張智瑞， 孫小錦， 崇殿龍， 周 燦， 任 凱， 劉 浩

(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，蚌埠 233030；*通訊作者，E-mail: liuhao6886@foxmail.com)

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Caspases抑制條件下5-FU誘導(dǎo)乳腺癌細胞發(fā)生壞死性凋亡的作用

張智瑞， 孫小錦， 崇殿龍， 周 燦， 任 凱， 劉 浩

(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，蚌埠 233030；*通訊作者，E-mail: liuhao6886@foxmail.com)

目的 探討5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)對乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的抑制作用，并在抑制caspases的條件下，對5-FU誘導(dǎo)的乳腺癌細胞的死亡形式進行探討。 方法 MTT法檢測不同濃度的5-FU(0，4，8，16，24，32 μmol/L)對乳腺癌細胞增殖的抑制作用，篩選適宜的藥物濃度。在適宜藥物濃度下實驗分為對照組、z-VAD-fmk組、5-FU組、5-FU+z-VAD-fmk組，MTT法檢測乳腺癌細胞存活率；PI單染流式細胞術(shù)檢測乳腺癌細胞的死亡率；DAPI染色檢測乳腺癌細胞核的變化；透射電鏡觀察乳腺癌細胞的死亡形式；Western blot檢測壞死性凋亡蛋白RIP1表達的變化。 結(jié)果 8 μmol/L為5-FU的適宜濃度，該濃度下MDA-MB-231細胞在24 h,48 h,72 h的存活率分別為(68.94±1.17)%,(48.76±1.47)%和(44.15±2.41)%。 MTT、PI、DAPI實驗結(jié)果表明與對照組和5-FU組相比，5-FU+z-VAD-fmk組細胞存活率明顯降低(P<0.05)，細胞核濃染加深，核固縮現(xiàn)象顯著。電鏡結(jié)果顯示5-FU組細胞發(fā)生凋亡，5-FU+z-VAD-fmk組細胞發(fā)生壞死性凋亡。Western blot結(jié)果表明：z-VAD-fmk聯(lián)用時5-FU明顯上調(diào)RIP1蛋白的表達。 結(jié)論 5-FU可以誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞發(fā)生凋亡； caspases抑制條件下5-FU通過激活RIP1誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞發(fā)生壞死性凋亡。

乳腺癌； 5-氟尿嘧啶； z-VAD-fmk； 凋亡； caspases； 壞死性凋亡

乳腺癌是女性高發(fā)的惡性腫瘤，中國的乳腺癌發(fā)病率增長速度是全球的兩倍多[1]，目前的治療手段仍以手術(shù)或放化療為主，其發(fā)生腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后情況差。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)作為經(jīng)典的抗代謝藥物，對胃癌、腸癌、乳腺癌、食管癌、肝癌和胰腺癌治療效果較好[2]。5-FU可通過線粒體途徑啟動一系列不同的凋亡相關(guān)蛋白參與調(diào)控凋亡過程[3]，或是產(chǎn)生過量的活性氧自由基促進細胞凋亡的發(fā)生[4]。大多數(shù)抗腫瘤藥物抑制腫瘤細胞的增殖都是通過促進細胞發(fā)生凋亡來實現(xiàn)的。以凋亡耐受及藥物轉(zhuǎn)運蛋白的高表達為特征的腫瘤多藥耐藥的出現(xiàn)，使凋亡誘導(dǎo)劑及相關(guān)藥物在臨床中的應(yīng)用受到限制。傳統(tǒng)的細胞死亡形式分為壞死和凋亡，后者又稱為程序性死亡，在最新研究中，壞死性凋亡作為一種新的非caspases依賴的程序性死亡形式被發(fā)現(xiàn)，對腫瘤耐藥細胞的研究證實，壞死性凋亡誘導(dǎo)劑在規(guī)避腫瘤多藥耐藥方面具有“廣譜性”[5,6]。本研究旨在觀察5-FU對乳腺癌細胞株MDA-MB-231的抑制作用，并對caspases抑制條件下5-FU作用后細胞的死亡形式進行分析探討，為5-FU類藥物的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

5-FU購于上海麥克林生化科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品；MTT、PI購于美國Sigma公司；DAPI購于碧云天生物技術(shù)公司；z-VAD-fmk購于美國Calbiochem公司； RIP1抗體購于美國Santa Cruz Biotechnology公司； DMSO、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG與β-actin抗體購于合肥BioSharp公司；ECL發(fā)光試劑盒購于美國Millipore公司。

1.2 細胞株及細胞培養(yǎng)

人乳腺癌MDA-MB-231細胞株購于中國科學(xué)院上海細胞庫，由蚌埠醫(yī)學(xué)院生化藥理研究室保存。 MDA-MB-231細胞使用含有10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于 37 ℃、含5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測細胞的存活率

將處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞按7×103/孔接種于96孔板中，每孔100 μl。在培養(yǎng)箱中放置生長24 h，棄去培養(yǎng)液，加入100 μl不同濃度的5-FU(0，4，8，16，24，32 μmol/L)進行處理，每組3個復(fù)孔。藥物分別作用24，48，72 h，每孔分別避光加入15 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，緩慢吸去上清，每孔加入150 μl DMSO，37 ℃烘箱孵育30 min，酶標(biāo)儀在波長490 nm處測吸光度值。Pan-caspases抑制劑z-VAD-fmk與藥物合用時，預(yù)先使用20 μmol/L z-VAD-fmk作用于細胞1 h，棄去上清，將5-FU與其合用加入96孔板中，再進行如上檢測。

1.4 PI單染流式細胞術(shù)檢測細胞死亡率

MDA-MB-231細胞以1.2×105/孔接種到12孔板中，當(dāng)細胞匯合率達80%時， 每孔分別加入5-FU、z-VAD-fmk、5-FU+z-VAD-fmk后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞，加入預(yù)冷的75%乙醇固定，-20 ℃過夜。檢測之前用預(yù)冷的PBS重懸2次，加入600 μl PI檢測液，4 ℃避光孵育2 h，用流式細胞儀進行檢測。

1.5 DAPI染色檢測細胞核的變化

將MDA-MB-231細胞以1.2×105/孔接種于12孔板培養(yǎng)24 h，分組給藥，藥物處理24 h，用4%多聚甲醛進行固定，PBS洗滌3次，每孔加入600 μl DAPI染色液避光反應(yīng)15 min，通過熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)學(xué)變化。

1.6 透射電鏡實驗觀察細胞死亡形式

細胞分別在5-FU、5-FU+z-VAD-fmk作用下培養(yǎng)24 h，用巴氏吸管緩慢收集細胞，置于2.5%戊二醛中固定，乙醇脫水，LR White樹脂進行滲透包埋，切片，檸檬酸鉛與醋酸鈾雙染色，透射電子顯微鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.7 Western blot檢測凋亡蛋白與壞死性凋亡蛋白的表達

培養(yǎng)細胞于60 mm培養(yǎng)皿中，藥物作用24 h，收集細胞，加入適量預(yù)冷的RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃低溫離心機中12 000 r/min離心30 min，提取蛋白，使用BCA蛋白定量法測各組的蛋白濃度。每組取40 μg蛋白，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜；使用5%脫脂牛奶封閉2 h，TPBS洗膜3次，每次10 min；加一抗室溫孵育4 h，TPBS洗膜3次；加二抗孵育2 h；TPBS洗膜3次，ECL發(fā)光試劑盒暗室發(fā)光顯影，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，并使用Image J軟件進行灰度值掃描。1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 5-FU對MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用

MTT結(jié)果表明，隨著5-FU濃度的增加、作用時間的延長，MDA-MB-231細胞的存活率明顯降低(見圖1)。8 μmol/L濃度時，24,48和72 h細胞的存活率分別為(68.94±1.17)%，(48.76±1.47)%和(44.15±2.41)%，實驗中將8 μmol/L作為后續(xù)實驗所使用的濃度。

2.2 caspases抑制條件下5-FU對MDA-MB-231細胞增殖的影響

結(jié)果顯示，與對照組相比，5-FU組細胞存活率[(63.28±3.14)%]明顯下降；與5-FU組相比，5-FU+z-VAD-fmk組細胞存活率為(51.13±2.65)%(見圖2)，對細胞增殖抑制作用進一步加強。即在caspases抑制條件下，5-FU對MDA-MB-231的增殖抑制作用增強。

圖1 5-FU對MDA-MB-231細胞存活率的變化Figure 1 Changes of the viability of MDA-MB-231 cells after treated with 5-FU for different time

2.3 PI單染實驗檢測細胞的死亡率

PI染色結(jié)果顯示，對照組細胞死亡率為(3.93±0.45)%；與對照組相比，5-FU組細胞的死亡率[(35.8±2.27)%]明顯增加；與5-FU組相比，5-FU+z-VAD-fmk組細胞死亡率[(44.3±1.45)%]進一步增加。即當(dāng)使用caspases抑制劑z-VAD-fmk時，5-FU誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞死亡率明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 Caspases抑制條件下，5-FU對MDA-MB-231的增殖抑制作用Figure 2 Effects of 5-FU on MDA-MB-231 cells under the condition of caspases inhibition

2.4 DAPI實驗觀察MDA-MB-231細胞核的變化

細胞進行DAPI染色熒光顯微鏡結(jié)果顯示，對照組與z-VAD-fmk組的細胞核呈淺藍色，均勻淡染；與對照組相比，5-FU組胞核濃染，出現(xiàn)了核碎裂；與5-FU組相比，5-FU+z-VAD-fmk組細胞核濃染加深，核碎裂現(xiàn)象加劇(見圖4)。

圖3 PI單染法檢測5-FU和z-VAD-fmk以及兩者聯(lián)用24 h時MDA-MB-231細胞的死亡率Figure 3 Analysis of the cell death rate of MDA-MB-231 cells after treated with 5-FU,z-VAD-fmk and their combination for 24 h by PI staining

圖4 DAPI染色檢測5-FU和z-VAD-fmk單獨及聯(lián)合使用時對MDA-MB-231細胞核的影響Figure 4 Changes of MDA-MB-231 cell nuclei after treated with 5-FU,z-VAD-fmk and their combination by DAPI staining

2.5 MDA-MB-231細胞超微結(jié)構(gòu)的改變

電鏡結(jié)果表明，與對照組相比，5-FU作用后的細胞的超微結(jié)構(gòu)明顯改變，細胞皺縮，染色質(zhì)邊聚，線粒體有正常的超微結(jié)構(gòu)，呈典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化(見圖5)。而5-FU和z-VAD-fmk聯(lián)用組的電鏡結(jié)果顯示，細胞破裂，線粒體腫脹、細胞內(nèi)容物外泄，呈典型的壞死性凋亡形態(tài)學(xué)變化(見圖5)。

圖5 單用5-FU 及與 z-VAD-fmk合用24 h細胞超微結(jié)構(gòu)的變化Figure 5 Changes of the ultrastructure of the cells after treated with 5-FU and its combination with z-VAD-fmk for 24 h

2.6 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達

RIP1是壞死性凋亡通路的關(guān)鍵蛋白，Western blot結(jié)果顯示，單獨使用 5-FU 組和z-VAD-fmk組均不能激活RIP1蛋白的表達，而5-FU+z-VAD-fmk 組RIP1蛋白表達明顯增加(P≤0.05,見圖6)，由單用時的1.31±0.05增加至3.95±0.20。

3 討論

5-氟尿嘧啶(5-FU)是常用的影響核酸合成的抗癌藥物，能影響DNA的合成，對細胞具有抑制作用，用于多種腫瘤的治療[7，8]。5-FU耐藥性的發(fā)生成為其臨床使用中的一大威脅，因此克服其耐藥成為關(guān)鍵性問題。壞死性凋亡(necroptosis)是近年來被發(fā)現(xiàn)的一種非caspases依賴的程序性死亡方式，即在caspases被抑制的情況下，死亡受體與配體相結(jié)合，調(diào)控相關(guān)蛋白的表達觸發(fā)壞死性凋亡[9]。壞死性凋亡的誘導(dǎo)與抑制不僅參與機體的生理調(diào)節(jié)過程，在腦缺血、心肌缺血、急性和慢性神經(jīng)退行性疾病、腫瘤等多種人類疾病中也具有重要作用。它是一個主動的、信號依賴的過程，可以被許多因素所誘導(dǎo)，如TOLL樣受體激動劑、FAS配體的產(chǎn)物、c-IAP1/2拮抗劑等。有研究表明，壞死性凋亡的誘導(dǎo)劑可激活細胞死亡而無需“觸動”已揭示的最“難以捉摸”并高度可控的腫瘤耐藥機制[10,11]。因此，引發(fā)癌細胞發(fā)生壞死性凋亡的方法是治療癌癥的有效手段之一。在caspases被抑制情況下，5-FU可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞通過RIP1和NF-kB通路發(fā)生壞死性凋亡[12]；Smac可以誘導(dǎo)肺癌細胞發(fā)生壞死性凋亡[13]。本實驗中，透射電鏡結(jié)果表明，單獨使用5-FU時MDA-MB-231細胞發(fā)生凋亡，而加入pan-caspases抑制劑z-VAD-fmk時，MDA-MB-231則發(fā)生壞死性凋亡。

細胞凋亡是受死亡信號調(diào)節(jié)并伴隨天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶caspases活化的一種細胞主動自殺的死亡方式，凋亡是由多基因嚴(yán)格調(diào)控的過程[14]。有研究報道，Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡過程中具有重要的控制作用，其蛋白成員之間的協(xié)同作用共同決定細胞是否進入凋亡程序[15,16]。本課題設(shè)置不同劑量的5-FU處理MDA-MB-231細胞，MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著藥物劑量的增大，5-FU對MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用明顯增強，細胞凋亡率明顯升高。

與其他三組比較，*P≤0.05圖6 單用5-FU和z-VAD-fmk及兩者合用對RIP1蛋白表達的影響Figure 6 Effects of 5-FU, z-VAD-fmk and their combination on protein expression of RIP1

壞死性凋亡定義為:一種與壞死具有相似的形態(tài)學(xué)特征(細胞體積及胞內(nèi)細胞器腫脹，包膜完整性破壞，內(nèi)容物外泄)，且為非caspases依賴性的程序性細胞死亡，即在caspases抑制的條件下，死亡受體與配體的結(jié)合可觸發(fā)壞死性凋亡。壞死性凋亡的調(diào)節(jié)涉及一系列分子的表達與活化，RIP在此過程中發(fā)揮了重要的作用[17]，研究報道，caspases-8與RIP蛋白的交互表達可引起壞死性凋亡與凋亡的相互轉(zhuǎn)化[18]。本實驗中，使用pan-caspases抑制劑z-VAD-fmk聯(lián)用后，5-FU誘導(dǎo)細胞死亡率明顯增加。通過Western blot檢測壞死性凋亡關(guān)鍵蛋白RIP1的表達，發(fā)現(xiàn)與z-VAD-fmk聯(lián)用時，RIP1明顯被激活，觸發(fā)壞死性凋亡。

綜上所述，5-FU誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細胞發(fā)生凋亡，但在caspases被抑制的情況下，5-FU通過激活RIP1誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞發(fā)生了壞死性凋亡。本研究不僅加深了對細胞死亡方式的理解與認(rèn)識，也為5-FU在腫瘤治療及其多藥耐藥克服的研究、壞死性凋亡誘導(dǎo)劑在臨床中的研究提供一定的實驗基礎(chǔ)，具體機制有待進一步考察。

[1] Chen,W,Zheng R,Baade PD,etal.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

[2] Silverstein RA,González de Valdivia E,Visa N.The incorporation of 5-fluorouracil into RNA affects the ribonucleolytic activity of the exosome subunit Rrp6[J].Mol Cancer Res,2011,9(3):332-340.

[3] Okamura M,Shimada J,Sakagami H.Comparative analysis of cell death induction by cisplatin and 5-FU in human oral squamous and hepatocellular carcinoma cell lines[J].Anticancer Res,2008,28(1A):253-259.

[4] Chibber S,Farhan M,Hassan I,etal.White light-mediated Cu(Ⅱ)-5FU interaction augments the chemotherapeutic potential of 5-FU:an in vitro study[J].Tumour Biol,2011,32(5):881-892.

[5] Zhou,W,Yuan J.Necroptosis in health and diseases[J].Semin Cell Dev Biol,2014,35:14-23.

[6] Fulda S.Therapeutic exploitation of necroptosis for cancer therapy[J].Semin Cell Dev Biol,2014,35:51-56.

[7] Lee,JJ,Beumer JH,Chu E.Therapeutic drug monitoring of 5-fluorouracil[J].Cancer Chemother Pharmacol,2016,20:1-18.

[8] 林宇,蘇富琴,陳詠梅.5-氟尿嘧啶臨床應(yīng)用進展[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報,1999,20(3):294-295.

[9] Vandenabeele P,Galluzzi L,Vanden Berghe T,etal.Molecular mechanisms of necroptosis:an ordered cellular explosion[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2010,11(10):700-714.

[10] Han W,Li L,Qiu S,etal.Shikonin circumvents cancer drug resistance by induction of a necroptotic death[J].Mol Cancer Ther,2007,6(5):1641-1649.[11] Xuan,Y,Hu X.Naturally-occurring shikonin analogues-a class of necroptotic inducers that circumvent cancer drug resistance[J].Cancer Lett,2009,274(2):233-242.

[12] Oliver Metzig M,Fuchs D,Tagscherer KE,etal.Inhibition of caspases primes colon cancer cells for 5-fluorouracil-induced TNF-alpha-dependent necroptosis driven by RIP1 kinase and NF-kappaB[J].Oncogene,2016,35(26):3399-3409.

[13] Hannes S,Abhari BA,Fulda S.Smac mimetic triggers necroptosis in pancreatic carcinoma cells when caspase activation is blocked[J].Cancer Lett,2016,380(1):31-38.

[14] Gillies LA,Kuwana T.Apoptosis regulation at the mitochondrial outer membrane[J].J Cell Biochem,2014,115(4):632-640.

[15] Gross A.BCL-2 family proteins as regulators of mitochondria metabolism[J].Biochim Biophys Acta,2016,1857(8):1243-1246.

[16] Tomek M,Akiyama T,Dass CR.Role of Bcl-2 in tumour cell survival and implications for pharmacotherapy[J].J Pharm Pharmacol,2012,64(12):1695-1702.

[17] Degterev A,Zhou W,Maki JL,etal.Assays for necroptosis and activity of RIP kinases[J].Methods Enzymol,2014,545:1-33.

[18] Nogusa S,Thapa RJ,Dillon CP,etal.RIPK3 activates parallel pathways of MLKL-driven necroptosis and FADD-mediated apoptosis to protect against influenza A virus[J].Cell Host Microbe, 2016, 20(1):13-24.

5-FU induces necroptosis in breast cancer cells after the inhibition of caspases

ZHANG Zhirui, SUN Xiaojin, CHONG Dianlong, ZHOU Can, REN Kai, LIU Hao*

(FacultyofPharmacy,BengbuMedicalCollege,AnhuiEngineeringTechnologyResearchCenterofBiochemicalPharmaceuticals,Bengbu233030,China;*Correspondingauthor,E-mail:liuhao6886@foxmail.com)

ObjectiveTo explore the inhibitive effect of 5-fluorouracil(5-FU) on the proliferation of human breast cancer MDA-MB-231 cells and analyze the form of cell death in the condition of caspase inhibition.MethodsMTT assay was used to detect the viability of breast cancer MDA-MB-231 cells after exposed to different concentrations(0,4,8,16,24,32 μmol/L) of 5-FU for screening the appropriate concentration of 5-FU. Then the experiment was divided into four groups:control group, z-VAD-fmk group, 5-FU group, 5-FU+z-VAD-fmk group. The viability of breast cancer was evaluated by MTT assay, the cell death rate was assessed using flow cytometry with PI staining, DAPI staining was performed to demonstrate the cell nucleus changes, the form of cell death was observed under transmission electron microscopy, and Western blot was used to detect the expression of necroptosis-related protein RIP1.ResultsThe appropriate concentration of 5-FU in MDA-MB-231 cells was 8 μmol/L, and the cell survival rates were(68.94±1.17)%, (48.76±1.47)% and (44.15±2.41)% after exposed to 8 μmol/L 5-FU for 24,48,72 h.MTT,PI,DAPI results showed that compared to control group and 5-FU group,the cell survival was significantly decreased in 5-FU+z-VAD-fmk group(P<0.05),and the hyperchromatic nuclei was gradually darkened and karyopyknosis was observed.The electron microscope results indicated that apoptosis occurred in 5-FU group,and the necroptosis happened in 5-FU+z-VAD-fmk group. RIP1 protein was up-regulated clearly after the combined treatment with 5-Fu and z-VAD-fmk.Conclusion5-FU can induce the apoptosis in MDA-MB-231 cells, and it can induce the necroptosis by activating RIP1 when caspases activation is blocked by z-VAD-fmk.

breast cancer; 5-fluorouracil; z-VAD-fmk; apoptosis; caspases; necroptosis

國家自然科學(xué)基金資助項目(81372899)；安徽省高等學(xué)校省級自然科學(xué)研究項目重大項目(KJ2016SD39)

張智瑞，女，1992-04生，碩士，E-mail：824039564@qq.com

2016-07-05

R737.9

A

1007-6611(2016)09-0808-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.09.006