譚鳳彪，高家林，陸曉華，章　堯

(1.皖南醫(yī)學(xué)院　生物化學(xué)教研室,安徽　蕪湖　241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院　活性生物大分子研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽　蕪湖　241002；3.皖南醫(yī)學(xué)院　機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,安徽　蕪湖　241002；4.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院　內(nèi)分泌科,安徽　蕪湖　241001)

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

利用合成多肽制備兔多克隆抗體

譚鳳彪1，2，高家林2,4，陸曉華3，章堯1,2

(1.皖南醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室,安徽蕪湖241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院活性生物大分子研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽蕪湖241002；3.皖南醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,安徽蕪湖241002；4.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院內(nèi)分泌科,安徽蕪湖241001)

目的：利用人工合成多肽制備載脂蛋白M(appliprotein M，ApoM)兔多克隆抗體。方法：分析并選取一段特異性的ApoM氨基酸序列用于合成多肽，并耦聯(lián)鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)，用來免疫雄性的新西蘭大白兔，經(jīng)過多次加強(qiáng)免疫后用收集的兔抗血清制備多克隆抗體，并進(jìn)行Western Blot檢測。結(jié)果：利用人工合成并純化的多肽，經(jīng)多次免疫后獲得所需的多克隆抗體。結(jié)論：成功制備了兔ApoM多克隆抗體，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究ApoM的功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

載脂蛋白M；多肽；多克隆抗體

載脂蛋白M (apolipoprotein M,ApoM)是由徐寧等[1]人在研究富含甘油三酯脂蛋白(triglyceride-rich lipoprotein，TGRLP)時發(fā)現(xiàn)的一種不同于以往的脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類蛋白，優(yōu)勢表達(dá)于HDL中，少量表達(dá)于TGRLP 及LDL 中。人類ApoM基因定位于6號染色體短臂(6p21.3)，鄰接MHCⅢ區(qū)域，含有6個外顯子和5個內(nèi)含子，系單拷貝基因。人類ApoM cDNA (734 bp) 編碼一種含188 個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，相對分子量約26 kU，結(jié)構(gòu)與Lipocalin 家族相關(guān)聯(lián)。多組織表達(dá)列陣研究顯示[2]，ApoM表達(dá)具有高度的組織特異性，人ApoM特異表達(dá)于肝臟和腎臟，在胚胎、胚腎、胃、骨骼肌細(xì)胞、小腸、心臟、大腦、脾臟和睪丸中也有低表達(dá)，在肌肉組織、十二指腸和卵巢中無表達(dá)，具有較高的組織特異性，這提示ApoM的生理功能可能與肝臟和腎臟的功能密切相關(guān)[3]。ApoM在HDL中含5%，是HDL的主要成分之一，成人血漿ApoM含量約為0.63～1.13 mmol/L。ApoM主要與HDL相互作用，促進(jìn)HDL顆粒的成熟并調(diào)節(jié)其代謝[1]。目前的研究發(fā)現(xiàn)ApoM具有抗動脈粥樣硬化作用，與冠心病和糖尿病的發(fā)生密切相關(guān),已成為研究的熱點(diǎn)[4-6]。細(xì)胞核因子-1α(HNF-1α)可提高ApoM的表達(dá)水平，對心血管具有保護(hù)作用,是通過促進(jìn)膽固醇代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)并抑制膽固醇代謝相關(guān)抑制因子的生成進(jìn)而促進(jìn)膽固醇的轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)的。新的研究發(fā)現(xiàn)，ApoM通過對血管內(nèi)皮細(xì)胞的1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)受體提供S1P充當(dāng)HDL的血管保護(hù)成分[7-8]。在研究蛋白質(zhì)的功能和診斷檢測方面，抗體是一種重要的研究工具。為進(jìn)一步探明ApoM的功能，我們設(shè)計(jì)并合成人工多肽，通過免疫新西蘭大白兔，制備ApoM兔多克隆抗體，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料抗原多肽由上海生工全自動合成儀合成，完全福氏佐劑(complete Freund′s adjuvant，CFA)、不完全福氏佐劑(incomplete Freund′s adjuvant，IFA)，丙烯酰胺，購自Sigma公司；放射免疫沉淀技術(shù)(radioimmunopreciptation assay，RIPA)裂解液、二辛可寧酸(bicinchonininc acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒、loading buffer，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(H+L)和羊抗鼠IgG(H+L)抗體均購自碧云天公司，ApoM單克隆抗體購自CST(Cell Signaling Technology)公司，Ladder(10-170 kU)購自Pierce 公司，聚偏二氟乙烯(polycinylidene fluoride，PVDF)膜購自Bio-RAD公司，化學(xué)發(fā)光試劑盒購自賽默飛公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。雄性健康8周齡新西蘭大白兔2只(每只2.5 kg左右)購自南京大學(xué)-模式動物研究所，動物實(shí)驗(yàn)得到皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1ApoM特征性抗原肽段的合成根據(jù)ApoM基因編碼的氨基酸序列，利用在線蛋白分析軟件對ApoM蛋白信號肽、親水性和抗原性進(jìn)行分析，確定抗原肽段氨基酸序列，由上海生工合成并偶聯(lián)KLH，合成后的總量為10 mg，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2合成多肽的溶解和分裝多肽的溶解性很大程度上取決于多肽的極性。酸性蛋白溶解于堿性溶液，而堿性蛋白可溶解于酸性溶液，含有大量不帶電荷的極性氨基酸殘基或疏水性氨基酸的疏水性多肽和中性多肽可采用少量有機(jī)溶劑如二甲基亞砜(DMSO)溶解，然后再用PBS稀釋。但是含有甲硫氨酸或半胱氨酸的多肽不能用DMSO溶解，因?yàn)镈MSO可能造成側(cè)鏈氧化。耦聯(lián)了KLH的人工合成多肽顆粒，在溶解前先加入DMSO到多肽粉末中，方法是1 mg多肽溶于200～300 μL的DMSO，然后加PBS補(bǔ)足至1 mL，這樣所得多肽溶液的濃度是1 mg/mL，便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)取用。超聲處理有助于打碎顆粒并增加溶解度，但應(yīng)注意降溫，避免超聲處理引起溶液發(fā)熱和多肽降解。溶解后的多肽分裝到凍存管中置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫苊夥磸?fù)凍融。

1.2.3抗原與佐劑的乳化取溶解后的多肽抗原1mL，加入等體積的佐劑，用2.5 mL注射器抽取液體后，注射器留存少量空氣，通過三通頭連接另一注射器，然后相互推動注射器的活塞，使抗原與佐劑相互混合[9]。當(dāng)抗原和佐劑充分乳化后，滴一滴乳化后的液體在水面上，如果液體呈球形而不擴(kuò)散，表示抗原與佐劑乳化完全。

1.2.4免疫兔子制備新西蘭大白兔(分別標(biāo)記兔1、兔2)實(shí)驗(yàn)前常規(guī)飼養(yǎng)1周，采用背部脊柱旁多點(diǎn)皮下注射的方法免疫。首次免疫采用CFA乳化抗原，兔1和兔2分別注射抗原乳化液800 μL(400 μg)和400 μL(200 μg)作為基礎(chǔ)免疫，分4～8點(diǎn)作皮丘注射。首次免疫前先于注射點(diǎn)備皮并用75%的乙醇消毒，預(yù)防感染。注射前排凈注射器內(nèi)空氣后捏起兔子皮膚，按針頭與皮膚呈15°角進(jìn)針，進(jìn)針深度以1～2 cm為宜，不宜刺入肌肉。首次免疫后每2周加強(qiáng)免疫1次，加強(qiáng)免疫采用IFA乳化抗原，相較于首次免疫，加強(qiáng)免疫劑量減半。第3次免疫后通過耳緣靜脈采血1 mL，獲得抗ApoM血清，做Western Blot檢測。如果檢測到抗體后，于再次免疫1周后取血。

1.2.5免疫前后采血準(zhǔn)備兩個5號醫(yī)用輸液針，從針頭后約2 cm處剪斷皮管備用。在助手協(xié)作下固定兔子，用手指輕彈其耳根部使血管充盈，采用乙醇消毒后，將輸液針頭插入耳部血管中，血液順著針管一滴滴流出，用離心管收集所需量血液后退出針頭，并用干棉球按壓止血。該方法操作簡單，每次取血量不超過8 mL，飼養(yǎng)一段時間后可反復(fù)取血。先將離心管置于37℃的恒溫箱中30 min，然后置于4℃冰箱中過夜，使其自然凝固，析出血清。以4000 r/min，4℃離心10 min，收集上清后分裝置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 Western bIot檢測抗體①組織蛋白的處理。分別取野生型、雜合型和剔除型ApoM模型小鼠的肝臟組織，嚴(yán)格按RIPA試劑盒說明書操作法提取肝組織蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定提取蛋白濃度后，取適量蛋白樣品與上樣緩沖液按4∶1混勻，100℃金屬浴10 min后冷卻至室溫備用，其余樣品置于-80℃?zhèn)溆?。②配制SDS-PAGE膠。按照制膠方案制備15%的分離膠和5%的濃縮膠。③采用SDS-PAGE方法檢測血清中ApoM的抗體。具體操作方法為每孔點(diǎn)樣金屬浴后的蛋白30 μg后電泳，100V恒壓轉(zhuǎn)膜70 min，標(biāo)記蛋白面后將PVDF膜置于5%的脫脂奶粉中封閉1 h，以1∶500稀釋的兔抗血清作為一抗，用商業(yè)化的ApoM單克隆抗體作為對照，4℃孵育過夜。以1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG抗體作為二抗孵育1 h后洗膜，滴加發(fā)光液在多功能成像儀中檢測Western blot結(jié)果并分析。

2　結(jié)果

2.1ApoM多肽氨基酸序列分析利用在線蛋白分析軟件對ApoM蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，并結(jié)合市場上利用多肽制備的成熟抗體所選擇的氨基酸序列，避免選擇蛋白內(nèi)部重復(fù)或接近重復(fù)段的序列以及同源性太強(qiáng)的肽段作為抗原，以提高獲得抗體的特異性。經(jīng)過對ApoM蛋白信號肽、親水性和抗原性分析，最終選擇ApoM蛋白氨基酸序的第106～120位氨基酸(ETRARLSKELQAAQA)作為合成多肽的序列，見圖1。

A為信號肽分析結(jié)果，位于19位氨基酸對應(yīng)的c值最大，s值陡峭，y值最高峰，該處預(yù)測為信號肽的剪切位點(diǎn)。B為親水性分析結(jié)果，蛋白的親水部位與蛋白抗原表位有密切的聯(lián)系。C為抗原性分析結(jié)果，抗原肽段應(yīng)選擇親水性和抗原性強(qiáng)的區(qū)域，并綜合參考各種參數(shù)。

圖1ApoM蛋白質(zhì)性質(zhì)分析結(jié)果

2．2抗原多肽的溶解和分裝取一個10 mL的離心管，加入6 mg多肽,滴加DMSO溶解后，加入PBS調(diào)至6 mL并混勻，然后分裝在6支凍存管中，每支1 mg/mL，便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融，見圖2。

2．3ApoM多克隆抗體的檢測利用耦聯(lián)了KLH的ApoM多肽抗原免疫新西蘭大白兔，獲得兔抗血清。通過Western bIot檢測，ApoM剔除小鼠及野生型和雜合子小鼠肝組織中ApoM的表達(dá)，結(jié)果顯示在23 ku左右有一特異性條帶，結(jié)果與預(yù)測一致,商業(yè)化的ApoM單抗約為25 ku，如圖3所示。

A：向多肽粉末中加入DMSO，溶解多肽；B：用PBS定容至6 mL；C：將溶解后的多肽溶液分裝凍存管中，放-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖2多肽的溶解和分類

A為免疫后兔抗血清的檢測結(jié)果，Lane1～2為野生型鼠，Lane3～4為雜合子鼠，Lane5～6為剔除鼠；B為商業(yè)化的ApoM單克隆抗抗的檢測結(jié)果，Lane1～2為野生型鼠，Lane3～4為剔除鼠。

圖3western blot檢測結(jié)果

3　討論

ApoM是一種新型的與脂蛋白相關(guān)的載脂蛋白，主要存在于高密度脂蛋白(HDL),ApoM可能影響HDL代謝和抗動脈粥樣硬化的功能，并與糖尿病等代謝性疾病關(guān)系密切。對ApoM 近啟動子側(cè)多態(tài)性位點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)，T-778C的單核苷酸多態(tài)性與 1 型糖尿病顯著相關(guān)；且T-778C與膽固醇水平相關(guān)，與2 型糖尿病的易感性有關(guān)，提示 ApoM 基因啟動子的 T-778C 可能參與了1型和2 型糖尿病的共同發(fā)病機(jī)制[6,10]。ApoM在冠心病發(fā)生發(fā)展扮演重要角色，促進(jìn)HDL成熟，可逆轉(zhuǎn)動脈粥樣斑塊的形成，可能作為冠心病診斷與治療的新靶點(diǎn)。而在糖尿病的發(fā)病過程中，胰島素、血糖對ApoM調(diào)控的復(fù)雜機(jī)制以及ApoM與糖尿病的發(fā)病關(guān)聯(lián)還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)揭示。ApoM在腎臟組織中高表達(dá)，為腎巨蛋白配體，可阻止腎臟脂質(zhì)分子的丟失，但是其在腎臟疾病中的作用尚少見報(bào)道，對于其在腎臟組織內(nèi)的生理及病理作用有待進(jìn)一步揭示。為進(jìn)一步研究ApoM在上述疾病中的作用及其對信號通路的影響機(jī)制，我們采用人工合成并耦聯(lián)了KLH的ApoM多肽片段作為抗原，為了增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，采用佐劑和抗原混合免疫的方法。該方法可以刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，通過增加免疫活性細(xì)胞來促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用，進(jìn)而增強(qiáng)抗體的產(chǎn)生。用乳化后的抗原免疫新西蘭大白兔，最終獲得兔多克隆抗體。免疫動物時，由于個體差異及不同抗原的最佳免疫劑量不同，過高或過低都無法獲得最佳的免疫效果。因此我們選擇兩只實(shí)驗(yàn)兔子，分別注射采用不同劑量的抗原，以保證有一只兔子能產(chǎn)生最佳的免疫效果。采用人工合成多肽的方法制備抗原，與傳統(tǒng)原核表達(dá)目的蛋白制備的抗原相比，人工合成多肽純度高，且操作簡潔，所得抗體特異性強(qiáng)，靈敏度高，進(jìn)一步節(jié)約制備抗體所用時間[11]。為進(jìn)一步方便研究人員研究該分子在疾病中的作用提供便利的檢測基礎(chǔ)，同時也為探明ApoM信號傳導(dǎo)通路及機(jī)制提供有效的研究手段。

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Using synthetic peptide to prepare the rabbit anti-ApoM polyclonal antibody

TAN Fengbiao,GAO Jialin,LU Xiaohua,ZHANG Yao

Department of Biochemistry,Wannan Medical College,Wuhu 241002，China

Objective：To prepare rabbit anti-appliprotein M (ApoM) polyclonal antibody using synthetic peptides.Methods:Specific amino acid sequences of ApoM was initially synthesized and selected after analysis.Keyhole limpet hemocyanin (KLH) was used as carries in the conjugation of the peptides for antibody production.Then rabbit anti-ApoM polyclonal antibody was prepared using the serum obtained from male New Zealand white rabbits undergone repeatedly boosted immunization,and determined with Western blot.Results:The rabbit anti-ApoM polyclonal antibody was successfully prepared with artificially recombined and purified polypeptides.Conclusion:The rabbit anti-ApoM polyclonal antibody may lay a foundation for following experimental study of the ApoM expression.

appliprotein M;polypeptide;polyclonal antibody

1002-0217(2016)05-0422-04

蕪湖市科技局產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目(2013cxy04)；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1508085NH149)

2016-04-10

譚鳳彪(1984-)，男，2014級碩士研究生,(電話)13955375794，(電子信箱)253791056@qq.com；

.1

A

10.3969/j.issn.1002-0217.2016.05.004

章堯，男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，(電子信箱)zhangyao@ahedu.gov.cn，通信作者.