液，-20 ℃保存待用?？扇苄缘鞍缀繙y定參照考馬斯亮藍(lán)G250（Bradford）法，測定均重復(fù)3次。

1.2.2可溶性蛋白分離檢測。采用垂直板十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）對樣品可溶性蛋白溶液進(jìn)行分離，選擇改良式銀染對蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行染色，拍照后利用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1雄球花發(fā)育過程中花枝葉片和花芽可溶性蛋白含量的變化由表1可知，在花芽分化過程中，葉內(nèi)可溶性蛋白含量在不同發(fā)育時(shí)期呈現(xiàn)不同的動(dòng)態(tài)變化，出現(xiàn)2次峰值，分別為2011年7月28日的8.41 μg/g和2012年4月20日的9.18 μg/g，2次峰值無顯著差異。2011年6～7月，葉片可溶性蛋白含量持續(xù)上升，在7月28日出現(xiàn)第1個(gè)峰值；到8月22日，急劇下降到最低值（4.15 μg/g），這可能是因?yàn)樵摃r(shí)期雄球花中軸迅速伸長，小孢子葉原基開始分化，分裂旺盛，需要葉片提供大量蛋白；9月份葉片可溶性蛋白含量重新上升，但極顯著低于7月份的峰值；進(jìn)入10月下旬，葉片可溶性蛋白含量又開始下降；到了12月份，葉片可溶性蛋白含量降至整個(gè)花芽發(fā)育過程的次低值（4.78 μg/g），這可能是由于外界低溫影響了葉片可溶性蛋白的合成，同時(shí)該時(shí)期的雄花芽一直處于四分體時(shí)期，芽體活動(dòng)不旺盛，不需要大量蛋白；2012年3～4月天氣轉(zhuǎn)暖后，葉片可溶性蛋白含量開始迅速上升，至4月20日達(dá)另1個(gè)峰值，這可能是因?yàn)橥饨鐨鉁鼗厣~片各種生理代謝重新活躍，可溶性蛋白合成加快，而花粉接近成熟，所需蛋白較少。而花芽內(nèi)的可溶性蛋白含量從2011年10月30日開始一直持續(xù)下降，且均低于同時(shí)期葉片可溶性蛋白含量，這說明雄球花發(fā)育過程所需的蛋白可能主要依賴葉片提供。

2.2雄球花發(fā)育過程中可溶性蛋白SDSPAGE檢測為了分離與香榧雄球花發(fā)育相關(guān)的特異蛋白，該研究通過SDSPAGE電泳對葉片和花芽中的可溶性蛋白進(jìn)行分析。由圖1、2可知，在香榧雄球花發(fā)育過程中，葉片和花芽中蛋白質(zhì)譜帶有明顯差異，某些特定的蛋白質(zhì)譜帶可能與特定的發(fā)育時(shí)期相關(guān)。由圖1可知，在鱗片分化期（II1，II2）葉片中出現(xiàn)了53.4和55.2 ku 2個(gè)特異譜帶，這2個(gè)特異條帶一直維持到花芽發(fā)育的后期，但在小孢子葉分化階段（III和IV）表達(dá)較弱；另1個(gè)在鱗片分化期出現(xiàn)的特異譜帶65.8 ku則一直較穩(wěn)定表達(dá)。而到了花粉母細(xì)胞形成階段（V），葉片中出現(xiàn)了45.4、58.1和73.5 ku 3個(gè)特異條帶，58.1 ku條帶只在花粉母細(xì)胞形成階段（V）出現(xiàn)，在之后階段就消失了，但45.4和73.5 ku條帶則跨越了整個(gè)花芽發(fā)育的后期，且有隨著花粉成熟其含量呈逐漸升高的趨勢。此外，從四分體時(shí)期開始，葉片中還出現(xiàn)了另1個(gè)特異譜帶59.6 ku，該條帶主要在花粉成熟的后期（VII～I(xiàn)X）表達(dá)。相對葉片，在香榧雄球花發(fā)育過程中，花芽中可溶性蛋白的譜帶差異不大，在整個(gè)四分體時(shí)期（VI～VIII）可溶性蛋白的組成成分基本沒有變化，可能是因?yàn)榛ㄑ刻幱诙拘菝郀顟B(tài)，花芽生理活動(dòng)比較少，可溶性蛋白的組分變化不明顯（圖2）。但花芽發(fā)育過程中，也存在特異的譜帶。如在四分體初期出現(xiàn)的57.1和58.5 ku這2個(gè)條帶，在四分體后期單核花粉形成階段逐漸消失。而在整個(gè)四分體時(shí)期一直表達(dá)的27.4 ku條帶到了二核期花粉粒形成時(shí)期突然消失。此外，在二核期花粉粒形成時(shí)期（IX）出現(xiàn)了另外2個(gè)特異譜帶，分別在64.2和37.6 ku。說明這些特異譜帶可能對花粉形成的不同階段有重要的作用。

3結(jié)論與討論

植物的花發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的生理過程，與植物的繁殖和作物產(chǎn)量等直接相關(guān)，需要體內(nèi)核酸、激素和蛋白等不同物質(zhì)的參與[10]。通過可溶性蛋白含量和特異蛋白譜帶檢測，可以了解植物花發(fā)育的生理過程與內(nèi)在因子間的相關(guān)性。已有研究表明植物體內(nèi)可溶性蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化與植物成花間具有一定的相關(guān)性。如郭金麗等[11]對蘋果梨花芽分化期蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了觀察研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生理分化期花芽和成花短枝中蛋白質(zhì)大量積累；形態(tài)分化期花芽各花器原基分化過程中富含蛋白質(zhì)，成花短枝中蛋白質(zhì)含量持續(xù)下降。陳清西等[12]研究發(fā)現(xiàn)，氯酸鉀處理能明顯促進(jìn)龍眼開花，在成花誘導(dǎo)后，成花母枝葉片中蛋白質(zhì)在誘導(dǎo)期迅速增加，之后逐漸下降，而對照植株蛋白質(zhì)含量始終保持在較低水平。該研究發(fā)現(xiàn)，香榧花枝葉片可溶性蛋白含量隨著雄球花發(fā)育進(jìn)程有2個(gè)明顯的表達(dá)高峰，而在雄球花花芽發(fā)育過程中，可溶性蛋白含量卻呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，說明葉片可能為雄球花發(fā)育提供了主要的蛋白。

除了可溶性蛋白含量與植物成花相關(guān)外，特異的蛋白組分可能對植物成花作用更為關(guān)鍵。肖華山等[6]對荔枝雌花發(fā)育過程的蛋白質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，在荔枝雌花的4個(gè)不同發(fā)育期，都有一些新蛋白質(zhì)合成，也有一些蛋白質(zhì)分解消失，認(rèn)為在雌花發(fā)育過程中，蛋白質(zhì)的新陳代謝非?；钴S，并且具有發(fā)育時(shí)期的特異性，可能與組織或細(xì)胞在該時(shí)期的特定生理功能有關(guān)。楊傳平等[13]對白樺雄花序發(fā)育過程中的蛋白雙向電泳后發(fā)現(xiàn)，有275個(gè)蛋白點(diǎn)在表達(dá)上有明顯質(zhì)和量的變化，某些蛋白點(diǎn)為特定發(fā)育時(shí)期的雄花序特有，這些表達(dá)差異的蛋白可能與花分生組織及花器官的形成有關(guān)。該研究對香榧雄球花不同發(fā)育時(shí)期的葉片和花芽可溶性蛋白進(jìn)行SDSPAGE檢測發(fā)現(xiàn)，在不同花芽發(fā)育時(shí)期，葉片、花芽中的大部分蛋白質(zhì)基本保持不變，有部分蛋白質(zhì)在不同時(shí)期出現(xiàn)、即將分解消失或已經(jīng)分解消失，有的蛋白質(zhì)只在某一個(gè)發(fā)育時(shí)期出現(xiàn)。這種現(xiàn)象說明在香榧雄株的成花階段，蛋白質(zhì)新陳代謝旺盛，一些與特定時(shí)期的花器官組織或細(xì)胞有關(guān)的蛋白質(zhì)有明顯的表達(dá)特異性。

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