謝毅鮑錦庫

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 四川成都 610000；2.成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司 四川成都 610000）

甘肅棘豆內(nèi)生細(xì)菌的分析與研究

謝毅1，2鮑錦庫1

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 四川成都 610000；2.成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司 四川成都 610000）

甘肅棘豆屬于瘋草，有毒，為豆科棘豆屬多年生草本植物，嚴(yán)重影響我國西南牧區(qū)的牲畜安全。植物內(nèi)生細(xì)菌是指定殖在植物組織內(nèi)部但不引起明顯病害癥狀的細(xì)菌，它具有許多生物學(xué)功能作用。本文以甘肅棘豆種子為研究對(duì)象對(duì)其內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了分離，并利用形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)等方法進(jìn)行了初步鑒定。實(shí)驗(yàn)共分離到3株菌株，2株桿菌，1株球菌。所得菌株為后續(xù)研究甘肅棘豆內(nèi)生細(xì)菌與甘肅棘豆所含毒素的相互關(guān)系提供了細(xì)菌菌株來源。

棘豆 內(nèi)生細(xì)菌 形態(tài)觀察 生化鑒定

1 前言

瘋草包括棘豆屬和黃芪屬兩類有毒植物，國內(nèi)外均有廣泛分布，甘肅棘豆屬于棘豆屬瘋草中的一種。動(dòng)物長期或大量采食瘋草后，可引起以慢性神經(jīng)機(jī)能障礙為特征的中毒性疾病，稱為瘋草中毒病，近幾年來，瘋草的分布迅速蔓延，吞噬優(yōu)良草地，每年造成700多萬只牲畜死亡，已成為影響我國西南牧區(qū)危害草原畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要毒草。

植物內(nèi)生細(xì)菌為植物組織內(nèi)的正常菌群，是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成成分。植物內(nèi)生細(xì)菌長期生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中并與宿主協(xié)同進(jìn)化。一方面植物體為其提供生長必需的能量和營養(yǎng)；另一方面，植物內(nèi)生細(xì)菌又可通過自身的代謝產(chǎn)物或借助于信號(hào)傳導(dǎo)作用對(duì)植物體產(chǎn)生影響。

分析與研究甘肅棘豆內(nèi)生細(xì)菌將對(duì)甘肅棘豆毒素（苦馬豆素）的產(chǎn)生機(jī)理或降解機(jī)理的研究有著非常重要的意義，研究初步表明植物內(nèi)生細(xì)菌對(duì)產(chǎn)生或降解苦馬豆素有一定的作用關(guān)系。本研究以甘肅棘豆種子為研究對(duì)象對(duì)其內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了分離，并利用形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)等方法進(jìn)行了初步鑒定，以期為后續(xù)研究甘肅棘豆內(nèi)生細(xì)菌與甘肅棘豆所含毒素的相互關(guān)系提供了細(xì)菌菌株來源。

2 材料與器材

2.1 材料

甘肅棘豆種子

2.2 試劑與設(shè)備

1%次氯酸鈉、培養(yǎng)基、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、生化檢測管、PBS緩沖液、高壓滅菌鍋、天平、錐形瓶、表面皿、量筒、培養(yǎng)皿、恒溫箱、冰箱、顯微鏡等。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 樣品預(yù)處理

植物組織的內(nèi)生細(xì)菌分離提取的關(guān)鍵是排除植物體表細(xì)菌的混雜，以免將外源的細(xì)菌定義為植物內(nèi)生細(xì)菌。在內(nèi)生細(xì)菌的分離程序中，表面消毒除去表面細(xì)菌而又不殺死植物內(nèi)生細(xì)菌是關(guān)鍵步驟。

經(jīng)過試驗(yàn)表明，利用蒸餾水漂洗5min后，再使用1%的次氯酸鈉溶液消毒10min效果較好，種子沖洗水涂撥在培養(yǎng)基上無細(xì)菌生長，種子研磨液涂撥在培養(yǎng)基上又有較多的細(xì)菌菌落。

3.2 內(nèi)生細(xì)菌的分離、純化

甘肅棘豆種子經(jīng)表面消毒后，用蒸餾水再?zèng)_洗一遍，取0.5ml沖洗液加到含有細(xì)菌培養(yǎng)基的錐形瓶內(nèi)，搖床培養(yǎng)3d，作為對(duì)照組。

將表明消毒處理后的種子放到經(jīng)高壓除菌消毒的研缽內(nèi)，加入蒸餾水2ml，研磨，取0.5ml研磨液倒入含有細(xì)菌培養(yǎng)基的錐形瓶內(nèi)，搖床培養(yǎng)3d，作為實(shí)驗(yàn)組。

若對(duì)照組未有細(xì)菌生長，而實(shí)驗(yàn)組有細(xì)菌生長，則吸取0.1ml培養(yǎng)液涂撥在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

根據(jù)菌落形態(tài)、顏色和大小統(tǒng)計(jì)細(xì)菌菌落的種類。挑取不同的菌落，平板劃線純化，純化后接種到液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，取0.5ml培養(yǎng)液甘油保存，放于-20℃冰箱。

3.3 內(nèi)生細(xì)菌的初步鑒定

3.3.1 菌落形態(tài)觀察

在普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)分離的菌株，觀察菌落形態(tài)（大小、形狀、邊緣、表面形狀、隆起度、顏色及透明度、硬度），必要時(shí)可借助于放大鏡。

3.3.2 顯微鏡觀察

對(duì)分離培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)（革蘭氏染色、形狀、大?。?。

3.3.3 生理生化試驗(yàn)

吲哚、接觸酶、VP、酪素水解、淀粉水解、明膠液化、硝酸鹽還原、G產(chǎn)酸等實(shí)驗(yàn)。

表2 內(nèi)生菌的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)果與分析

4.1 菌落形態(tài)

GSGD-1的菌落形態(tài)：菌落較大、不規(guī)則、不整齊、有隆起、表面光滑、灰白不透明、干燥。

GSGD-2的菌落形態(tài)：針尖大小、點(diǎn)狀、整齊、無隆起、表面光滑、無色半透明、濕潤。

GSGD-3的菌落形態(tài)：菌落較大、不正圓、不整齊、輕度隆起、表面有皺折、灰白不透明、干燥。

4.2 顯微鏡觀察

GSGD-1形態(tài)：桿菌、鏈狀或雙、中等大小、兩端鈍圓，革蘭氏陰性。GSGD-2形態(tài)：桿菌、單個(gè)、體積較大、中間突起兩端尖，革蘭氏陰性。GSGD-3形態(tài)：球菌、單個(gè)、中等大小，革蘭氏陽性。

4.3 生理生化試驗(yàn)結(jié)果

如表2所示。

5 討論

甘肅棘豆是我國的重要瘋草之一，可引起放牧牲畜中毒，嚴(yán)重危害西部地區(qū)畜牧業(yè)的發(fā)展?？囫R豆素既是甘肅棘豆的主要毒性成分，又是目前治療腫瘤的有效藥物。但對(duì)苦馬豆素在甘肅棘豆中的合成機(jī)理仍未研究明確。西北農(nóng)林科技大學(xué)的余永濤等已經(jīng)從毛瓣棘豆、冰川棘豆中分離出可生成苦馬豆素的內(nèi)生真菌。

甘肅棘豆內(nèi)生細(xì)菌與苦馬豆素之間存在何種互相作用的關(guān)系，內(nèi)生細(xì)菌在甘肅棘豆植物體內(nèi)能否產(chǎn)生苦馬豆素還是能降解該毒素，這些問題的研究將為進(jìn)一步闡明苦馬豆素的合成機(jī)理及降解機(jī)理提供依據(jù)和理論基礎(chǔ)，并為從根源上解決動(dòng)物瘋草中毒病和工業(yè)化生產(chǎn)生產(chǎn)苦馬豆素提供新的研究方向。

本研究論文以甘肅棘豆種子為研究對(duì)象，通過表面消毒除去表面微生物的方法，篩選分離到甘肅棘豆種子內(nèi)生細(xì)菌3株，2株革蘭氏陰性桿菌，1株革蘭氏陽性球菌，為后續(xù)甘肅棘豆內(nèi)生細(xì)菌與苦馬豆素之間相互作用的機(jī)理研究提供了良好的內(nèi)生細(xì)菌菌株資源。

［1］余永濤，王建華，趙清梅，等.甘肅棘豆中產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌的分離與鑒定［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，37（2）：40～46.

［2］晶盈，陳維信，劉愛媛.物內(nèi)生菌及其防治植物病害的研究進(jìn)展［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，26（7）：59～32.

［3］文才藝，元華，秀玲.植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展及其存在的問題［J］. 生態(tài)學(xué)雜志，2004，23（2）：86～91.

［4］Jose R. Valdez Barillas. White locoweed toxicity is facilitated by a fungal endophyte and nitrogen-fixing bacteria［J］. Ecology，2007， 88（7）：1850～1856.

［5］鄒林，楊鳴琦.苦馬豆素抗腫瘤作用研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27（4）：36～38.

［6］Romero J M ， Creamer R ， Zepeda H. The toxicosis of Embellidia fungi from locoweed （Oxytropis lambertii） is similar to locoweed toxicosis in rats［J］. J. Anim Sci， 2004（82）：2169 ～2174.

［7］M. H. Ralphs ， R. C.， D. Baucom， D. R. Gardner， S. L. Welsh， J. D. Graham， C. Hart， D. Cook and B. L. Stegelmeier. Relationship Between the Endophyte Embellisia spp. and the Toxic Alkaloid Swainsonine in Major Locoweed Species （Astragalus and Oxytropis）.Journal of Chemical Ecology，2008，34（1）： 32～38.

［8］東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，2001，349-398.

［9］布坎南R E.吉本斯N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊［M］ .第八版.中國科學(xué)院微生物研究所.譯.北京：科學(xué)出版社，1984.677～701.

Analysis and research of endophytic bacteria in Gansu oxytropis

Gansu oxytropis Belonging to crazyweed is toxic， which is perennial herb of oxytropis.It has serious impact on livestock safety of our southwest pastoral areas.Plant endophytic bacteria are designated as bacteria in plant tissues but do not cause obvious symptoms of disease for plant. It has many biological functions.This paper takes Gansu oxytropis seeds as the research object.Endophytic bacteria were isolated from the seeds and the method of morphological observation and biochemical test was used to identify the bacteria.3 strains of bacteria were isolated ， 2 strains of Bacillus， 1 strains of coccus. Research provides a source of bacterial strains for research about the relationship between Gansu oxytropis endophytic bacteria and Gansu Oxytropis toxins.

oxytropis， endophytic bacteria， morphological observation， biochemical identification

Q939

A

1674-2060（2016）02-0001-02

謝毅（1984—），男，漢族，四川成都人，現(xiàn)從事于血液制品行業(yè)，就職于成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司，具有8年的生產(chǎn)工作經(jīng)驗(yàn)。同時(shí)為四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院在職研究生。