趙建

（南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 河南南陽 473000）

致病性大腸桿菌YZ-3的分離鑒定與耐藥性分析

趙建

（南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 河南南陽 473000）

目的：探討致病菌YZ-3的分離鑒定與耐藥性。方法：采集腹瀉患者的糞便經(jīng)細菌培養(yǎng)，生化鑒定，16s rRNA鑒定后分析其耐藥性。結(jié)果：經(jīng)生化鑒定及16s rRNA鑒定，顯示所分離菌株為一株致病性大腸桿菌，能夠?qū)е氯嘶几篂a，對很多藥物存在耐藥性。結(jié)論：對病原菌進行鑒定，并分析其耐藥性，對于臨床防治疾病具有重要作用。

致病性大腸桿菌 分離鑒定 耐藥性

抗生素因長期在臨床廣泛使用，且在應(yīng)用過程中存在一定不合理性，導(dǎo)致菌株產(chǎn)生明顯耐藥性，因此了解病原菌的生物學(xué)特性及其耐藥性對于指導(dǎo)臨床用藥具有重要作用［1］。實驗分離鑒定一株大腸桿菌，并分析其耐藥性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

南陽醫(yī)專一附院消化科腹瀉患者。

1.2 方法

無菌采集腹瀉患者的糞便標(biāo)本涂布接種到麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍平板上，在37℃狀態(tài)下培養(yǎng)18-24h；挑選伊紅美藍平板疑似大腸桿菌菌落接種到營養(yǎng)瓊脂平板。

1.2.1 生化鑒定

將疑似大腸桿菌形態(tài)特征的細菌YZ-3進行蔗糖、水楊酸、D-木糖、硫化氫、衛(wèi)矛醇、乳糖、麥芽糖、L-阿拉伯糖、甘露醇、間-肌醇、尿素酶、七葉苷水解、葡萄糖、山梨醇、吲哚、M-R、V-P、枸櫞酸鹽利用、明膠液化等生化實驗。［1］

1.2.2 16s rRNA鑒定

對細菌DNA進行提取，將所提取的DNA 作為模板，進行PCR擴增，所用的引物是通用正向引物P1（5’-3’） AGAGTTTGATCC T G G C T C A G和通用反向引物P 2（5’-3’）G G T T A C C T T G T T ACGACTT。PCR反應(yīng)條件：94℃，5min；94℃，3min；58℃，1min；72℃，1min；72℃，3min［2］。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后寄去上海生工測序。

1.2.3 藥敏試驗

對大腸桿菌耐藥性進行分析，將分離純化后的大腸桿菌，接種到3-5mLLB 液體培養(yǎng)基。經(jīng)37℃狀態(tài)持續(xù)培養(yǎng)12h。無菌棉簽蘸取菌液將其均勻涂至M-H瓊脂平板，自然晾干。將鑷子夾取不同藥敏紙片，并將其根據(jù)一定間隔貼至平板不同位置，兩紙片間距需高于24 mm，紙片與平板邊緣距離超過15mm，經(jīng)37℃溫箱持續(xù)培養(yǎng) 24h后觀察其結(jié)果。將大腸桿菌 ATCC25922 用作標(biāo)準(zhǔn)菌株，分析藥物敏感性，所選取藥物為：青霉素、氨芐西林、哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢噻呋、美羅培南、比阿培南、氨曲南、丁胺卡那、阿莫西林、慶大霉素、新霉素、頭孢曲松、安普霉素、強力霉素、土霉素、紅霉素、左旋氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、克林沙星、粘桿菌素、氟苯尼考、磷霉素［3］。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)特性

分離菌YZ-3麥康凱培養(yǎng)顯示為紅色、圓形、微凸、邊緣整齊、表面較為光滑，濕潤。經(jīng)伊紅美藍培養(yǎng)顯示為紫黑色，圓形狀態(tài)，微凸起，邊緣整齊，表面較為光滑，保持濕潤，往往存在金屬光澤。根據(jù)《伯杰氏手冊》第九版將YZ-3初步確定為大腸桿菌。

2.2 16s rRNA 鑒定結(jié)果

經(jīng)PCR 擴增大腸桿菌YZ-3 的16s rRNA 在1450bp左右產(chǎn)生特異性條帶，與預(yù)期大小具有相符性。16s rRNA測序結(jié)果與NCBI菌株相比，分離菌YZ-3與大腸桿菌ATCC25922 同源性為100%。YZ-3為一株致病性大腸桿菌，能夠使得動物與人類出現(xiàn)疾病。

2.3 藥物敏感性試驗

大腸桿菌YZ-3對于阿莫西林、氨芐西林、慶大霉素、青霉素、安普霉素、克林沙星、環(huán)丙沙星、強力霉素、土霉素、紅霉素、磷霉素、恩諾沙星、左旋氧氟沙星、氟苯尼考高度耐藥，對于哌拉西林、比阿培南、粘桿菌素制度耐藥，對于頭孢曲松、美羅培南、頭孢噻肟、氨曲南、丁胺卡那敏感。藥敏試驗中各種藥物對大腸桿菌的抑菌圈直徑如表1所示。

表1 藥敏試驗中各藥物對大腸桿菌的抑菌圈直徑（mm）

3 討論

分離菌YZ-3革蘭氏染色陰性，為中等大小，直桿菌，其兩端為頓圓狀，分布時有單個的，也有成對的，無芽胞，無可見莢膜。經(jīng)麥康凱培養(yǎng)特點有紅色、圓形、微凸?fàn)?、邊緣保持整齊、表面具光滑性，濕潤性菌落，經(jīng)伊紅美藍培養(yǎng)后則顯示紫黑色，圓形，稍凸起，邊緣保持整齊，表面具有光滑，濕潤，往往存在金屬光澤。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察和生化試驗顯示與《伯杰氏手冊》大腸桿菌的特點具有相符性［1］，初步鑒定后YZ-3為大腸桿菌。16s rRNA 測序表明YZ-3的 16s rRNA 序列與大腸桿菌ATCC25922 同源性為100%。

近年來，隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，細菌耐藥性逐年增加，致使一些抗菌藥物臨床療效降低。表1表明，大腸桿菌YZ-3對于阿莫西林、氨芐西林、慶大霉素、青霉素、安普霉素、克林沙星、環(huán)丙沙星、強力霉素、土霉素、紅霉素、磷霉素、恩諾沙星、左旋氧氟沙星等高度耐藥。如何根據(jù)藥敏結(jié)果合理使用抗生素，控制耐藥性的不斷上升，需要臨床醫(yī)師、臨床藥師和實驗室人員的共同努力。

［1］東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］. 第1版.北京東黃城北街16號：科學(xué)出版社，2001，64-65.

［2］Jagals， P.；Barnard， T.G.；Mokoena， M.M，etc.Pathogenic Escherichia coli in rural household container waters［J］.Water Science and Technology，2013，67（6）：3264-3266.

［3］隋素琴，尤兆雄，張瑞君，等.醫(yī)院感染病原菌的分布及耐藥性分析［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012，22（20）：4639-4641.

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1674-2060（2016）02-0187-01

趙建（1974—），女，講師。