張前榮，溫慶放，李大忠，劉建汀，李永平,代春蘭，薛珠政，康建坂，王　彬，朱海生 *

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，福建　福州　350013；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心，福建　福州　350013； 3.福建省蔬菜工程技術(shù)研究中心，福建　福州　350013)

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福建省番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定分析

張前榮1,2,3，溫慶放1,2,3，李大忠1,2,3，劉建汀1,2,3，李永平1,2,3,代春蘭1，薛珠政1,2,3，康建坂1,2,3，王彬1,2,3，朱海生1,2,3*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，福建福州350013；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心，福建福州350013； 3.福建省蔬菜工程技術(shù)研究中心，福建福州350013)

為了對(duì)福建省發(fā)生的番茄黃化曲葉病毒病的病原進(jìn)行分子鑒定，并對(duì)其病原分子的變異和進(jìn)化情況進(jìn)行分析。根據(jù)已知的番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)基因組序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)獲得的特異性片段回收、克隆并測(cè)序，結(jié)果表明，PCR分子標(biāo)記反應(yīng)擴(kuò)增到541 bp的特異性條帶，將該特異性產(chǎn)物經(jīng)回收和純化并進(jìn)行克隆與測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)后，表明該分離物的序列與國(guó)內(nèi)外的病毒序列相似度為97%～99%。試驗(yàn)結(jié)果表明福建省的5個(gè)地市的番茄均已被番茄黃化曲葉病毒病危害，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)防治。

番茄；番茄黃化曲葉病毒；鑒定

番茄黃化曲葉病毒病(tomato yellow leaf curl virus disease, TYLCD)，系由雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬的番茄黃化曲葉病毒引起的，依靠煙粉虱持續(xù)傳播，因此該病毒又稱(chēng)為粉虱傳雙生病毒[1-3]。該病毒的核酸主要由DNA-A和DNA-B組成，其大小約為2.5～3.0 kb，少數(shù)病毒為單組份[4]，不僅侵害番茄，還能夠寄宿在辣椒、馬鈴薯、棉花、木薯等農(nóng)作物[5]。

20世紀(jì)30年代末，番茄黃化曲葉病毒病首次在約旦-以色列一帶被發(fā)現(xiàn)。1964年，才被正式命名為番茄黃化曲葉病毒病(TYLCD)[6]。該病毒病是一種毀滅性的病害，已在約旦、以色列、日本、美國(guó)、澳大利亞等國(guó)家地區(qū)均有大面積的發(fā)生，已造成嚴(yán)重?fù)p失[7-10]。1995年該病傳入我國(guó)[11]，該病已在我國(guó)的浙江、上海、山東、河南、重慶、廣西、廣東、云南等多個(gè)省市自治區(qū)發(fā)生[12-16]。

福建省龍巖市、莆田市、福州市等地市均有大面積的番茄栽培，因此開(kāi)展番茄黃化曲葉病毒發(fā)生情況調(diào)查分析研究，并提出防治方法具有重要的意義。分子標(biāo)記技術(shù)能夠快速準(zhǔn)確鑒定出該病毒，在植物樣品檢疫鑒定起到重要的作用。本研究利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定分析福建省的采集的番茄病株樣品，并對(duì)特異性分離物進(jìn)行純化、克隆、測(cè)序、比對(duì)、分析該分離物與世界各地分離物的同源性，確定病毒類(lèi)型，并提出防治該病毒的方法。

1　材料和方法

1.1病毒樣品采集

2015年在福建省的福州、莆田、廈門(mén)、漳州、龍巖地市等5個(gè)地區(qū)采集番茄黃化曲葉病毒病病樣。

1.2病毒DNA提取及PCR檢測(cè)

病毒DNA的提取方法采用經(jīng)典CTAB法[17]。引物設(shè)計(jì)參考謝艷等[5]的簡(jiǎn)并引物：CTYPA:TAATATTACC(G或T)G(A或T)(G或T)G(A，C或G)CC(C或G)C；JCTYPB:TGGAC(C或T)TT(A或G)CA(A或T)GG(C,T或G)CCTTCACA。

25 μL反應(yīng)體系：番茄葉片總DNA 2 μL(100 ng)；Mix 12.5 μL；ddH2O 9.5 μL；PA 0.5 μL，PB 0.5 μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃變性5 min ；94℃變性30 s， 55℃復(fù)性45 s， 72℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

1.3克隆和測(cè)序分析

利用回收試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中約540 bp的特異性條帶進(jìn)行回收、純化、克隆到載體pMD18-T(TaKaRa公司)，取陽(yáng)性菌落，經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果登錄NCBI 網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)的BLAST進(jìn)行比對(duì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1番茄黃化曲葉病毒的田間調(diào)查癥狀

從福建省內(nèi)各地采集的番茄植株病樣，其田間表現(xiàn)為植株生長(zhǎng)緩慢甚至停滯，節(jié)間變短，嚴(yán)重矮化，上部新葉新芽增厚且變小、葉質(zhì)變硬和脆、葉片退綠變黃，葉片邊緣至葉脈區(qū)域發(fā)黃、具有凹凸不平的皺褶或變形，后期褶皺簇狀葉片緣向上卷曲；新葉有黃綠不均，葉片嚴(yán)重變形且焦枯，番茄果實(shí)畸形、變小，或不能正常開(kāi)花結(jié)果，坐果困難，果實(shí)僵化不膨大，或膨大速度極慢著色不均勻，不能正常轉(zhuǎn)色，成熟慢，結(jié)果數(shù)減少，商品價(jià)值減低，產(chǎn)量大幅下降。其田間表現(xiàn)性狀與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的番茄黃化曲葉病毒病性狀相似度很高。

2.2番茄黃化曲葉病毒的特異性片段分析

以感病葉片的病毒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以健康的番茄植株葉片為對(duì)照，病樣通過(guò)擴(kuò)增獲得大小約為540 bp左右的特異性條帶(圖1)，而健康植株未出現(xiàn)特異性條帶。對(duì)特異性條帶進(jìn)行回收、純化、克隆到載體pMD18-T及測(cè)序。通過(guò)測(cè)序得到541 bp的片段序列，其序列見(jiàn)圖2。同時(shí)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，確認(rèn)其為番茄黃化曲葉病毒的AV1的相關(guān)基因。

2.3福建地區(qū)分離物與國(guó)內(nèi)外分離物分析

從福建省內(nèi)采集的病毒病樣的分離物的部分序列與已在GenBank登錄的國(guó)內(nèi)山東、浙江、上海、北京、新疆、遼寧等省市的分離物序列相似性最高，均為99%，與美國(guó)夏威夷、墨西哥、以色列韓國(guó)濟(jì)州島、日本沖繩等國(guó)家地區(qū)的相似度為99%。與江蘇、山西、河北、河南、約旦的病毒相似度為98%，而與墨西哥危害馬鈴薯的番茄黃化曲葉病的相似度為97%(表1)。

3　討論與結(jié)論

TYLCVD是一種世界滅頂性災(zāi)害，是亞熱帶和熱帶番茄的重要病害之一，分布極為廣泛，嚴(yán)重威脅了番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[18]。TYLCV的傳播介體為煙粉虱，寄主廣泛，近年來(lái)全球氣候變暖，煙粉虱的適應(yīng)力不斷增強(qiáng)使其大量繁殖傳播，加快了TYLCV的傳播，使得TYLCVD對(duì)番茄的為害越來(lái)越嚴(yán)重[19]。分子標(biāo)記是一種快速準(zhǔn)確檢測(cè)鑒定番茄黃化曲葉病毒病的方法，本研究對(duì)福建省的5個(gè)地市的番茄病毒進(jìn)行PCR檢測(cè)，均擴(kuò)增檢測(cè)到番茄黃化曲葉病毒，再次驗(yàn)證了分子標(biāo)記技術(shù)能夠運(yùn)用于病毒診斷鑒定。

番茄黃化曲葉病毒病的 DNA-A 全長(zhǎng)約為2.8 k個(gè)核苷酸，共編碼 6 個(gè)開(kāi)放閱讀框架(ORF)，分別是AV1(CP)(308～1 084 nt)編碼外殼蛋白，AV2(148～498 nt)以及位于互補(bǔ)鏈的AC1(Rep)(1 542～2 615 nt)編碼病毒復(fù)制所必需的復(fù)制相關(guān)蛋白，AC2(Ren)(1 226～1 633 nt)編碼復(fù)制增強(qiáng)蛋白，AC3 (TrAP)(1 081～1 485 nt)編碼控制晚期基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活蛋白和 AC1 內(nèi)還編碼一個(gè)AC4 蛋白(2 171～2 464 nt)[20-22]。從福建省番茄黃化曲葉病毒分離的分離物的大小為541 bp，經(jīng)比對(duì)確定該分離是編碼病毒外殼蛋白的AV1基因的序列，為克隆分析福建省番茄黃化曲葉病毒DNA-A全長(zhǎng)奠定了基礎(chǔ)。

根據(jù)國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)的規(guī)定，雙生病毒科的基因組核苷酸序列相似度不小于89%為同一種病毒的不同株系或分離物[23]。番茄黃化曲葉病毒是一種單鏈環(huán)狀DNA病毒，存在基因重組變異現(xiàn)象，雖然各地報(bào)道病毒名相同，其序列可能相差較大，而與同屬病毒的相似度很低[20,24]。據(jù)全國(guó)各地研究人員報(bào)道我國(guó)的番茄黃化曲葉病毒分離物的核苷酸序列相似度較高，與世界其他國(guó)家地區(qū)的相似相對(duì)較低，而與同屬菜豆金色花葉病毒屬的其他病毒相似度低89%。據(jù)田守波[22]報(bào)道山東莘縣的番茄黃化曲葉病毒分離物(TYLCV-IL)與上海、河北等地區(qū)的同源性為98.2%～98.8%，與歐洲地區(qū)的同源性達(dá)到91.0%，而與其他菜豆金色花葉病毒屬病毒同源性為 66.1%～70.1%。劉玉樂(lè)等[25]在分離到廣西番茄黃化曲葉病毒(TYLCV-CHI)，與TYLCV-ISR(以色列分離物)、TYLCV-THA(泰國(guó)分離物)、TYLCV-SAR(撒丁分離物)、TYLCV-SI(意大利西西里分離物)的共同區(qū) DNA 序列相比對(duì)，其同源性?xún)H為 53.2%～57.7%，而AV1 基因編碼的氨基酸序列同源性?xún)H為 72.7%～77.9%。本研究從福建省的5個(gè)地市采集的番茄植株樣品，都檢測(cè)到番茄黃化曲葉病毒，該分離物的部分序列與從墨西哥錫那羅亞危害馬鈴薯的番茄黃化曲葉病毒TYLCV-REP(C1)(登錄號(hào)EU224315.1)的相似度最低，僅為97%，與國(guó)內(nèi)其他省份的番茄曲葉病毒分離的相似度為98%～99%。福建省的番茄黃化曲葉病毒病與已報(bào)道的分離物相似度較高。由此可知番茄黃化曲葉病毒已在福建省的5個(gè)地市番茄生產(chǎn)區(qū)發(fā)生危害。

該病是一種檢疫性病害，因此在生產(chǎn)要注意防止該病害的發(fā)生。①選擇抗番茄黃化曲葉病毒品種。培育和選擇抗黃化曲葉病毒且適合福建地區(qū)栽培的番茄品種是最有效科學(xué)的防治方法。已報(bào)道的抗番茄黃化曲葉病毒基因有5個(gè)，Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4及Ty-5[26-29]。育種學(xué)家們通過(guò)傳統(tǒng)育種方法結(jié)合分子輔助育種方法選育出了一系列的番茄抗病品種。目前在福建省推廣的適合福建地區(qū)栽培且抗TY病毒的品種有倍盈(先正達(dá))、鐵球3號(hào)(萬(wàn)農(nóng)高科)、中廈A318 (中廈種籽)等。②培育健壯無(wú)病蟲(chóng)幼苗。于力等[30]研究結(jié)果表明番茄黃化曲葉病毒會(huì)通過(guò)嫁接的方式傳播。福建省的番茄苗多為嫁接苗，因此在嫁接應(yīng)當(dāng)選擇健康無(wú)病的接穗和砧木，注意嫁接刀的消毒。③加強(qiáng)田間管理。要注意整枝打杈等農(nóng)事操作不可使用剪刀等工具，應(yīng)當(dāng)徒手進(jìn)行，以避免人為傳染病毒。如發(fā)現(xiàn)個(gè)別病株或疑似病株, 務(wù)必及時(shí)拔除深埋或焚燒，及時(shí)清除殘枝落葉以減少蟲(chóng)源和毒源。該病毒主要是依靠煙粉虱持續(xù)傳毒的，由此防治煙粉虱的傳播是防治該病毒病的重中之重?；瘜W(xué)防治：藥劑可選用啶蟲(chóng)脒、撲虱靈或阿維菌素+噻嗪酮等。物理方法：黃板等。

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(責(zé)任編輯：林海清)

Identification of Yellow Leaf Curl Virus on Tomato Plants in Fujian

ZHANG Qian-rong1,2,3, WEN Qing-fang1,2,3,LI Da-zhong1,2,3，LIU Jian-ting1,2,3，LI Yong-ping1,2,3,DAI Chun-lan1,2,3,XUE Zhu-zheng1,2,3,KANG Jian-ban1,2,3,WANG Bin1,2,3,ZHU Hai-sheng1,2,3*

(1.CropsResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013,China;2.VegetableResearchCenter,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013，China;3.FujianEngineeringResearchCenterforVegetables,Fuzhou,Fujian350013,China)

Molecular identification,variation, and phylogeneticity of the yellow leaf curl virus (TYLCV) on tomato plants in Fujian were investigated. For the study, specific primers were designed according to the known genome sequence of TYLCV for PCR detection. Then, the generated specific segments were collected, cloned and sequenced. A 541 bp fragment was obtained and its nucleotide sequence showed a high homogeneity, i.e., 97%-99%, with that of the tomato yellow curl leaf virus isolated from the domestic as well as international origins. It confirmed the presence of TYLCV infection on tomato plants in 5 cities in the province, and disease prevention and control measure should soon be implemented.

tomato;yellow leaf curl virus; identification

張前榮，溫慶放，李大忠，等.福建省番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定分析[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，31(6)：611-615.

ZHANG Q-R，WEN Q-F，LI D-Z，et al.Identification of Yellow Leaf Curl Virus on Tomato Plants in Fujian[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(6)：611-615.

2016-01-07初稿；2016-04-28修改稿

張前榮(1987-)，男，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事蔬菜栽培與育種研究(E-mail：zhqrong@163.com)

朱海生(1978-)，博士，副研究員，主要從事園藝植物生理生化與分子生物學(xué)研究(E-mail:zhs0246@163.com)

福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目——省屬公益類(lèi)科研院所基本科研專(zhuān)項(xiàng)(2014R1026-8)；國(guó)家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)體系項(xiàng)目(CARS-25-G-20);福建省科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2013NZ0002-3)

S 436

A

1008-0384(2016)06-611-05