張書光 丁 宏 李乙江 楊 科 普仕華 高花英 李佳赟

（德宏州動物疫病預防控制中心，云南德宏　678400）

口蹄疫病毒RT-PCR快速檢測方法的建立

張書光 丁 宏 李乙江 楊 科 普仕華 高花英 李佳赟*

（德宏州動物疫病預防控制中心，云南德宏678400）

目的：建立了一種RT-PCR的方法，用于檢測O、A和亞洲I型口蹄疫病原。方法：設計合成一套引物，通過反應條件的優(yōu)化，建立RT-PCR的方法，以擴增口蹄疫病毒的基因，并用該法檢測患病豬的頜下淋巴結(jié)和扁桃體，牛、羊的食道-咽分泌物（O-P液）等樣品。結(jié)果：該方法可快速靈敏檢測出豬的頜下淋巴結(jié)和扁桃體，牛、羊的食道-咽分泌物（O-P液）中的FMDV，并具有較好的特異性和重復性。結(jié)論：建立了一種RT-PCR檢測O、A和亞洲I型口蹄疫病原的方法。

口蹄疫病毒RT-PCR快速檢測方法

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起如黃牛、豬、綿羊、山羊等偶蹄動物感染的一種熱性、接觸性、烈性傳染病，被國際動物衛(wèi)生組織列為A類重要傳染病之首。該病的發(fā)生和流行嚴重危害畜牧業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，造成巨大的經(jīng)濟損失，因此世界各國相當重視對該病的研究和防治。該病對畜牧業(yè)生產(chǎn)危害性極大，是世界各國檢疫和防疫的重點對象。

德宏州地處云南滇西邊境，與緬甸毗鄰，邊境線全長503.8km，邊境線無人工和天然屏障，中緬貿(mào)易相互往來，牧場共用。全州有兩個國家一類口岸，兩個二類口岸，28個渡口，64條通道，是我國東南亞的主要窗口和重要樞紐。隨著經(jīng)濟的發(fā)展，從境內(nèi)、外輸入我州的偶蹄動物數(shù)量不斷增加，在我州進行短期育肥后屠宰再進行貿(mào)易和消費，從而對我州的動物疫病防控帶來了極大風險。因此口蹄疫病毒RT-PCR檢測方法的建立已迫在眉睫。

1　材料與方法

1.1陽性病料和引物設計、合成

陽性病料和O、A和亞洲I型檢測引物由云南省動物疫病預防控制中心提供。引物擴增片段大小為450bp。

1.2儀器設備、酶和試劑盒

核酸自動提取儀NP968-S（西安天?。?，震動球磨儀GT200（格瑞德曼），PCR儀（德國耶拿），Syngene凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP），Ex-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒（西安天?。?，PrimeScript? One Step RT-PCR Kit（TAKARA）。

1.3總RNA的提取

分別應用西安天隆科技有限公司生產(chǎn)的Ex-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒和從豬的頜下淋巴結(jié)和扁桃體，牛、羊的食道-咽分泌物（O-P液）中提取總DNA/RNA，具體操作過程見說明書。

1.4RT-PCR

RT-PCR體系：

Enzyme　Mjx　2μl 2×1 Step Buf fer 　25μl上游引物（20 μM） 　1μl（0.4μM/μl）下游引物（20 μM） 　1μl（0.4μM/μl）提取的總RNA 　1μl RNa s e F r e e d H 2O 　Up t o 5 0?μl

反應條件：

50℃30 min

94℃2 min

94℃30 sec

55～65℃30 sec25～30 Cycles

72℃1 min/kb

1.5PCR 產(chǎn)物的檢測

取5～10μl擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠（含0.5%μg/m l 花青素）。配膠及電泳緩沖液均為1×TAE（0.04mol/L Tris-乙酸，0.001mol/L EDTA，pH8.0），200V電泳30～40min，在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)觀察PCR產(chǎn)物在凝膠中的位置，以DL2，000DNA Marker為參照物，確定擴增產(chǎn)物的分子量，判定結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1樣品處理

口蹄疫病毒的嗜好組織為：豬的頜下淋巴結(jié)和扁桃體，牛、羊的食道-咽分泌物（O-P液）。樣品處理的好壞直接會影響到核酸的提取效果。目前常用的方法是組織研磨磨碎后反復凍融，12000rpm離心5min取上清，牛、羊的食道-咽分泌物（O-P液）直接12000rpm離心5min取上清。由于手工研磨費時費力，本實驗主要對組織提取方法進行比對，采用震動球磨儀GT200自動研磨和手工研磨兩種方法，結(jié)果如下：

自動研磨和手工研磨　耗費時間球磨儀　2mjn/24份+1mjn/份手工　3mjn/份

當樣品≤8時，直接用人工研磨的更加快速。當樣品數(shù)＞8時，震動球磨儀GT200研磨出的樣品比人工研磨的更加快速。

2.2RNA提取方法的建立

目前常用的核酸提取方法包括手工提取法（吸附柱法）和核酸自動提取儀提取法（磁珠法），將兩種方法提取的核酸電泳檢測比對發(fā)現(xiàn)兩種方法均可以提取出較高質(zhì)量的RNA，均符合本實驗要求。

手工和核酸自動提取儀RNA提取效果圖

從左到右依次為：Marker、手工1號RNA、手工2號RNA、自動提取儀1 號RNA、自動提取儀2號RNA

O、A和亞洲I型三對引物梯度PCR效果圖

從左到右依次為：Marker、55（O、A、亞洲I）、57（O、A、亞洲I）、58（O、A、亞洲I）、59（O、A、亞洲I）和60℃（（O、A、亞洲I））2.3RT-PCR 方法的建立

為了確定O、A和亞洲I型三對引物的退火溫度，分別對三對引物進行了梯度PCR擴增，通過幾輪梯度PCR，比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)O、A和亞洲I型三對引物的最佳退火溫度均為60℃。

3　討論

目前常規(guī)檢測 FMD 的技術主要有動物接種、病毒分離和血清學試驗等方法，上述方法有的費時長達幾天至數(shù)周（如動物接種）、有的需細胞培養(yǎng)等條件（如血清中和試驗）、有的存在非特異性反應（如熒光抗體試驗）和敏感性低（如瓊擴）等缺點。這些方法難于滿足口岸動植物檢疫部門及基層獸醫(yī)檢疫部門對進出口動物、畜產(chǎn)品（主要是肉、奶等）、痊愈動物帶毒及亞臨床感染的檢測。因此，我們建立了一種可快速準確檢測FMDV的RTPCR 技術。

目前RT-PCR檢測 FMD 的技術主要環(huán)節(jié)為樣品處理、核酸提取和穩(wěn)定的檢測引物三個方面。本實驗對三個環(huán)節(jié)均進行了大量的摸索，發(fā)現(xiàn)震動球磨儀GT200研磨出的樣品1500轉(zhuǎn)3min可以將組織均勻打碎，有利于實驗結(jié)果的重復性和可參比性。核酸自動提取儀提取法（磁珠法），可以提取出較高質(zhì)量的RNA，鑒于磁珠法方便快捷全自動，半個小時可以完成32份樣品的核酸提取，因此磁珠法更適用于各州市縣動物疫控中心的大批量監(jiān)測。

試驗結(jié)果表明，O、A和亞洲I型三對引物的最佳退火溫度均為60℃，使用該退火溫度，檢測條帶清晰明亮，可有效避免假陽性和假陰性的實驗結(jié)果出現(xiàn)，同時，為了質(zhì)控標準，可在實驗時做陰陽性對照，陽性對照可用商品弱毒疫苗提取核酸，陰性對照可用雙蒸水。