荊子桓 王先裕龍安四 孫嵐明 陳寶玲

（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530001）

廣西番茄砧木多抗材料篩選

荊子桓 王先裕*龍安四 孫嵐明 陳寶玲

（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530001）

廣西地區(qū)番茄生產(chǎn)除青枯病、枯萎病和根結(jié)線蟲為害嚴(yán)重外，近兩年大面積暴發(fā)番茄細(xì)菌性髓部壞死病。本試驗(yàn)采用田間抗性鑒定方法和分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)20份番茄砧木材料進(jìn)行對(duì)比、鑒定，篩選抗番茄細(xì)菌性髓部壞死病的多抗砧木材料。結(jié)果表明，砧木材料T034和T103不但對(duì)青枯病、根結(jié)線蟲、枯萎病具有良好抗性，而且對(duì)番茄細(xì)菌性髓部壞死病表現(xiàn)出優(yōu)良的抗性，屬于聚合多抗材料。

廣西；番茄砧木；番茄細(xì)菌性髓部壞死?。豢剐澡b定；聚合多抗材料

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是病害發(fā)生種類較多的蔬菜之一。隨著番茄栽培面積的不斷擴(kuò)大，番茄基地化、專業(yè)化生產(chǎn)成為發(fā)展趨勢，連作重茬現(xiàn)象難以避免（孫麗麗 等，2014），由此導(dǎo)致番茄病害尤其是青枯病等土傳病害迅速蔓延，且為害程度日趨嚴(yán)重。隨著嫁接技術(shù)在防治番茄土傳病害中的應(yīng)用，僅抗青枯病的砧木材料已不能滿足生產(chǎn)需要，對(duì)多抗砧木種質(zhì)的篩選與利用受到行業(yè)研究的重視（莫豪葵 等，2013）。

近年來，除青枯病外，細(xì)菌性髓部壞死病在廣西多個(gè)番茄產(chǎn)區(qū)暴發(fā)，主要為害莖和分枝。發(fā)病莖表面產(chǎn)生褐色至黑褐色長條形病斑，莖內(nèi)髓部變?yōu)辄S褐色或黑褐色，莖表面有時(shí)產(chǎn)生許多不定根，濕度大時(shí)可見傷口處有褐色菌膿溢出；發(fā)病葉片多呈萎蔫狀，嚴(yán)重威脅著番茄的品質(zhì)與產(chǎn)量（李金堂等，2011）。1998年3月番茄細(xì)菌性髓部壞死病在寧波發(fā)生（趙海棠 等，2000），如今在廣西永福、資源等番茄露地栽培產(chǎn)區(qū)大面積發(fā)生，部分田塊發(fā)病率高達(dá)50%～60%。本試驗(yàn)對(duì)20份廣西地方番茄砧木材料進(jìn)行對(duì)比、鑒定，篩選以抗番茄細(xì)菌性髓部壞死病和青枯病為主、兼抗其他土傳病害的多抗材料，為選育適用于廣西番茄生產(chǎn)的砧木材料提供理論參考。

1　材料與方法

大田試驗(yàn)于2015年3～7月在廣西壯族自治區(qū)資源縣連作多年的番茄地塊進(jìn)行。分子標(biāo)記試驗(yàn)于2015年8月在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝植物分子生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院蔬菜系番茄育種課題組從廣西各地收集且純化多代的20份番茄砧木，其特征特性及來源見表1。

1.2試驗(yàn)方法

20份番茄砧木材料均于2015年3月20日播種，采用72孔育苗穴盤，育苗基質(zhì)按草炭∶蛭石∶珍珠巖為2∶1∶1（質(zhì)量比）的比例混合。播種前基質(zhì)和穴盤都要嚴(yán)格消毒，育苗基質(zhì)用50%多菌靈可濕性粉劑3 000倍液消毒；穴盤用高錳酸鉀3 000倍液浸泡3～5 min消毒。每穴1粒，每份砧木材料播種500粒。將苗盤置于育苗室進(jìn)行育苗，育苗期溫度保持在25～30 ℃。4月13日定植，采用隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，小區(qū)面積30 m2，雙行種植，株距0.35 m，行距0.50 m，雙干整枝。

1.3項(xiàng)目測定

2015年7月，每小區(qū)用鐵鏟挖出3株完整的砧木植株，沖洗掉根部土壤，測定根系長和根系展幅；然后用電子臺(tái)秤對(duì)其地上部和地下部分別稱重，計(jì)算根冠比。同時(shí)，摘取植株嫩葉，采用改良的CTAB法（李榮華 等，2009）提取基因組DNA，利用核酸蛋白分析儀檢測DNA濃度，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度；然后用TE稀釋至40 ng·μL-1，-20 ℃保存。采用分子標(biāo)記檢測枯萎病和根結(jié)線蟲的引物分別參考東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄課題組（徐薪惟，2012）和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄課題組（孫亞林，2008）設(shè)計(jì)開發(fā)的引物（表2）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：10×PCR Buffer 2.0 μL，dNTP（10 mmol·μL-1）0.4 μL，正反向引物（100 μmol·L-1）各0.4 μL，DNA模板（300～500 ng·μL-1）1.0 μL，Taq酶（5 U·μL-1）0.2 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃復(fù)性80 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用加有EB（溴化乙錠）的1%瓊脂糖在100～110 V電壓下電泳30 min，最終結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上顯示。

表1　供試番茄砧木材料及來源

表2　番茄I-2和Mi-1基因的引物序列

1.4抗性鑒定

2015年7月，采用五點(diǎn)取樣法調(diào)查20份番茄砧木材料大田枯萎病、南方根結(jié)線蟲、青枯病和細(xì)菌性髓部壞死病的發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)或發(fā)病率。

1.4.1番茄枯萎病 采用陳仁立和鄭貴彬（1997）的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無癥狀；1級(jí)，1～2片葉明顯變黃、脫落；2級(jí)，1～2片真葉變黃或全株黃綠色，葉下垂，輕微萎蔫；3級(jí)，全株明顯萎蔫或葉片嚴(yán)重變黃，生長受抑制并矮化；4級(jí)，全株嚴(yán)重萎蔫、枯死。

1.4.2南方根結(jié)線蟲 參照毛愛軍等（2005）制定的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，植株根部無根瘤；1級(jí)，植株根部形成1～2個(gè)根瘤；2級(jí)，植株根部形成3～10個(gè)根瘤；3級(jí)，植株根部形成11～30個(gè)根瘤；4級(jí)，植株根部形成31～100個(gè)根瘤；5級(jí)，植株根部根瘤數(shù)超過100個(gè)。

1.4.3番茄青枯病 參照白占兵等（2014）的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無病癥；1級(jí)，植株頂端個(gè)別枝葉萎蔫；2級(jí)，全株1/3的枝葉自上而下萎蔫，早晚有恢復(fù)能力；3級(jí)，全株1/2的枝葉萎蔫，無恢復(fù)能力；4級(jí)，全株枝葉萎蔫、枯死。

1.4.4番茄細(xì)菌性髓部壞死病 該病害經(jīng)常在第1穗果坐果完成至綠熟期發(fā)生，田間隨機(jī)發(fā)生，低夜溫、高氮及高濕條件下容易暴發(fā)（趙小麗 等，2013）。參照J(rèn)intang（2012）的方法對(duì)感染細(xì)菌性髓部壞死病的砧木材料進(jìn)行鑒定，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。

2　結(jié)果與分析

2.1番茄砧木材料生長情況

從表3可以看出，20份番茄砧木材料中，T033的根長最長，為51.1 cm；T077的根系展幅最寬，為31.2 cm，顯著高于其他19份材料；T035的地上部鮮質(zhì)量最高，為957.0 g，與其他19份材料差異達(dá)顯著水平；T077的地下部鮮質(zhì)量最高，為82.4 g，與其他19份材料差異亦達(dá)顯著水平；T077和T133的根冠比最大，為0.09。

表3　番茄砧木材料的生長情況

2.2番茄砧木材料分子標(biāo)記抗性鑒定結(jié)果

如圖1所示，T032、T033、T034、T035、T121和T132可以擴(kuò)增出大小為1 188 bp的條帶，說明這6份番茄砧木材料具有抗枯萎病基因I-2。

如 圖2所 示，T033、T076、T084、T103和T110可以擴(kuò)增出大小為556 bp的條帶，說明這5份番茄砧木材料具有抗根結(jié)線蟲基因Mi-1。

2.3番茄砧木材料田間抗性鑒定結(jié)果

從表4可以看出，20份番茄砧木材料對(duì)枯萎病、南方根結(jié)線蟲、青枯病的田間抗性都達(dá)到了高抗或免疫水平；其中，T034、T108、T120、T121、T135等5份材料枯萎病病情指數(shù)為0，T034、T053、T077、T110、T120、T127、T130、T132等8份材料南方根結(jié)線蟲病情指數(shù)為0，T034、T089、T133等3份材料青枯病病情指數(shù)為0；T034和T103對(duì)番茄細(xì)菌性髓部壞死病具有良好抗性，平均發(fā)病率為10%，明顯低于其他18份材料。

圖1　番茄砧木材料抗枯萎病基因I-2的PCR檢測結(jié)果

圖2　番茄砧木材料抗根結(jié)線蟲基因Mi-1的PCR檢測結(jié)果

表4　番茄砧木材料田間抗性鑒定結(jié)果

2.4番茄砧木材料對(duì)4種土傳病害的聚合抗性

如圖3所示，參試20份番茄砧木材料對(duì)枯萎病、南方根結(jié)線蟲和青枯病均有良好抗性，但絕大部分砧木材料對(duì)番茄細(xì)菌性髓部壞死病表現(xiàn)出感病，T053、T084、T089和T120平均發(fā)病率高達(dá)80%。20份砧木材料中，T034和T103高抗或免疫枯萎病、南方根結(jié)線蟲和青枯病，對(duì)番茄細(xì)菌性髓部壞死病有較好抗性。

圖3　番茄砧木材料對(duì)4種土傳病害的聚合抗性

3　結(jié)論與討論

砧木選擇作為嫁接的基礎(chǔ)工作，是決定嫁接能否成功與效果好壞的關(guān)鍵（孫麗麗 等，2014）。本試驗(yàn)中，番茄砧木材料T035的地上部鮮質(zhì)量最高；T077的地下部鮮質(zhì)量最高，根系展幅最寬，根冠比最高；T033根系長度最長。說明T077可適用于雨水多、壟距寬的番茄嫁接栽培產(chǎn)區(qū)，T033可適用于雨水少、較干旱的番茄嫁接栽培產(chǎn)區(qū)。

番茄砧木具有抗旱、耐澇、抗土傳病害等特點(diǎn)（董道峰 等，2007），選育和利用多抗砧木材料是實(shí)現(xiàn)病害防治經(jīng)濟(jì)有效的措施之一。本試驗(yàn)采用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)抗枯萎病和根結(jié)線蟲的抗性基因進(jìn)行檢測，結(jié)果表明T033兼具抗2種土傳病害的抗性基因；T032、T034、T035、T121和T132具有抗枯萎病的抗性基因，T076、T084、T103和T110具有抗根結(jié)線蟲的抗性基因。

田間抗病性鑒定結(jié)果 表明，參試的20份番茄砧木材料對(duì)枯萎病、南方根結(jié)線蟲、青枯病的抗性都達(dá)到了高抗或免疫水平，其中T034、T108、T120、T121和T135的枯萎病病情指數(shù)為0；T034、T053、T077、T110、T120、T127、T130和T132的南方根結(jié)線蟲病情指數(shù)為0；T034、T089和T133的青枯病病情指數(shù)為0；對(duì)嚴(yán)重威脅廣西露地番茄生產(chǎn)的細(xì)菌性髓部壞死病，T034和T103兩份砧木材料具有良好的抗性。

綜上所述，砧木材料T077具有根系質(zhì)量高、水平展幅寬、根冠比高、對(duì)南方根結(jié)線蟲田間表現(xiàn)免疫等優(yōu)點(diǎn)；T034和T103不但對(duì)青枯病、南方根結(jié)線蟲、枯萎病抗性較強(qiáng)，而且對(duì)細(xì)菌性髓部壞死病表現(xiàn)出良好的抗性，屬于聚合多抗材料，適合在廣西地區(qū)推廣利用。

白占兵，張戰(zhàn)泓，周曉波，倪向江，羅香文，劉勁.2014.南方番茄青枯病抗性評(píng)價(jià).中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，30（7）：77-81.

陳仁立，鄭貴彬.1997.番茄品種和材料對(duì)枯萎病的室內(nèi)抗病性鑒定.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，（1）：25-26.

董道峰，曹志平，王秀徽，胡菊，Gullino M L.2007.抗根結(jié)線蟲砧木對(duì)番茄生長及產(chǎn)量的影響.園藝學(xué)報(bào)，34（5）：1305-1308.

李金堂，默書霞，田磊，王培明，李代玲，傅海濱.2011.番茄細(xì)菌性髓部壞死病的識(shí)別及防治.長江蔬菜，（3）：34-35，68.

李榮華，夏巖石，劉順枝，孫莉麗，郭培國，繆紳裕，陳健輝. 2009.改進(jìn)的CTAB提取植物DNA方法.實(shí)驗(yàn)室研究與探索，（9）：14-16.

毛愛軍，柴敏，于拴倉，姜立綱，沈國印.2005.番茄抗根結(jié)線蟲接種鑒定技術(shù)及其應(yīng)用.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，14（4）：140-144.

莫豪葵，秦東，李業(yè)勇，李玉洪，劉春長，王先裕.2013.番茄砧木材料的篩選與青枯病抗性鑒定.長江蔬菜，（24）：54-58.

孫麗麗，徐揚(yáng)，郭世榮，李鶴，束勝，高攀，孫錦.2014.不同砧木嫁接對(duì)番茄成活率、生長及果實(shí)品質(zhì)的影響.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，37（5）：55-62.

孫亞林.2008.番茄4個(gè)抗病基因的基因標(biāo)記的創(chuàng)建與輔助選擇〔碩士論文〕.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué).

徐薪惟.2012.番茄抗枯萎病I-2基因的SNP分子標(biāo)記及種質(zhì)資源的篩選〔碩士論文〕.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué).

趙海棠，安學(xué)君，胡芝蓮.2000.番茄細(xì)菌性髓部壞死病及防治方法.長江蔬菜，（8）：17-18.

趙小麗，程曉博，郭衛(wèi)龍.2013.番茄細(xì)菌性髓部壞死病的防治研究.吉林蔬菜，（7）：28.

Jintang L I.2012.Research on tomato bacterial pith necrosis.Plant Diseases and Pests，2：9-11.

Screening of Tomato Rootstocks with Multi-resistance in Guangxi

JING Zi-huan，WANG Xian-yu*，Long An-si，SUN Lan-ming，CHEN Bao-ling
（Agronomy College of Guangxi University，Nanning 530001，Guangxi，China）

Recently，a mass outbreak of tomato bacterial pith necrosis occurred in Guangxi，except bacterial wilt，F(xiàn)usarium wilt and root-knot nematode.This experiment compared and identified 20 pieces of tomato rootstock material from Guangxi，and screened rootstock material with multi-resistance to tomato bacterial pith necrosis.The results indicated that rootstocks T034 and T103 were not only resistant to bacterial wilt，F(xiàn)usarium wilt and root-knot nematode，but also to bacterial pith necrosis，belonging to multi-resistance polymerization material.

Guangxi；Tomato rootstock；Tomato bacterial pith necrosis；Resistance identification；Multi-resistance polymerization

荊子桓，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)，E-mail：243875731@qq.com

（

）：王先裕，研究員，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：wang12261962@163.com

2015-12-01；接受日期：2016-06-29

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科攻1598006-2B，桂科攻14121006-5-2，桂科合14123001-3，桂科攻13254002-2），國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系桂林綜合試驗(yàn)站項(xiàng)目（CARS-25-G-37），百色國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)建設(shè)示范項(xiàng)目（桂科能1598022-1-1）