黃　霞， 盧　禹

( 中山大學 生命科學學院 / 廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室， 廣州 510275 )

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文心蘭類原球莖的愈傷組織誘導及其植株再生

黃霞*， 盧禹

( 中山大學 生命科學學院 / 廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室， 廣州 510275 )

該研究首次以文心蘭的類原球莖(protocorm-like bodies, PLBs)為外植體進行愈傷組織誘導及其植株再生培養(yǎng)，并分析了不同濃度的TDZ和2,4-D配比對愈傷組織增殖的影響。結果表明：以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加1 mg·L-1TDZ與3 mg·L-12,4-D，從接種的 PLBs上可以誘導出乳白色的、較疏松的愈傷組織，誘導頻率達到100%。愈傷組織繼代培養(yǎng)時，在2,4-D濃度為0.5～2.0 mg·L-1的范圍內，其增殖主要受TDZ濃度的影響，TDZ濃度從1.0 mg·L-1降低到0.5 mg·L-1，愈傷組織鮮重增殖倍數顯著增加，由最低的4.50倍增加到最高的6.04倍。愈傷組織增殖的最適培養(yǎng)基為1/2MS + 0.5 mg·L-1TDZ + 1.0 mg·L-12,4-D。將在最適愈傷組織增殖培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)約1個月的愈傷組織轉移到T2培養(yǎng)基(3.5 g·L-1花寶1號 + 20 g·L-1紅薯 + 25 g·L-1香蕉 + 1 g·L-1tryptone + 20 g·L-1蔗糖 + 3.5 g·L-1phytagel)上，黑暗培養(yǎng)1個月后，每克鮮重的愈傷組織約誘導出1 328.67個PLBs。將誘導出的PLBs轉移到新鮮的T2 培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)1個月，萌發(fā)率為90.12%。而將小植株轉移到添加1 g·L-1活性炭的1/2MS培養(yǎng)基上，成苗率達到100%。該研究結果成功建立了文心蘭的高頻愈傷組織誘導及其植株再生體系，為文心蘭基因工程育種提供了一個高效、穩(wěn)定的轉化受體系統。

文心蘭, 組織培養(yǎng), 愈傷組織增殖, TDZ, 再分化

文心蘭又名舞女蘭、 跳舞蘭, 屬蘭科(Orchidaceae)文心蘭屬 (Oncidium)，原產于美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)(Chase et al，2009)。文心蘭主要作為切花和盆花生產，其花分枝良好、花形優(yōu)美、花色亮麗，且可連續(xù)開花，具有較高的觀賞價值和較強的市場競爭力，尤其是在歐美市場中成為暢銷的盆花種類之一。與其它蘭科植物相同，由于傳統分株繁殖系數較低，業(yè)界主要利用組織培養(yǎng)技術進行文心蘭種苗繁殖(崔廣榮，2010)。有關文心蘭離體快速繁殖技術的研究大都是針對試管苗工廠化生產而進行的，主要集中于研究如何從外植體直接誘導出PLBs、PLBs增殖及植株再生。以文心蘭的花梗及其花芽(彭曉明等，2000；鐘士傳和曹善東，2002)、莖(芽)尖(Lim-Ho，1981；彭曉明等，2000)、根尖(Kerbauy，1984)或葉片(Chen et al，1999)等組織器官為外植體，均可誘導出PLBs，建立文心蘭離體再生體系。在此基礎上，成功的文心蘭基因轉化系統均以PLBs為轉化受體，但以PLBs作為轉化受體得到的轉基因植株多是嵌合體，而且轉化效率較低(Liau et al，2003；You et al，2003；Raffeiner & Serelc，2009；林吾睿等，2012；Lee et al，2015)。由愈傷組織誘導形成PLBs多為單細胞起源(Jheng et al，2006)，因此，以愈傷組織為轉化受體，對于提高轉化效率和獲得穩(wěn)定遺傳目的基因的純合子非常有利。雖然以文心蘭的莖切段(Chen & Chang，2000)、根尖(Chen et al，2000；Wu et al，2004)和莖尖(Jheng et al，2006)等為外植體，可誘導出愈傷組織并實現了植株再生，但其愈傷組織誘導頻率低、周期長，而且愈傷組織難以保持胚性狀態(tài)。

文心蘭(Oncidium‘Gower Ramsey’)是一種觀賞性較高、市場競爭力較強的蘭花。基因工程育種技術為觀賞植物的品種改良提供了有效途徑，而以愈傷組織為轉化受體有利于轉基因植株的獲得。目前以文心蘭的莖切段、根尖和莖尖等為外植體，已成功誘導出愈傷組織并獲得了再生植株，但存在愈傷組織誘導頻率低、周期長，而且愈傷組織難以保持胚性狀態(tài)等缺點。本研究以文心蘭PLBs作為外植體進行愈傷組織誘導及其植株再生培養(yǎng)，研究影響愈傷組織增殖的因素，從而為文心蘭基因工程育種提供一個高效、穩(wěn)定的轉化受體植株再生體系。

1　材料與方法

1.1 材料

所用的外植體為文心蘭PLBs，由本實驗室從文心蘭腋芽中誘導得到后，通過繼代培養(yǎng)保存。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織誘導用解剖刀將培養(yǎng)4周左右的文心蘭PLBs分成單個，分別接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基CIM1和CIM2上，置于黑暗中培養(yǎng)1個月，培養(yǎng)溫度為 (26±2)℃。每種培養(yǎng)基接種30個外植體，實驗重復3次。

圖版 Ⅰ　文心蘭PLBs的愈傷組織誘導和植株再生　A. 用于愈傷組織誘導的文心蘭PLBs; B. PLBs于CIM1培養(yǎng)基上誘導出的愈傷組織; C. B中愈傷組織的放大圖; D. PLB于CIM2培養(yǎng)基上誘導出的愈傷組織; E. D中愈傷組織的放大圖; F. 于1/2MS+0.5 mg·L-1 TDZ+1.0 mg·L-1 2,4-D培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)28 d的愈傷組織; G. PLB誘導培養(yǎng)4周后形成白色的PLBs; H. 白色的PLBs于光下培養(yǎng)，變綠萌發(fā); I. 壯苗培養(yǎng)2個月得到可移栽的再生植株。Plate Ⅰ　Callus induction and plant regeneration from the PLBs of Oncidium ‘Gower Ramsey’　A. PLBs used for callus induction; B. Callus induction from PLBs on CIM1 medium; C. Enlarged view of the callus showed in B; D. Callus induction from PLBs on CIM2 medium; E. Enlarged view of the callus showed in D; F. Callus subcultured on 1/2MS medium supplemented with 0.5 mg·L-1 TDZ and 1.0 mg·L-1 2,4-D for 28 d; G. White PLBs produced from callus after four weeks; H. White PLBs turned green and germinated under the light; I. Healthy plants obtained after two months.

根據Jheng et al(2006)和Chen & Chang(2000)的報道，以及我們前期的預實驗，選用的愈傷組織誘導培養(yǎng)基組成分別為(1)CIM1：以NDM (Tokuhara et al，1993) 作為基本培養(yǎng)基，添加1 mg·L-16-BA、0.1 mg·L-1NAA、1 g·L-1tryptone、20 g·L-1蔗糖和3.5 g·L-1phytagel，pH 5.5；(2)CIM2：以1/2MS作為基本培養(yǎng)基，添加1 mg·L-1TDZ、3 mg·L-12,4-D、1 g·L-1tryptone、20 g·L-1蔗糖和3.5 g·L-1phytagel，pH 5.5。

1.2.2 愈傷組織繼代培養(yǎng)將CIM1上誘導出的愈傷組織轉移至新鮮的CIM1上，而將CIM2上誘導出的愈傷組織轉移至添加不同濃度 TDZ 和 2,4-D(如表1所示)的愈傷組織繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基1/2MS + 1 g·L-1tryptone + 20 g·L-1蔗糖 + 3.5 g·L-1phytagel(pH 5.5)上，每個培養(yǎng)皿中放置0.5 g 左右的愈傷組織，3個培養(yǎng)皿為一重復，置于 (26±2)℃，黑暗培養(yǎng)四周后統計實驗結果，以篩選出愈傷組織增殖較快的培養(yǎng)基。實驗重復3次。

1.2.3 PLBs的誘導與萌發(fā)愈傷組織于1.2.2篩選出的最適愈傷組織增殖培養(yǎng)基上， 每隔1個月繼代培養(yǎng)1次，取第3次繼代培養(yǎng)1個月左右的愈傷組織分成直徑約5 mm的團塊，轉移到T2培養(yǎng)基(3.5 g·L-1花寶1號 + 20 g·L-1紅薯 + 25 g·L-1香蕉 + 1 g·L-1tryptone + 20 g·L-1蔗糖 + 3.5 g·L-1phytagel，pH 5.5)上(Chan et al, 2005)，每個培養(yǎng)皿接種0.5 g 左右的愈傷組織，3個培養(yǎng)皿為一重復，置于 (26±2)℃，黑暗培養(yǎng)1個月后統計結果。實驗重復3次。將誘導出的PLBs轉移至新的T2培養(yǎng)基上，(26±2)℃，1 000～1 500 lx，每天16 h光照培養(yǎng)。

表 1　不同培養(yǎng)基組成對文心蘭愈傷組織增殖的影響

注： 同列中不同小寫字母表示差異顯著，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。愈傷組織鮮重增殖倍數為繼代培養(yǎng)28 d的愈傷組織鮮重增加量與接種時的愈傷組織鮮重的比值。

Note: Different small letters in the same column indicate significant differences, while the same letters indicate no significant difference (P>0.05). Proliferation rate of callus fresh weight means the ratio of increased callus fresh weight to initial callus fresh weight after subculture for 28 d.

1.2.4 壯苗PLBs萌發(fā)后，將小苗轉移到壯苗培養(yǎng)基上，(26±2)℃，1 000～1 500 lx，每天16 h光照培養(yǎng)。壯苗培養(yǎng)基組成為以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加20 g·L-1蔗糖、1 g·L-1活性炭和3 g·L-1phytagel， pH 5.7。

為提高受試者依從性和數據記錄的準確性，推薦使用《受試者日志》，并明確日志卡的注意事項及日志卡問題的完整說明。根據有效性評價需要，患兒和（或）其監(jiān)護人應在日志中，選擇并及時記錄以下內容：每日的SBM情況、大便性狀、排便疼痛、FI次數、憋便次數、腹痛，以及用藥、補救藥物使用和如廁訓練等情況。

1.3 統計分析

使用Excel 2007和 SPSS 19.0軟件進行數據的統計分析，平均值以平均數 ± 標準誤表示，采用鄧肯氏新復極差檢驗法(Duncan’s multiple ranger test)進行多重比較。

2　結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對文心蘭PLBs愈傷組織誘導的影響

分別于兩種培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)1個月后，100% 的PLBs誘導出愈傷組織(圖版Ⅰ：B，D)，但不同培養(yǎng)基組成所誘導出的愈傷組織狀態(tài)有差異。在NDM + 1 mg·L-16-BA + 0.1 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上，PLBs誘導出淡綠色的、較致密的愈傷組織，質地偏硬(圖版Ⅰ：C)；而在1/2MS + 1 mg·L-1TDZ + 3 mg·L-12,4-D培養(yǎng)基上，PLBs誘導出乳白色的、較疏松的愈傷組織，質地較軟(圖版Ⅰ：E)。

2.2 不同培養(yǎng)基對文心蘭愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響

將誘導出的愈傷組織分別轉移到相同組成的新鮮培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，結果發(fā)現愈傷組織在1/2 MS + 1 mg·L-1TDZ + 3 mg·L-12,4-D培養(yǎng)基上幾乎不增殖，而在NDM + 1 mg·L-16-BA + 0.1 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上增殖迅速，黑暗培養(yǎng)28 d愈傷組織鮮重增加了7.26倍。在NDM + 1 mg·L-16-BA + 0.1 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上的愈傷組織生長雖然比較快，但其比較致密、質地偏硬，不能進一步誘導出PLBs從而獲得再生植株。因此，我們重點研究以1/2MS為基本培養(yǎng)基時，TDZ和2,4-D的不同濃度配比對愈傷組織增殖的影響。

結果如表1所示，以1/2MS為基本培養(yǎng)基時，在2,4-D濃度為0.5～2.0 mg·L-1范圍內，愈傷組織增殖主要受TDZ濃度的影響。當培養(yǎng)基中的TDZ濃度從1.0 mg·L-1降低到0.5 mg·L-1，愈傷組織鮮重增殖倍數顯著增加(由最低的4.50倍增加到最高的6.04倍)；而保持培養(yǎng)基中的TDZ濃度不變，在一定范圍內添加不同濃度的2,4-D，愈傷組織鮮重增殖倍數并沒有顯著變化。

2.3 文心蘭愈傷組織誘導PLBs及PLBs萌發(fā)的結果

愈傷組織于T2培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)三周后，肉眼可見其表面形成白色的PLBs(圖版Ⅰ：G)。誘導培養(yǎng)1個月后統計發(fā)現每克鮮重的愈傷組織約誘導出(1 328.67 ± 198.58)個PLBs。

移至光下培養(yǎng)，培養(yǎng)物逐漸變綠，1個月后可看到PLBs萌發(fā)(圖版Ⅰ：H)。萌發(fā)率為(90.12 ± 3.65)%。

2.4 文心蘭壯苗培養(yǎng)的結果

將PLBs萌發(fā)后得到的小植株轉移到壯苗培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)約2個月，得到可以移栽網室的健壯再生植株(圖版Ⅰ：I)。成苗率達到100%。

3　討論與結論

基因工程育種是培育新品種的有效手段之一，文心蘭轉基因研究中幾乎都是以PLBs作為轉化受體，由于顆粒較大的PLBs是一個分化程度較高的個體，因此以其作為轉化受體材料很容易獲得嵌合體，使轉化效率普遍較低(崔廣榮，2010；Lee et al，2015)。由愈傷組織誘導形成PLBs多為單細胞起源(Jheng et al，2006)，以愈傷組織為轉化受體，對于提高轉化效率和獲得穩(wěn)定遺傳目的基因的純合子非常有利。因此，不少研究者致力于建立文心蘭的愈傷組織誘導及其植株再生體系，雖有成功的報道，但一直未能應用到文心蘭的基因轉化中，究其原因主要是愈傷組織誘導頻率低、獲得再生能力所需時間較長且狀態(tài)難以維持。

以文心蘭的莖切段(Chen & Chang，2000)、根尖(Wu et al，2004)、莖尖(Jheng et al，2006)和葉(Chen & Chang，2000)為外植體，均可誘導出愈傷組織，其中根尖較葉片、莖段愈傷組織誘導頻率高，最高也只達到25%。其誘導出的綠色、較致密的愈傷組織需要在降低2,4-D和TDZ濃度的培養(yǎng)基上繼代3次以上才可得到具有再生能力的乳白色、較疏松的愈傷組織。而本試驗以PLBs為外植體的愈傷組織誘導頻率為100%，在添加了1 mg·L-1TDZ和3 mg·L-12,4-D的 1/2MS培養(yǎng)基上可誘導出乳白色、較疏松的愈傷組織。另外，已有研究發(fā)現愈傷組織在繼代培養(yǎng)中容易分化出PLBs或芽，而且容易出現褐化死亡現象，這對愈傷組織的大量增殖非常不利，更是阻礙了在文心蘭轉基因操作中的應用。本試驗中愈傷組織繼代培養(yǎng)階段并未觀察到褐化現象，也無PLBs或芽的分化，而降低TDZ濃度有利于愈傷組織增殖。

已有報道表明，文心蘭愈傷組織再生時需要添加植物生長調節(jié)物質，細胞分裂素和生長素的種類及濃度配比大大影響愈傷組織的再生頻率(Wu et al，2004；Jheng et al，2006)。來源于PLBs的愈傷組織在不含有植物生長調節(jié)物質而添加了20 g·L-1紅薯和25 g·L-1香蕉的培養(yǎng)基中，即可重新誘導出PLBs。由此可見，培養(yǎng)材料來源不同，即使是相同的培養(yǎng)目標，培養(yǎng)基的成分也有很大差異。

總而言之，本研究成功建立了一個高效的文心蘭愈傷組織誘導及其植株再生體系，可望應用于文心蘭的基因工程育種。

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Callus induction and plant regeneration ofOncidium‘Gower Ramsey’ by means of protocorm-like body culture

HUANG Xia*, LU Yu

(GuangdongKeyLaboratoryofPlantResources,SchoolofLifeSciences,SunYat-senUniversity, Guangzhou 510275, China )

Oncidium‘Gower Ramsey’ is a species of orchid with high ornamental value and strong market competitiveness. Gene engineering breeding technology provides an effective way for the genetic improvement of ornamental plants. And callus is an ideal transformation receptor. Up to now, callus induction and plant regeneration ofOnciudiumhave been successfully achieved using stem segment, root tip and shoot tip. But there are some shortcomings for theseinvitroregeneration systems, such as low frequency and long period of callus induction, difficulty in maintaining embryogenic state of callus, etc. In this research, for the first time protocorm-like bodies ofOncidium‘Gower Ramsey’ were used as explants for callus induction and plant regeneration. The effects of different concentrations and combinations of TDZ and 2,4-D on callus proliferation were investigated. The results showed that 1/2MS medium supplemented with 1 mg·L-1TDZ and 3 mg·L-12,4-D could promote the induction of whitish and friable callus, the induction rate was 100%. The proliferation rate of callus was mainly affected by the concentration of TDZ, while the callus subculture medium consisted of TDZ in combination with 2,4-D at the concentrations of 0.5 to 2.0 mg ·L-1. When the concentration of TDZ decreased from 1.0 to 0.5 mg·L-1, proliferation rate of the callus fresh weigh increased significantly. And the optimal medium for callus proliferation contained 1/2MS basal medium, 0.5 mg·L-1TDZ and 1.0 mg·L-12,4-D. After four weeks of subculture in the dark, the highest proliferation rate of the callus fresh weigh, which was 6.04 folds, appeared on the optimal medium, while the lowest proliferation rate of the callus fresh weigh, which was 4.50 folds, appeared on the medium containing 1/2MS basal medium, 1.0 mg·L-1TDZ and 2.0 mg·L-12,4-D. The callus subcultured on the optimal proliferation medium for about one month were transferred to T2 medium (3.5 g·L-1Hyponex 1 + 20 g·L-1sweet potato + 25 g·L-1banana + 1 g·L-1tryptone + 20 g·L-1sucrose + 3.5 g·L-1phytagel) and cultured in the dark for PLBs induction. Approximately, 1 328.67 protocorm-like bodies could be generated in one month from an initial culture of 1 g callus fresh weight. Subsequently, the cultures transferred onto the fresh T2 medium. The germination rate of protocorm-like bodies was as high as 90.12% after one month of culture under the light. When transplanted on 1/2MS medium supplemented with 1 g·L-1active carbon, all shoots became healthy plants after two months. In this study, the callus induction and plant regeneration system ofOncidium‘Gower Ramsey’ with high frequency was successfully developed to provide an efficient and stable transformation receptor system for the genetic transformation ofOncidium.

Oncidium‘Gower Ramsey’, tissue culture, callus proliferation, TDZ, redifferentiation

10.11931/guihaia.gxzw201501038

2015-01-28

2015-08-07

國家“十二五”科技支撐計劃項目(2013BAD01B0702)[Supported by the National Key Technology R & D Program during the Twelfth Five-year Plan Period (2013BAD01B0702)]。

黃霞(1974- )，女，廣東廉江市人，博士，副教授，研究方向為植物生理與分子生物學，(E-mail)huangxia@mail.sysu.edu.cn。

Q945

A

1000-3142(2016)09-1082-05

黃霞， 盧禹. 文心蘭類原球莖的愈傷組織誘導及其植株再生 [J]. 廣西植物， 2016， 36(9):1082-1086

HUANG X, LU Y. Callus induction and plant regeneration ofOncidium‘Gower Ramsey’ by means of protocorm-like body culture [J]. Guihaia， 2016， 36(9):1082-1086