李慧麗， 韓興杰， 廖　亮， 徐玲玲*

( 1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與藝術(shù)學(xué)院， 南昌 330045； 2． 九江學(xué)院 藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 江西 九江 332000 )

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三葉木通光敏色素A基因的序列及表達(dá)分析

李慧麗1,2， 韓興杰2， 廖亮2， 徐玲玲2*

( 1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與藝術(shù)學(xué)院， 南昌 330045； 2． 九江學(xué)院 藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 江西 九江 332000 )

光敏色素(phytochrome，簡稱PHY)是植物體內(nèi)最重要的光受體，參與調(diào)節(jié)植物種子萌發(fā)、幼苗生長、莖的伸長、子葉伸展直至開花控制等許多生理過程。該研究通過RT-PCR方法首次從三葉木通(Akebiatrifoliata)中獲得了編碼光敏色素A的cDNA序列(命名為AktrPHYA1，GenBank登錄號為KP864055)。結(jié)果表明：該序列由3 496 bp組成，包含一個(gè)3 426 bp的完整開放閱讀框，編碼1 141個(gè)氨基酸。AktrPHYA1編碼的蛋白N端為光感受區(qū)域，包括一個(gè)GAF結(jié)構(gòu)域、一個(gè)PHY結(jié)構(gòu)域；C端為光調(diào)節(jié)區(qū)域，C端包括兩個(gè)PAS結(jié)構(gòu)域、一個(gè)組氨酸激酶A結(jié)構(gòu)域和一個(gè)類似組氨酸激酶的ATP激酶結(jié)構(gòu)。同源蛋白比對顯示，AktrPHYA1與耬斗菜、荷花的同源蛋白序列一致性分別為83%和82%。遺傳進(jìn)化樹分析表明，單子葉植物和雙子葉植物的光敏色素A基因分別聚為兩支；在雙子葉植物中，AktrPHYA1與耬斗菜、荷花PHYA聚在一起，說明三葉木通與耬斗菜、荷花遺傳關(guān)系較近。AktrPHYA1在三葉木通莖、葉片、雄花、雌花、種子中均有表達(dá)，且在種子中表達(dá)最強(qiáng)，在葉片中表達(dá)量最低。AktrPHYA1的組織表達(dá)譜暗示了其在植物中可能的功能。該研究結(jié)果為三葉木通光敏色素A基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

三葉木通, 光敏色素A, 序列分析, 表達(dá)分析

光是植物生長發(fā)育的一個(gè)重要環(huán)境因子，它不僅影響植物的光合作用，而且還作為信號分子調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。植物對光信號的接受和轉(zhuǎn)導(dǎo)依靠不同的光受體完成，目前已知的光受體有光敏色素(phytochrome)、隱花色素(cryptochrome)、向光蛋白(photochopin)和UV-B(光受體)(Lin & Todo, 2005；Rockwell et al, 2006)。光敏色素是植物體內(nèi)最重要的光受體，參與調(diào)節(jié)植物種子萌發(fā)、幼苗生長、莖的伸長、子葉伸展直至開花控制等許多生理過程(Weller et al, 2015；Kircher , 2011)。

被子植物中光敏色素基因是以多基因家族形式存在的(Clack et al, 1994；Sharrock & Clack, 2002；Abdurakhmonov et al, 2010)，按照光敏色素穩(wěn)定性可以分為兩類：一為光不穩(wěn)定型，主要是PHYA；另一類為光穩(wěn)定型，主要是PHYB-PHYE。自從1989年擬南芥PHYA全長cDNA序列被克隆以來(Sharrock & Quail, 1989)，陸續(xù)得到了各種植物PHYA的全長cDNA序列，包括苜蓿(楊玲玲等, 2008)、玉米(馬燕斌等, 2010a)、小麥(馬燕斌, 2010b)等。過量表達(dá)煙草PHYA基因的煙草葉面積明顯增大(Robson et al, 1996)，在葉部特異表達(dá)擬南芥PHYA基因的轉(zhuǎn)基因水稻穗變大，產(chǎn)量增加(Kong et al, 2004；Ajay et al, 2006)，將水稻PHYA轉(zhuǎn)入擬南芥，結(jié)果表明PHYA促進(jìn)種子萌發(fā)、抑制下胚軸伸長、促進(jìn)花期提前，轉(zhuǎn)基因的白化苗中葉綠素含量提高(陳春峰, 2011)。因而對光敏色素基因的研究具有重要意義。

三葉木通(Akebiatrifoliata)是木通科木通屬的一種野生藤本植物，廣泛分布于中國20多個(gè)省市。其莖藤、果實(shí)均可入藥，果實(shí)中富含蛋白質(zhì)、氨基酸、可溶性糖、維生素、有機(jī)酸及多種礦質(zhì)元素(張寧, 2010；仲偉敏等, 2015)，三葉木通籽含有油酸、亞油酸、棕櫚酸等不飽和脂肪酸(孫翔宇等, 2012)。因此，三葉木通可作為藥食兼用的寶貴資源。本研究獲得了三葉木通光敏色素PHYA的cDNA序列并對其編碼的蛋白序列和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究其功能奠定了的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

取新鮮的三葉木通(Akebiatrifoliata)莖、葉片、雄花、雌花、種子等組織材料，液氮速凍后于-80 ℃冰箱儲存。

1.2 方法

1.2.1 三葉木通總RNA的提取不同組織材料于液氮中充分研磨至粉末，總RNA的提取采用CTAB法(劉洋等，2006)。

1.2.2 三葉木通 cDNA的獲得以三葉木通總RNA為模板，使用RevertAid逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(#K1621，F(xiàn)ermentas)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA第一鏈。

1.2.3三葉木通PHYA1的擴(kuò)增和序列測定以cDNA為模板，用一對引物(F：5′-TTCGAGTTTGTTCTGTGTGGTTTTATAGAGATT-3′，R：5′-ACATAACAAAACCAACCAAAGATTGCTACG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系10 μL，其中包括1 × LA Taq Buffer，0.4 mmol·L-1dNTP Mixture，上、下游引物各0.2 mmol·L-1，0.4 μL LA Taq DNA聚合酶，0.2 μL cDNA模板。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測，產(chǎn)物回收使用SanPrep柱式DNA膠回試劑盒(上海生工)，序列測序由上海生工完成。

1.2.4 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建通過Geneious 4.8.2軟件對測序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，將cDNA序列及其編碼的蛋白序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的其它物種同源序列進(jìn)行BLAST比對分析。蛋白序列比對使用DNAMAN 6.0軟件；系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建使用MEGA 5.2軟件的最小進(jìn)化法，并進(jìn)行Bootstrap檢測(抽樣次數(shù)為1 000)。

1.2.5 基因表達(dá)分析逆轉(zhuǎn)錄使用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒(RR047，寶生物公司)，PCR使用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒(RR820A，寶生物公司)。18S rRNA引物為F：CGGCTACCACATCCAAGGAA，R：TGTCACTACCTCCC-CGTGTCA；AktrPHYA1引物為F：TTGGAAGGATTATGAGATGGA，R：AGTGAATGACAGACGAGTT。Real-time PCR使用Eppendorf Realplex2進(jìn)行，結(jié)果采用2-Δ(ΔCt)方法進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1 三葉木通PHYA1基因cDNA擴(kuò)增

通過RT-PCR方法獲得了片段長度為3 496 bp的cDNA序列(圖1),包括3 426 bp的完整開放閱讀框(ORF)，編碼1 141個(gè)氨基酸(圖2)。該片段與擬南芥(Arabidopsisthaliana)、荷花(Nelumbonucifera)、葡萄(Vitisvinifera)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、龍眼(Dimocarpuslongan)、耬斗菜(Aquilegiaformosa)等物種中的PHYA基因序列相似性為73%～99%；其編碼的氨基酸序列與荷花、耬斗菜、葡萄、龍眼、辣根(Armoraciarusticana)、百脈根(Lotusjaponicas)、擬南芥等的PHYA蛋白的序列相似性為75%～83%，由此可見獲得的該序列為三葉木通的PHYA基因，命名為AktrPHYA1，GenBank登錄號為kp864055。

圖 1　三葉木通PHYA1基因RT-PCR擴(kuò)增電泳圖Fig. 1　Agarose gel electrophoresis of AktrPHYA1 cDNA by RT-PCR

2.2 氨基酸序列比對及結(jié)構(gòu)分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，AktrPHYA1氨基序列包括一個(gè)GAF結(jié)構(gòu)域(氨基酸位置為Ser219-Leu402)、一個(gè)PHY結(jié)構(gòu)域(Val413-Asp589)、兩個(gè)PAS結(jié)構(gòu)域(Arg629-Met735和Leu762-Gln873)、一個(gè)組氨酸激酶A結(jié)構(gòu)域(His Kinase A Domain)(Leu900-Asp950)和一個(gè)類似組氨酸激酶ATP激酶結(jié)構(gòu)域(Histidine kinase-like ATPase)(Leu1012-Val1115)(圖3)。與NCBI數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行比對，AktrPHYA1氨基酸序列與擬南芥、荷花、可可樹(Theobromacacao)、馬鈴薯、龍眼、耬斗菜、大葉楊(Populustrichocarpa)、百脈根的同源蛋白具有77%～83%的序列一致性(圖4)。

2.3 PHYA蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析

利用AktrPHYA1氨基酸序列與其它物種PHYA同源蛋白建立系統(tǒng)發(fā)育樹，可見單子葉植物與雙子葉植物的光敏色素A分別聚為兩類(圖5)。在雙子葉植物中，AktrPHYA1與耬斗菜、荷花的PHYA聚為一支，同源性較高(序列一致性分別為83%和82%)；其它物種聚為一支。在單子葉禾本科植物中，高粱(Sorghumbicolor)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)與小麥(Tritiumaestivum)的PHYAs聚為一支(圖5)。

2.4 三葉木通PHYA1的表達(dá)分析

以18S rRNA為內(nèi)參基因，對三葉木通PHYA1在不同組織的表達(dá)進(jìn)行檢測。三葉木通PHYA1在種子、葉片、莖、雄花和雌花中均有表達(dá)。其在葉片中表達(dá)最弱，在種子中表達(dá)水平最高，為葉片中的280倍，在莖、雄花和雌花中的表達(dá)水平分別是葉片中的4.7倍、23倍和5.8倍(圖6)。

3　討論

通過RT-PCR首次從三葉木通中獲得了編碼光敏色素A的cDNA序列,AktrPHYA1結(jié)構(gòu)N-端包括一個(gè)GAF結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PHY結(jié)構(gòu)域，GAF結(jié)構(gòu)域在各種光轉(zhuǎn)化蛋白之間相對保守，突變研究表明GAF結(jié)構(gòu)域?qū)χ参锔惺芄庑盘柶鹬浅Ｖ匾淖饔?Su et al, 2007)，它與PHY結(jié)構(gòu)域共同承擔(dān)結(jié)合發(fā)色團(tuán)、光吸收以及光誘導(dǎo)的可逆性轉(zhuǎn)化的功能(Clough et al, 1999)；PHY結(jié)構(gòu)域非常保守，對調(diào)節(jié)光激素的活性和Pfr構(gòu)型的穩(wěn)定性十分重要(Rockwell et al, 2006)。C-端包括兩個(gè)PAS結(jié)構(gòu)域、一個(gè)組氨酸激酶A結(jié)構(gòu)域和一個(gè)類似組氨酸激酶的ATP激酶結(jié)構(gòu)，光敏色素為細(xì)胞質(zhì)蛋白，主要定位于細(xì)胞核外，光敏色素入核過程是其調(diào)節(jié)光信號的關(guān)鍵步驟， PAS結(jié)構(gòu)域?qū)τ赑HYA進(jìn)入到細(xì)胞核中起重要作用(Gu et al, 2000)。

圖 2　三葉木通PHYA1的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 2　Sequence of AktrPHYA1 cDNA and the deduced protein sequence

圖 4　三葉木通PHYA1與其它植物PHYA蛋白的多序列比對　序列來源： ACV87353.1(耬斗菜)，XP_010247866.1(荷花)，XP_002278610.1(葡萄)。 Fig. 4　Multiple alignment of AktrPHYA1 with PHYAs from other species　Sequences are as follows: ACV87353.1 (Aquileqia formosa), XP_010247866.1 (Nelumbo nucifera), XP_002278610.1 (Vitis vinifera).

圖 5　三葉木通PHYA1與其它物種PHYA同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5　Phylogenetic tree constructed with AktrPHYA1 and homologs from other species

圖 6　三葉木通PHYA1在不同組織中的表達(dá)Fig. 6　Expression levels of AktrPHYA1 in different tissues

三葉木通PHYA1氨基酸序列與耬斗菜、荷花的光敏色素A比對顯示,這些結(jié)構(gòu)域中都具有明顯相對保守的氨基酸序列，說明光敏色素A作為植物最初的光受體，在三葉木通中存在的PHYA1可能具有與耬斗菜、荷花光敏色素A類似的光信號傳導(dǎo)功能。在AktrPHYA1與其它物種的光敏色素A同源蛋白系統(tǒng)樹中，雙子葉植物與單子葉植物各聚為一支，這可能是雙子葉植物與單子葉植物長期不同進(jìn)化方向造成的差異。通過比較被子植物和裸子植物的光敏色素基因發(fā)現(xiàn)，隨著開花植物的進(jìn)化，PHYA基因家族的復(fù)雜程度和規(guī)模均有所增加(Alba et al,2000)。PHYA家族的復(fù)雜程度和規(guī)模在不同開花植物中明顯不同，同一光敏色素分子的不同區(qū)段間進(jìn)化速率也不盡相同(Mathews & Sharrock,1996)。C-端進(jìn)化速率是N-端的2倍(Alba et al,2000)。雙子葉植物中同屬木蘭亞綱多心皮類植物的三葉木通、耬斗菜和荷花聚為一支，分類地位獨(dú)特，與植物形態(tài)建立的系統(tǒng)結(jié)果一致。

Real-time PCR對三葉木通PHYA1在不同組織中的表達(dá)分析表明，AktrPHYA1在莖、葉、雄花、雌花和種子中均有表達(dá)但表達(dá)水平有明顯差異，說明AktrPHYA1的表達(dá)積累量具有組織特異性。種胚中的光敏色素是種子成熟過程中和種子吸水后幾小時(shí)內(nèi)合成的(楊期和等, 2003)，是植物光形態(tài)建成的受體。一些植物種子萌發(fā)受到PHYA的調(diào)控(Heschel et al, 2008 ；Miguel & Sánchez, 1992)，PHYA吸收遠(yuǎn)紅光，可通過提高種胚的生長能力、降低滲透勢和增加細(xì)胞壁的伸長性來促進(jìn)種子的萌發(fā)(Miguel & Sánchez, 1992；Simonovic et al, 2000)。AktrPHYA1在種子中表達(dá)最強(qiáng)，說明其對于三葉木通種子發(fā)育可能起著非常關(guān)鍵的作用。過量表達(dá)煙草PHYA基因的煙草葉面積明顯增大(Robson et al, 1996)，在葉部特異表達(dá)擬南芥PHYA基因的轉(zhuǎn)基因水稻穗變大，產(chǎn)量增加(Kong et al, 2004；Ajay et al, 2006)。將擬南芥PHYA轉(zhuǎn)入地被菊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)露天栽培條件下，轉(zhuǎn)基因株系花期明顯提前，株型則明顯矮化(惠婕等, 2011)。AktrPHYA1在葉片、莖、雄花、雌花中都有表達(dá)，說明AktrPHYA1還可能參與植物的葉片發(fā)育、莖的伸長和開花調(diào)控過程。

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Sequence and expression analysis of phytochrome A fromAkebiatrifoliata

LI Hui-Li1,2, HAN Xing-Jie2, LIAO Liang2, XU Ling-Ling2*

( 1.CollegeofLandscapeandArt,JiangxiAgriculturalUniversity, Nanchang 330045, China;2.SchoolofPharmacyandLifeSciences,JiujiangUniversity, Jiujiang 33200, China )

Phytochrome (PHY) is one of the most important light receptors in plants. It is involved in many physiological processes such as the regulation of seed germination, seedling growth, stem elongation, cotyledon extension, and flowering control. In this study, a cDNA encoding PHYA was firstly amplified fromAkebiatrifoliataby using the RT-PCR technique (designated asAktrPHYA1, GenBank accession number: KP864055), which consists of 3 496 bp, with a 3 426-bp open reading frame (ORF) encoding a 1 141-amino-acid protein. The N-terminal of AktrPHYA1 is dedicates for light acceptation and contains a GAF domain and a phytochrome domain. The C-terminal is a light-regulated region, and is comprised of two PAS domains, a His Kinase A domain and a Histidine kinase-like ATPase domain. The homology protein alignment showed that theAktrPHYA1 shared 83% and 82% identities with thePHYAs fromNelumbonuciferaandAquileqiaformosa, respectively. Phylogenetic tree analysis indicated that monocots and dicots gathered into two branches. In the dicots,Akebiatrifoliate,NelumbonuciferaandAquileqiaformosaclustered together, indicating they are closely genetically related. Expression analysis indicated thatAktrPHYA1 was detected in all tissues under investigation, including leaves, stems, male and female flowers and seeds. It was the most strongly expressed in seeds, whereas the most weakly in leaves. The expression pattern implied the likely roles ofAktrPHYA1 inAkebiatrifoliata. This work will provide information for further research of its functions in plants.

Akebiatrifoliata, phytochrome A, sequence analysis, expression analysis

10.11931/guihaia.gxzw201503003

2015-03-03

2015-06-11

國家自然科學(xué)基金(31460073)；江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目(20142BBF60055，20143ACF60010)[Supported by the National Natural Science Foundation of China (31460073)； Scientific and Technological Planning Project of Jiangxi Province (20142BBF60055，20143ACF60010)]。

李慧麗(1986-)，女，山西長治人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)，(E-mail) 462053080@qq.com。

徐玲玲，女，碩士，教授，研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)，(E-mail) 13907021710@163.com。

Q949

A

1000-3142(2016)09-1061-07

李慧麗， 韓興杰， 廖亮， 等. 三葉木通光敏色素A基因的序列及表達(dá)分析 [J]. 廣西植物， 2016， 36(9):1061-1067

LI HL, HAN XJ, LIAO L，et al. Sequence and expression analysis of phytochrome A fromAkebiatrifoliata[J]. Guihaia，2016， 36(9):1061-1067