高志強(qiáng)　陳廣卿　王國慶　王景忠　丁　偉　李　君　宮　堅　張玉柱　樓險峰　王忠文　朱　榮

(浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江　紹興　312000)

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大鼠運(yùn)動性骨骼肌損傷后血清肌酸激酶、乳酸脫氫酶以及波形蛋白的變化

高志強(qiáng)陳廣卿王國慶王景忠丁偉1李君1宮堅2張玉柱2樓險峰2王忠文3朱榮4

(浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江紹興312000)

目的探討大鼠離心運(yùn)動致骨骼肌損傷后血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)以及波形蛋白(Vimentin)的變化。方法SPF級健康雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為對照組和實驗組各20只。實驗組根據(jù)運(yùn)動后時間不同分為運(yùn)動后即刻(實驗組A)、運(yùn)動后12 h(實驗組B)、運(yùn)動后24 h(實驗組C)、運(yùn)動后48 h(實驗組D)，每組5只。觀察大鼠離心運(yùn)動情況，各組大鼠血清CK和LDH水平變化，各組大鼠骨骼肌Vimentin蛋白表達(dá)情況。結(jié)果與對照組相比，實驗組A、實驗組B、實驗組C大鼠血清CK、LDH水平明顯上升，且呈依次增加趨勢(P<0.05)，而實驗組D無明顯變化(P>0.05)；與實驗組A、實驗組B、實驗組C比較，實驗組D大鼠血清CK、LDH水平明顯下降(P<0.05)；與對照組比較，實驗組A、實驗組B、實驗組C大鼠骨骼肌Vimentin表達(dá)陽性強(qiáng)度吸光度值明顯增加(P<0.05)，且呈依次下降趨勢，而實驗組D無明顯變化(P>0.05)；與實驗組A、實驗組B、實驗組C比較，實驗組D大鼠骨骼肌Vimentin表達(dá)陽性強(qiáng)度吸光度值明顯降低(P<0.05)。結(jié)論大鼠離心運(yùn)動能夠引起延遲性骨骼肌損傷，CK、LDH、Vimentin可更好反映骨骼肌損傷的程度。

離心運(yùn)動；骨骼肌損傷；肌酸激酶；乳酸脫氫酶；波形蛋白

運(yùn)動性骨骼肌損傷以延遲性肌肉酸痛為最常見特征〔1〕，目前，其發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，且對其原因研究較多，包括骨骼肌鈣超載學(xué)說、機(jī)械損傷學(xué)說、細(xì)胞骨架學(xué)說以及肌細(xì)胞能量代謝說等〔2～4〕。本研究旨在分析大鼠離心運(yùn)動后骨骼肌損傷后血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)以及波形蛋白(Vimentin)的變化。

1　材料與方法

1.1實驗動物SPF級健康雄性SD大鼠40只，8周齡，體重(200±20)g，自由飲食、飲水，維持室溫23℃～25℃，相對濕度70%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。大鼠購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號SYXK(瀘)2010-0095。

1.2主要試劑和儀器主要試劑：血清CK、LDH試劑盒購于上海銘博生物科技有限公司；Vimentin購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。主要儀器：日本日立7600型全自動生化分析儀。

1.3實驗分組40只SD大鼠隨機(jī)分為對照組和實驗組各20只。其中實驗組根據(jù)運(yùn)動后時間不同分為運(yùn)動后即刻(實驗組A)、運(yùn)動后12 h(實驗組B)、運(yùn)動后24 h(實驗組C)、運(yùn)動后48 h(實驗組D)，每組5只。

1.4觀察指標(biāo)(1)觀察大鼠離心運(yùn)動情況；(2)觀察各組大鼠血清CK和LDH水平變化，麻醉大鼠，于大鼠腹主動脈取血，離心，分離血清，保存于-20℃下保存待測；(3)觀察各組大鼠骨骼肌Vimentin蛋白表達(dá)，采用免疫組化法測定，每張切片鏡下(×400)隨機(jī)抽取5個視野，采用陽性表達(dá)面積和觀密度值表示陽性物質(zhì)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠離心運(yùn)動情況及大鼠骨骼肌組織形態(tài)學(xué)變化對照組和實驗組A大鼠均表現(xiàn)為兩眼有神、神態(tài)安靜；實驗組B大鼠反應(yīng)略微有些遲鈍；實驗組C大鼠反應(yīng)較為遲鈍、存在明顯逃避反應(yīng)；實驗組D大鼠反應(yīng)明顯遲鈍且逃避反應(yīng)極差。

對照組大鼠骨骼肌在光鏡下條理清晰，且肌纖維排列整齊；實驗組A大鼠骨骼肌在光鏡下肌纖維出現(xiàn)扭曲、皺縮、變性；實驗組B大鼠骨骼肌在光鏡下肌纖維明顯扭曲、皺縮、變性；實驗組C大鼠骨骼肌在光鏡下肌纖維扭曲、皺縮、變性較實驗組B更為嚴(yán)重；實驗組D大鼠骨骼肌在光鏡下部分肌纖維橫紋消失，肌纖維粗細(xì)不均。見圖1。

2.2各組大鼠血清CK、LDH水平比較與對照組相比，實驗組A、實驗組B、實驗組C大鼠血清CK、LDH水平明顯上升(P<0.05)，而實驗組D無明顯變化(P>0.05)；與實驗組A比較，實驗組B、實驗組C大鼠血清CK、LDH水平明顯上升(P<0.05)，而實驗組D明顯降低(P<0.05)；與實驗組B比較，實驗組C明顯上升(P<0.05)，而實驗組D明顯降低(P<0.05)；與實驗組C比較，實驗組D明顯下降(P<0.05)。見表1。

圖1　大鼠骨骼肌組織形態(tài)學(xué)變化(×200)

組別nCKLDH對照組20125.49±30.825389.82±179.32實驗組A5239.84±43.211)7149.37±234.191)實驗組B5316.50±56.791)2)8425.56±289.031)2)實驗組C5548.93±83.211)2)3)9614.28±315.291)2)3)實驗組D5119.89±34.252)3)4)5413.49±214.352)3)4)

與對照組比較：1)P<0.05；與實驗組A比較：2)P<0.05；與實驗組B比較：3)P<0.05；與實驗組C比較：4)P<0.05

2.3各組大鼠骨骼肌Vimentin表達(dá)情況與對照組〔(0.16±0.04)×10-2〕比較，實驗組A〔(0.43±0.12)×10-2〕、實驗組B〔(0.31±0.09)×10-2〕、實驗組C〔(0.24±0.06)×10-2〕大鼠骨骼肌Vimentin表達(dá)陽性強(qiáng)度吸光度值明顯增加(P<0.05)，而實驗組D〔(0.17±0.05)×10-2〕無明顯變化(P>0.05)；與實驗組A比較，實驗組B、實驗組C、實驗組D明顯降低(P<0.05)；與實驗組B比較，實驗組C、實驗組D明顯降低(P<0.05)；與實驗組C比較，實驗組D明顯下降(P<0.05)。

3　討　論

在運(yùn)動實踐中，因肌肉活檢的限制，通常以骨骼肌損傷間接指標(biāo)反映肌細(xì)胞損傷程度，如CK、LDH及與炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白等〔5〕。其中CK是血漿非功能性酶的一種，正常時血清中CK主要來自骨骼肌。運(yùn)動后，因運(yùn)動造成人體內(nèi)環(huán)境的急劇變化，特別是運(yùn)動致使的骨骼肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的變化，血清中CK會增加〔6〕。故而將CK作為骨骼肌損傷的一個間接指標(biāo)。本研究表明，運(yùn)動后CK酶活性明顯增加。LDH普遍存在于全身各組織細(xì)胞，特別為肌肉細(xì)胞。LDH是機(jī)體糖無氧代謝途徑的一種重要酶，對機(jī)體缺氧狀態(tài)下運(yùn)動時能量的供應(yīng)、生成及乳腺代謝具有重要意義〔7〕。當(dāng)組織續(xù)保更新或者被破壞時，LDH從細(xì)胞內(nèi)溢出組織間液再進(jìn)入血液，從而導(dǎo)致血清酶活性增加〔8〕。有研究顯示，大強(qiáng)度運(yùn)動后血漿LDH活性會明顯增加〔9〕。本研究表明，運(yùn)動后LDH酶活性明顯增加。導(dǎo)致血清CK和LDH活性增加的原因，筆者認(rèn)為可能主要是由于血清酶來源的各組織的酶活性增加；劇烈運(yùn)動導(dǎo)致心肌、骨骼肌等組織的細(xì)胞膜頭痛性上升，從而致使漏出的酶含量上升，進(jìn)一步使血清酶活性增加。

細(xì)胞骨架是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)絲組織的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，分為中等纖維、微管纖維、微絲纖維〔10〕。細(xì)胞骨架作用不僅在不維持細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)態(tài)，同時還參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞的重要生命活動。Vimentin屬中等纖維的主要成分之一，并且該蛋白在細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性和細(xì)胞的完整性中發(fā)揮重要作用〔11〕。有報道顯示，Vimentin在肌肉再生的早期肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活中具有重要作用〔12〕?？傊?，大鼠離心運(yùn)動能夠引起延遲性骨骼肌損傷，CK、LDH、Vimentin可更好反映骨骼肌損傷的程度。

1華冰,董柔,蘇全生.大強(qiáng)度離心運(yùn)動大鼠不同時相骨骼肌結(jié)構(gòu)及血白細(xì)胞介素6、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶的變化〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù),2009;13(28):5534-8.

2付德榮,劉承宜,廖八根,等.煙酸補(bǔ)充對單次非力竭離心運(yùn)動大鼠骨骼肌SIRT1、p65及20S蛋白水解酶的影響〔J〕.體育科學(xué),2011;31(8):32-45.

3馬玉德,楊雅麗,盧翠蓮,等.紅芪總黃酮對離心運(yùn)動大鼠骨骼肌的抗氧化作用〔J〕.中醫(yī)藥學(xué)報,2015;43(3):56-8.

4白巍,張海平.離心運(yùn)動對大鼠骨骼肌線粒體ATP酶活性及desmin表達(dá)影響的研究〔J〕.沈陽體育學(xué)院學(xué)報,2013;32(2):86-8.

5黃巧婷,李俊平.一次力竭離心運(yùn)動后大鼠骨骼肌αB-晶體蛋白的變化及針刺對其影響〔J〕.山東體育學(xué)院學(xué)報,2014;30(4):63-7.

6張海平,高巖.離心運(yùn)動致大鼠骨骼肌微損傷形態(tài)學(xué)及血清CK活性變化的研究〔J〕.沈陽體育學(xué)院學(xué)報,2009;28(3):62-6.

7周越,李揚(yáng),王瑞元,等.運(yùn)動性骨骼肌損傷評價指標(biāo)——血清CK、LDH、Mb的比較〔J〕.中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志,2008;27(2):206-8.

8魏海成,孫小雪,邴國強(qiáng),等.不同負(fù)荷離心運(yùn)動對大鼠骨骼肌組織結(jié)構(gòu)和血清中酶活性的影響及其意義〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2012;38(4):172-5.

9陶霞,張宇.不同持續(xù)時間離心運(yùn)動對大鼠骨骼肌LDH和SDH的影響〔J〕.科技視界,2013;(35):113-4.

10李世成,焦海舟,王啟榮,等.補(bǔ)充大豆蛋白對大鼠離心運(yùn)動后骨骼肌細(xì)胞骨架Desmin和Vimentin的影響〔J〕.西安體育學(xué)院學(xué)報,2006;23(5):68-71.

11張海平,吳翊馨,宋吉銳.一次力竭性離心運(yùn)動對大鼠骨骼肌波形蛋白表達(dá)的影響〔J〕.沈陽體育學(xué)院學(xué)報,2014;33(3):88-91.

12吳翊馨,張海平,高巖,等.維生素E對離心運(yùn)動后大鼠骨骼肌波形蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2014；34(9):24-5.

〔2015-12-20修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

浙江省自然科學(xué)基金課題(No.LY12C11002);溫州醫(yī)學(xué)院科研啟動基金課題(No.QTJ09018)

高志強(qiáng)(1985-)，男，講師，主要從事運(yùn)動醫(yī)學(xué)研究。

R68

A

1005-9202(2016)15-3634-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.010

1浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科

3松原市中心醫(yī)院病理科4溫州醫(yī)學(xué)院運(yùn)動醫(yī)學(xué)學(xué)院