吳迎奔，陳 薇，賀月林，許麗娟，王 震，汪 彬

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

側(cè)孢芽孢桿菌C5發(fā)酵條件及培養(yǎng)基的優(yōu)化

吳迎奔，陳 薇，賀月林，許麗娟，王 震，汪 彬

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

為了更加有效地利用側(cè)孢芽孢桿菌C5，研究了該菌株的生長特性，并對其發(fā)酵條件及培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，側(cè)孢芽孢桿菌C5的生長規(guī)律為：0～4 h延滯期，4～16 h指數(shù)期，16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期；最佳發(fā)酵條件為：初始pH值7.0、培養(yǎng)溫度30℃、接種量3%～5%、轉(zhuǎn)速180 r/min；最適培養(yǎng)基為：葡萄糖20.0 g/L、酵母膏10.0 g/L、MnSO40.2 g/L、CaCl20.3 g/L、KH2PO40.1 g/L、MgSO40.05 g/L。在上述條件下，側(cè)孢芽孢桿菌C5的發(fā)酵芽孢數(shù)可達(dá)1.08×109CFU/m L。

側(cè)孢芽孢桿菌；發(fā)酵；條件；培養(yǎng)基；優(yōu)化

芽孢桿菌已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)［1-3］、醫(yī)藥衛(wèi)生［4］等領(lǐng)域，其中側(cè)孢芽孢桿菌具有解磷鉀、固氮等生物學(xué)特性［5-8］，能產(chǎn)生具有應(yīng)用潛力的代謝產(chǎn)物，例如殺蟲蛋白、抑菌物質(zhì)等［9］。國內(nèi)外對側(cè)孢芽孢桿菌的研究主要集中于殺蟲［10］、保健類藥物［11］的開發(fā)等方面。由湖南省微生物研究院篩選的側(cè)孢芽孢桿菌C5，被證實(shí)可抑制水體中有害微生物的生長，并能有效分解水中的有機(jī)質(zhì)，凈化水質(zhì)［12］?，F(xiàn)對該菌株的生長特性進(jìn)行研究，并在此基礎(chǔ)上對其產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，為其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試側(cè)孢芽孢桿菌C5由湖南省微生物研究院篩選。供試培養(yǎng)基有：（1）LB培養(yǎng)基，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，牛肉膏3 g，蒸餾水1 L，pH 值7.0；（2）基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，葡萄糖10 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 0.5 g，蒸餾水1 L，pH值7.0～7.2；（3）發(fā)酵培養(yǎng)基，根據(jù)需要具體配制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生長曲線測定 從LB斜面挑取一接種環(huán)的菌苔接種于100 m L基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、180 r/ min恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)期間每隔3 h取液態(tài)樣品測定菌體生長吸光度（OD600）。

1.2.2 芽孢桿菌菌種制備 將斜面菌種接種1環(huán)至液體種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期。以1%接種量轉(zhuǎn)接到裝有100 m L發(fā)酵液的500 mL三角瓶中，37℃、180 r/m in培養(yǎng)10 h。

1.2.3 細(xì)菌數(shù)、芽孢數(shù)的測定 細(xì)菌濃度采用細(xì)菌計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法測定；發(fā)酵液產(chǎn)芽孢率（芽孢數(shù)）采用結(jié)晶紫染色法測定［12］。

1.2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化 （1）初始pH值的選擇。調(diào)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，按1%的接種量接種，37℃，180 r/m in發(fā)酵培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液的芽孢數(shù)，確定最佳初始pH值。（2）溫度的選擇。按1%接種量將種齡18～22 h的種子液轉(zhuǎn)接到最佳初始pH值的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，分別置于25、30、35、40和45℃搖床上發(fā)酵培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為180 r/ min，發(fā)酵培養(yǎng)24 h后測定發(fā)酵液的芽孢數(shù)，確實(shí)最適培養(yǎng)溫度。（3）接種量的選擇。在最佳初始pH值條件下，分別接種1%、3%、5%、7%、10%的種子液于最佳溫度培養(yǎng)下以180 r/m in的轉(zhuǎn)速發(fā)酵培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液的芽孢數(shù)，確實(shí)最佳接種量。（4）轉(zhuǎn)速的選擇。在最佳初始pH值和最佳接種量的基礎(chǔ)上，分別以120、150、180、210 r/min的轉(zhuǎn)速于最佳溫度培養(yǎng)下發(fā)酵培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液的芽孢數(shù)，確定最佳轉(zhuǎn)速。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 （1）碳源。分別用10 g/L葡萄糖、淀粉、蔗糖和玉米淀粉作為碳源，其他組分不變，在最佳發(fā)酵條件下培養(yǎng)24 h后測定發(fā)酵液中芽孢桿菌活菌數(shù)和芽孢形成率［5-6］，確定最佳碳源。（2）氮源。分別以10 g/L尿素、牛肉膏、工業(yè)蛋白胨、酵母膏4種氮源作為唯一氮源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在最佳發(fā)酵條件下培養(yǎng)24 h后測定發(fā)酵液中芽孢桿菌活菌數(shù)和芽孢形成率，確定最佳氮源。

1.2.6 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以發(fā)酵液中芽孢桿菌芽孢數(shù)為考察指標(biāo)，以玉米淀粉為碳源，酵母膏為氮源，CaCl2和MnSO4為無機(jī)鹽因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)（表1），應(yīng)用L9（34）正交表對各組分用量進(jìn)行優(yōu)化。

表1 芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) （g/L）

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線

由圖1可知，側(cè)孢芽孢桿菌C5的生長規(guī)律為：0～4 h延滯期，4～16 h指數(shù)期，16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，由于后期形成大量芽孢，OD值變化不明顯。

圖1 側(cè)孢芽孢桿菌C5生長曲線

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 初始pH值 從圖2可知，當(dāng)初始pH值為7.0時(shí)，發(fā)酵24 h后側(cè)孢芽孢桿菌C5的菌體數(shù)和芽孢數(shù)均達(dá)到最多，分別為8.6×108和6.6×108CFU/mL，初始pH值太高或太低均不利于菌體生長和芽孢形成。

圖2 不同pH值對側(cè)孢芽孢桿菌C5生長的影響

2.2.2 培養(yǎng)溫度 由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，側(cè)孢芽孢桿菌C5的菌體數(shù)和芽孢數(shù)達(dá)到最高，分別為9.3×108和7.3×108CFU/m L。

圖3 不同溫度對側(cè)孢芽孢桿菌C5生長的影響

2.2.3 接種量 從圖4可知，在一定范圍內(nèi)，側(cè)孢芽孢桿菌C5發(fā)酵液中的菌體數(shù)和芽孢數(shù)隨接種量的增加而增加，但當(dāng)接種量＞5%時(shí)，菌數(shù)和芽孢數(shù)呈下降趨勢。因?yàn)?%接種量和5%接種量菌數(shù)及芽孢數(shù)差別不大，從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，在后續(xù)試驗(yàn)中選擇3%的接種量。

圖4 不同接種量對側(cè)孢芽孢桿菌C5生長的影響

2.2.4 轉(zhuǎn) 速 如圖5所示，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，側(cè)孢芽孢桿菌C5的菌體數(shù)和芽孢數(shù)均最多。故將側(cè)孢芽孢桿菌C5的搖床轉(zhuǎn)速確定為180 r/min。

圖5 不同轉(zhuǎn)速對側(cè)孢芽孢桿菌C5生長的影響

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.1 碳 源 從圖6中可以看出，不同碳源對側(cè)孢芽孢桿菌C5發(fā)酵的菌體數(shù)和芽孢數(shù)有不同的影響，其中葡萄糖作為碳源的效果最好，發(fā)酵結(jié)束后菌體書和芽孢數(shù)分別為1.23×109和9.7×109CFU/mL，因此選擇葡萄糖為側(cè)孢芽孢桿菌C5培養(yǎng)基的碳源。

圖6 不同碳源對側(cè)孢芽孢桿菌C5生長的影響

2.3.2 氮 源 由圖7可知，側(cè)孢芽孢桿菌C5在含有酵母膏的培養(yǎng)基中活菌數(shù)、芽孢數(shù)最高，分別達(dá)1.39×109和1.03×108CFU/m L，因此選擇酵母膏作為側(cè)孢芽孢桿菌C5培養(yǎng)基的碳源。

圖7 不同氮源對側(cè)孢芽孢桿菌C5生長的影響

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，影響側(cè)孢芽孢桿菌C5發(fā)酵水平主次因素關(guān)系為：葡萄糖＞酵母膏＞MgSO4＞CaCl2，因素間最佳水平組合為A3B2C3D3。結(jié)合無機(jī)鹽的篩選，添加其他3種可以提高發(fā)酵水平的無機(jī)鹽，側(cè)孢芽孢桿菌C5的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖20.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，MnSO40.2 g/L，CaCl20.3 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO40.05 g/L。在此條件下，側(cè)孢芽孢桿菌C5的發(fā)酵芽孢數(shù)可達(dá)1.08×109CFU/m L。從表3的方差分析結(jié)果可知：F葡萄糖=58.597＞F0.05（2，2）=19.00，說明葡萄糖的作用達(dá)到顯著水平。因此，在發(fā)酵過程中要嚴(yán)格控制葡萄糖的用量，其他因素的作用未達(dá)顯著水平。

表2 側(cè)孢芽孢桿菌C5培養(yǎng)基濃度的正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 側(cè)孢芽孢桿菌C5正交試驗(yàn)方差分析

3 結(jié) 論

選取物料投入產(chǎn)出比高，適宜工業(yè)化發(fā)酵，來源容易、價(jià)格低廉、菌體數(shù)和芽孢數(shù)高的葡萄糖作為培養(yǎng)基中的碳源成分，酵母膏作為培養(yǎng)基中的氮源成分。試驗(yàn)結(jié)果表明，側(cè)孢芽孢桿菌C5的生長規(guī)律為：0～4 h延滯期，4～16 h指數(shù)期，16～32 h穩(wěn)定期，32 h以后衰亡期；最佳發(fā)酵條件為：初始pH值 7.0，培養(yǎng)溫度30℃，接種量3%～5%，轉(zhuǎn)速180 r/min；最適培養(yǎng)基為：葡萄糖20.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，MnSO40.2 g/L，CaCl20.3 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO40.05 g/L。在上述條件下，側(cè)孢芽孢桿菌C5的發(fā)酵芽孢數(shù)可達(dá)1.08×109CFU/m L。

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（責(zé)任編輯：成 平）

Optim izing Fermentation Condition for Bacillus laterosporus C5

WU Ying-ben，CHEN Wei，HE Yue-lin，XU li-juan，WANG Zhen，WANG Bin
（Hunan Institute of Microbiology， Changsha 410009， PRC）

In order to use Bacillus laterosporus C5 efficiently in production， the Growth characteristics were studied， and the liquid fermentation medium and fermentation conditions were optim ized. The results show ed that the optimal fermentation conditions were initial pH 7.0， temperature 30 ℃， inoculation rate 3%-5%， and rotate speed 180 r/min； the optimum medium was glucose 20.0 g/L， yeast extract 10.0 g/L， MnSO40.2 g/L， CaCl20.3 g/L， KH2PO40.1 g/L， MgSO40.05 g/L. Under the conditions， the spore yield with optimum medium formula was up to 1.08×109CFU/m L。

Bacillus laterosporus； fermentation conditions； condition； culture medium； orthogonal optimization

Q939.96

A

1006-060X（2016）09-0004-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.09.002

2016-07-14

湖南省科技計(jì)劃（2015CK3008）；湖南省生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)規(guī)模養(yǎng)殖與環(huán)境控制崗位項(xiàng)目

吳迎奔（1981-），男，湖南新化縣人，助理研究員，主要從事農(nóng)業(yè)微生物等相關(guān)研究。

汪 彬